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利用GCaMP6f蛋白对小鼠伏隔核神经元活动的钙离子成像
目的 在小鼠伏隔核表达GCaMP6f蛋白,并在束缚状态下,应用钙成像技术实时监测小鼠伏隔核内活化的神经元.方法 首先,包装并纯化aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato病毒,并通过感染原代神经元验证目的蛋白的表达和功能.然后,通过脑立体定位技术注射aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato病毒于小鼠伏隔核脑区,动物恢复21 d后,插入光纤,在其清醒状态下,给予束缚刺激,用钙成像技术实时记录伏隔核神经元的活化.结果 表达GCaMP6f的原代神经元在给予谷氨酸刺激后,神经元被活化,Ca2内流而产生绿色荧光;通过在体实验,给予小鼠束缚刺激,可在视野内检测到因伏隔核神经元活化而发出的绿色荧光信号;鼠脑切片同样可检测到位于胞质的绿色荧光信号与位于细胞核的病毒红色荧光标记共定位于相同细胞.结论 aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato腺相关病毒可成功用于在体活化神经元的实时监测.通过在小鼠伏隔核定点注射该病毒,给予束缚刺激,应用钙成像技术可实时记录到小鼠伏隔核的活化神经元.
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外周伤害性感受神经元在体特异性表达GCaMP6f蛋白方法的构建及细胞内钙活动的监测
目的:建立在外周伤害性感受器特异性表达GCaMP6f蛋白的方法,并在疼痛刺激条件下,应用钙成像技术实时监测小鼠伤害性感受神经元的细胞内钙活动.方法:包装并纯化rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒,并通过立体定位注射该病毒于SNS-Cre小鼠L4/L5背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)内.动物存活3～4周,然后制备L4/L5整节DRG标本,检测GCaMP6f蛋白表达情况,并观察疼痛刺激条件下诱致的伤害性DRG神经元的钙反应情况.结果:SNS-Cre小鼠L4/L5 DRG内注射rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒后,荧光显微镜观察显示GCamp6f病毒特异性地表达在中、小型的DRG神经元.给予DRG神经元高钾刺激(KCl 30 mmol/L)可以诱致神经元胞内的钙离子水平显著上升.进一步给予伤害性DRG神经元特异性标志物TRPV1受体的激动剂Capsaicin(1 μmol/L),结果显示其可以诱致GCamp6f蛋白标记的DRG神经元呈现显著的钙反应.结论:本研究建立的SNS-Cre小鼠DRG在体注射rAAV2/9-CAG-DIO-GCamp6f病毒特异性标记伤害性DRG神经元的方法是成功的,该方法的成功建立对于活体特异性监测伤害性DRG神经元的功能活动提供了重要工具.
