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CD45RO N-糖基化位点对galectin-3结合CD45RO突变体转染细胞的影响
目的 构建CD45RO不同N-糖基化位点突变的T细胞株,并检测其与galectin-3的结合情况.方法 采用N→Q定点突变技术分别去除CD45RO的11个N-糖基化位点,制备单个N-糖基化位点缺失的CD45RO,然后将其导入慢病毒表达载体pWPXL中,11个携带单个N-糖基化位点缺失的CD45RO重组慢病毒质粒与慢病毒包装质粒psPAX2和MD2.G共转染293T细胞,将包装重组慢病毒感染CD45-的J45.01细胞,流式分选后获得11株分别表达CD45RO单个N-糖基化位点缺失的J45.01 T细胞株.通过RT-PCR和流式细胞术分别从RNA水平和蛋白水平验证CD45RO突变体的转录和表达,应用流式细胞术检测CD45RO突变细胞株与galectin-3的结合情况.结果 成功构建了1 1个CD45RO单个N-糖基化位点缺失的T细胞株,各突变细胞株能稳定表达突变基因,经测序再次证实突变位点正确,CD45 RO突变体能稳定表达于细胞表面.galectin-3与N327Q突变细胞的结合明显增强,与N36Q突变细胞和N217Q突变细胞的结合明显减弱.结论 CD45RON-糖基化位点对galectin-3与CD45 RO-J45.01细胞的结合有调节作用.
关键词： 半乳糖凝集素-3 结合 N-糖基化位点 CD45RO Jurkat T细胞 -
乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响
目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响.方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT.构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点).脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响.结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到.adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,高滴度均达到1∶102 400;dG123几乎无抗体反应(＜1∶200).结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响.Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微.Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生.
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人偏肺病毒融合蛋白N-糖基化位点的预测及不同N-糖基化修饰突变体的构建
目的 预测人偏肺病毒(hMPV)融合蛋白N-糖摹化位点,构建N-糖基化修饰突变体.方法 NetNGlyc1.0 Server神经网络软件预测hMPV 4个亚型代表株F蛋白氨基酸序列的N-糖基化位点;根据预测结果针对性地没计突变引物,应用基因工程技术进行定点突变,从而获得特定位点去糖基化的F基因,包括单位点突变体、双位点突变体及三位点突变体;双酶切鉴定、基因序列分析重组质粒,明确N-糖基化修饰突变体构建是否成功.结果 hMPV 4个亚型代表株F蛋白氨基酸序列从N端起第57、172、353位均存在可能性大于50%的N-糖基化位点.构建hMPV F蛋白7个不同的N-糖基化修饰突变体,并通过序列分析测定证实重组突变质粒构建成功.结论 hMPV F蛋白的N-糖基化位点保守,不同亚型的代表株有相同的糖基化位点,利用定点突变技术成功构建了糖基化突变体重组质粒.
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北半球季节性甲型流感疫苗株HA抗原表位的分析
目的 分析近20年北半球甲型流感疫苗株血凝素(Hemagglutinin,HA)抗原的氨基酸和N-糖基化位点变异情况.方法 利用生物信息学软件分析1990-2012年季节性流感疫苗株H1N1的4个抗原决定簇Sa、Sb、Ca、Cb和H3N2的4个抗原决定簇A、B、C、D的氨基酸和N-糖基化位点变异情况.结果 (1) H1N1疫苗株Sb抗原决定簇28、40位氨基酸N-糖基化位点相对保守,而142位氨基酸发生改变. (2) Sb抗原决定簇上无N-糖基化位点. (3)H3N2疫苗株B、D抗原决定簇2、479、181、301位氨基酸N-糖基化位点相对保守,而149位氨基酸发生改变. (4) H3N2疫苗株的N-糖基化位点不在抗原位点上.结论 (1)流感疫苗株HA抗原氨基酸变异集中在HA1蛋白环状部位. (2)流感疫苗株的N-糖基化位点在相对保守的序列,并且相同亚型的流感疫苗株有相似的N-糖基化位点. (3) HA蛋白变异可以推测流感病毒基因的改变,为选择与之匹配的流行株提供参考.
关键词： 抗原表位 N-糖基化位点 季节性甲型流感疫苗株
