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碱性成纤维细胞生长因子对兔晶体上皮细胞的增殖作用
观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells,RLECs)的促增殖作用,以及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达.用第2～3代培养细胞,用MTT法测定细胞增殖,用免疫组织化学法观察PCNA的表达,流式细胞仪观察细胞周期的变化.结果显示bFGF可促进兔晶体上皮细胞的增殖,尤其是浓度为10μg/L作用明显;正常细胞组PCNA表达呈阴性,添加bFGF组PCNA表达呈强阳性;并显示进入S期的细胞明显增加.提示bFGF是促进兔晶体上皮细胞增殖的重要因素.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 兔晶体上皮细胞 增殖 增殖细胞核抗原 -
三氧化二砷对兔晶体上皮细胞增殖的影响及其机制的实验研究
目的:观察不同浓度的三氧化二砷作用不同时间对兔晶体上皮细胞影响及其作用机理.方法:应用不同浓度的三氧化二砷作用于兔晶体上皮细胞后,观察三氧化二砷对兔晶体上皮细胞生长状态的影响;用噻唑蓝(MTT)比色法、透射电镜技术观察其对兔晶体上皮细胞增殖的影响;应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)及流式细胞技术检测三氧化二砷对兔晶体上皮细胞凋亡的诱导作用.结果:不同浓度的三氧化二砷作用于兔晶体上皮细胞有明显的时间和剂量依赖性.三氧化二砷作用后细胞生长明显受抑制,并出现明显的凋亡特征性改变;8μmol/L三氧化二砷作用24小时、48小时及72小时后TUNEL法可检测到细胞凋亡水平显著性升高,流式细胞仪分析显示,兔晶体上皮细胞在G1峰前出现明显的凋亡峰.结论:三氧化二砷可明显抑制兔晶体上皮细胞的生长,其机理主要是诱导兔晶体上皮细胞凋亡.
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过氧化氢对体外培养的兔晶体上皮细胞凋亡的诱导
目的:研究H2O2诱导兔晶体上皮细胞凋亡.方法:采用终浓度250μmol/L H2O2处理兔晶体上皮细胞,分别用TUNEL法、流式细胞仪和透射电镜检测H2O2处理后的兔晶体上皮细胞.结果:用H2O2处理后的兔晶体上皮细胞,TUNEL法可见胞核呈棕褐色着染,苏木素不能复染;流式细胞仪检测到约9.6×105细胞出现亚二倍体峰,二倍体峰几近消失;透射电镜下细胞膜完整,但表面微绒毛消失,细胞质浓缩,胞浆内细胞器结构不清晰,并见大量大小不等的空泡,核质比例增大,胞核呈圆形,核膜双层结构不清,呈光滑状,核内染色质聚集成块,部分染色质边集.结论:终浓度250μmol/L H2O2可以诱导兔晶体上皮细胞发生凋亡.
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碱性成纤维细胞生长因子对兔晶体上皮细胞增殖作用的免疫组织化学研究
目的:晶体后囊混浊(后发性白内障)是白内障术后影响视力的主要远期并发症.残留的晶体上皮细胞的增殖、并移行至后囊下和向成纤维细胞的转化是后囊混浊的基本病理过程.
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羟基喜树碱对兔晶体上皮细胞的抑制作用
目的:为研究羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine,HCPT)对体外培养的兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长的影响,探索预防后发性白内障的药物.方法:2～3月龄健康家兔20只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;96孔酶标板;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2～3代的对数生长期RLECs于96孔板中,置入CO2孵箱中培养24 h后,将不同浓度的HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的抑制作用;(2)将传代的RLECs接种于96孔板中,立即加入HCPT(浓度为小于半效抑制量的1/10,因该浓度对细胞无杀伤作用)24 h后取出,加入MTT在酶标仪上比色;(3)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的HCPT,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(4)将浓度为1.34 μg/mL的HCPT作用于2～3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,离心弃上清液,戊二醛固定,电镜观察超微结构的变化(另设未加药组为对照).结果:HCPT能有效抑制体外培养的RLECs的增殖.24 h的半效抑制量(ID50)为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.340 μg/mL;且HCPT对RLECs贴壁有影响,使部分RLECs不能贴壁.光镜下可见HCPT主要引起细胞核固缩、碎裂等病理变化,其胞浆的改变表现为空泡及深染的粗颗粒.电镜下见经HCPT处理的RLECs线粒体肿胀,可见典型的凋亡细胞及凋落小体的形成.结论:HCPT是一种新型的抗癌药,其作用靶是拓朴异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ).其低剂量、长时间作用于RLECs,抑制效果明显,该药不仅抑制细胞增殖,还影响细胞贴壁.因此是一种有潜力的预防后发性白内障的侯选药物.
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紫杉醇、羟基喜树碱对晶体上皮细胞生长周期的影响
目的:研究紫杉醇(Taxol)和羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine, HCTP)对兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长周期的影响.观察Taxol和HCPT对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2～3月龄家兔30只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;离心机;流式细胞仪.(1)取2～3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放入CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol和HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将消化的第2代RLECs计数成一定浓度的细胞悬液加入3组培养瓶中,一组为不加药的正常对照组,其余两组为分别加入一定浓度的Taxol和HCPT的实验组,作用48 h,用0.25%胰蛋白酶消化、PBS洗涤、立即进行流式细胞仪分析.结果:本研究发现Taxol和HCPT对体外培养的兔晶体上皮细胞均有抑制作用,Taxol 24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.HCPT 24 h的ID50为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.34 μg/mL.流式细胞仪分析表明Taxol将RLECs的细胞周期阻断于G2/M期,并在G2/M期阻断前还有短时的G0/G1期阻断.HCPT将细胞周期阻断于S期.结论:Taxol和HCPT增多属细胞周期特性药.Taxol为新型抗微管药物,其作用目标为细胞骨架的微管系统,抑制微管解聚.本实验证实Taxol使RLECs周期阻断于G2/M期,至于在G2M期阻断前还有短时的G0/G1期阻断,其机制值得进一步研究.羟基喜树碱靶向高度选择性抑制拓扑异构酶(Topo Ⅰ),主要作用于RLECs的S期.
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顺铂、米托蒽琨及阿糖胞苷对兔晶体上皮细胞的作用
目的:白内障囊外摘除术后晶体后囊的混浊(后发性白内障)是影响视功能的主要并发症之一.业已证明残留的晶体上皮细胞增殖是形成后囊的混浊的主要原因.对预防后囊混浊,目前尚无能应用于临床的有效抑制晶体上皮细胞增殖的方法.本文研究顺铂(cis-Platin,PDD),米托蒽琨(Mitoxantrone, Mit)和阿糖胞苷(Cytosine Arabinoside, Ara-C)对兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLEC)增殖的抑制作用.方法:分离晶体囊膜行组织细胞培养,在37℃饱和湿度含7%CO2培养箱中培养24 h后取出,加入不同浓度的PDD、Mit和Ara-C,其终浓度PDD为2.5、5、10、20及40μg/mL,Mit为0.5、1、2、4及8μg/mL和Ara-C为25、50、100、200及400μg/mL,再分别培养24 h和72 h后,加入20μL 5 mg/mL MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)试剂,培养4 h,加入200μL二甲基亚砜溶液,室温下微量振荡器振荡5 min,自动酶标读数仪比色(波长600 nm).电镜观察细胞超微结构的变化,流式细胞仪观察细胞周期的变化.结果:PDD和Mit作用于传代培养RLEC 24 h IC50分别为38.92μg/ml、8.92μg/mL;72 h的IC50分别为6.71μg/mL、2.04μg/mL.正常细胞电镜照片显示,细胞表面有微绒毛,细胞器丰富,核形态不很规则,常染色质多,异染色质少,细胞生长活跃.药物作用后可见明显的细胞凋亡.流式细胞仪检查可见明显的细胞周期的变化,G0-G1期由正常的57.78%升至73.26%(Mit)和77.53%(PDD),S期由正常的30.44%降至14.68%(Mit)和10.41%(PDD),细胞活跃程度明显降低.而Ara-C对兔晶体上皮细胞无明显抑制作用.结论:顺铂、米托蒽醌均为剂量依赖型和时间依赖型药物,可有效抑制兔晶体上皮细胞的生长,而阿糖胞苷对兔晶体上皮细胞增殖无明显抑制作用.
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紫杉醇诱导兔晶体上皮细胞凋亡的实验研究
目的:从诱导兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)凋亡的角度观察紫杉醇(Taxol)对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2～3月龄家兔40只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;TUNEL试剂;24孔酶标板;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2～3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放进CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将传代RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(3)将一定浓度的Taxol作用于2～3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,戊二醛固定,行超微结构观察(同时设未加药标本为正常对照).(4)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h,固定后行TUNEL染色并在光镜下观察(另将未加药标本为阴性对照.).结果:本研究发现Taxol对体外培养的RLECs有抑制作用,其24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.光镜下,正常对照的RLECs呈多边形上皮样,胞浆丰富、粉红色、胞核呈紫蓝色.部分用药组细胞体积缩小、呈圆形、包浆浓染,可见染色质边集、胞核固缩、碎裂等多种形态改变.电镜下观察用药组细胞见典型的凋亡细胞及凋亡小体的形成.TUNEL染色见部分用药组细胞胞核呈深棕黄色,提示细胞凋亡.结论:本研究通过光镜、电镜以及免疫组化等多方面的证实:Taxol主要是通过诱发细胞凋亡的机制而抑制RLECs生长的.
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顺铂、米托蒽醌及阿糖胞苷对兔晶体上皮细胞的作用
目的：研究顺铂(Cisplatin，PDD)，米托蒽醌(Mitoxantrone，Mit)，阿糖胞苷(Cytosine Arabinoside，Ara-C)对兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells,RLECs)增殖的抑制作用。方法：分离兔晶体囊膜行组织细胞培养，传代的2～3代RLECs在96孔板培养24h，然后用不同浓度的PDD、Mit及Ara-c作用细胞24h及72h，用MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)比色法进行测定。电镜观察细胞超微结构，流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果：PDD及Mit作用于传代培养RLECs 24h IC50分别为38.92 μg/ml、8.92 μg/ml；72h的IC50分别为6.7lμg/ml、2.04μg/Ml。结论：PDD及Mit均为剂量依赖型和时间依赖型药物，均能有效抑制兔晶体上皮细胞的生长，在此试验条件下Ara-C对兔晶体上皮细胞增殖无明显抑制作用。
