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人偏肺病毒疫苗研究进展
人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)是2001年由荷兰学者Van den Hoogen等人[1]发现的一种副粘病毒,是偏肺病毒属中首次发现能感染人类的病毒.感染后引起上呼吸道或下呼吸道感染,可发生在各年龄组,但主要易感人群为小儿、老年人和免疫力低下者[2-3].世界各地已相继报道并证实了人偏肺病毒感染的广泛存在.现代实验技术的发展,促进了对hMPV发病机理和治疗方案的研究.目前针对病毒感染,疫苗仍是有效的预防措施.然而,还没有一种疫苗能够有效预防hMPV感染.本文就hMPV疫苗的研究进展进行综述.
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人偏肺病毒感染动物模型的研究进展
人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)是婴幼儿呼吸道感染的重要病原之一,严重威胁着五岁以下婴幼儿、老年人及免疫功能低下者的健康.但是,目前还没有针对hMPV的有效抗病毒药物和疫苗,所以通过研究其感染发病机制、组织病理变化和免疫机制来筛选有效的抗病毒药物就尤为重要,而各种动物模型的建立不仅可以更好地研究hMPV的感染和免疫机制,而且还可以在hMPV的抗病毒药物和疫苗的研究和评价中发挥重要的作用.
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徐州地区急性呼吸道感染患者中人偏肺病毒的检测
目的 在本实验室建立一种敏感有效的人偏肺病毒(hMPV)的检测方法、了解徐州地区急性呼吸道患者中人偏肺病毒hMPV的感染情况,分析徐州地区hMPV感染人群的流行病学特点及hMPV感染的临床特征,为hMPV的研究提供一些依据.方法 在医院呼吸科门诊就诊的急性呼吸道疾病患者(RTI)中采集咽拭标本,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hMPV的核蛋白N基因,并对扩增产物进行基因序列的测定后将之与GemBank的hMPV的全序列进行比对.结果 2005年1月至2005年3月的75份标本用RT-PCR的方法检测后,确定有12份标本为N基因阳性,检出率为16.0%,扩增产物均经基因序列分析比对.结论 徐州地区的急性呼吸系统疾病中存在hMPV感染,且在徐州地区急性呼吸系统疾病中约有16.0%的患者是由hMPV感染引起,其中6岁以下儿童占50%,这些hMPV感染患者的临床症状主要表现为:高烧、咳嗽.
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人偏肺病毒F1 、F2亚单位原核表达系统的构建及多克隆抗体制备
目的 构建人偏肺病毒融合蛋白亚单位F1、F2原核表达系统,初步获得抗F1、F2重组蛋白的多克隆抗体,为相关疫苗的研究奠定基础.方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增F1、F2基因片段,经T-A克隆确保其准确性,双酶切后插入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),按优化后条件大量诱导表达,纯化后经Western Blot检测特异性.取纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA法检测效价,间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体是否能与人偏肺病毒发生特异性反应.结果 F1、F2基因均正确插入pET32a(+)中,并具有正确的读码框架.0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导培养5h可获得大量带His标签的重组蛋白,纯化后浓度分别达到200 μg/ml和300 μg/ml.Western Blot结果显示,重组蛋白可被抗His标签抗体特异识别;免疫小鼠获得多克隆抗体效价分别为抗pET32a-F1高1:640,抗pET32a-F2高1:40 960.IFA显示抗pET32a-F1、抗pET32a-F2多克隆抗体均可与人偏肺病毒作用产生特异性荧光.结论 成功构建了F1、F2的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得高效表达,该蛋白具有良好的抗原性;免疫小鼠获得特异性多克隆抗体,有利于人偏肺病毒的深入研究.
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徐州市人偏肺病毒感染临床症状与流行病学研究
目前我国对儿童以外人群感染人偏肺病毒(hMPV)少见报道,其感染的临床症状、流行病学特征等均未完全阐明[1].本研究试图了解徐州市因急性呼吸道感染而就诊的一般人群中的hMPV感染情况,初步描述其引起的临床症状及流行病学特征.
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一起人偏肺病毒感染导致的急性呼吸道感染暴发疫情调查
人偏肺病毒(hMPV)多与儿童急性下呼吸道感染有关,较少引起成人呼吸道感染聚集性疫情.2013年3月1日广州市一所职业学校出现大学生感染hMPV导致的成人急性呼吸道感染疫情,现报告如下.1.对象与方法:(1)病例调查:2013年3月1日起广州市一所职业大专学校师生员工中具有以下临床症状之一者定义为疑似病例:①呼吸道症状(咳嗽、咳痰、咽痛、流涕);②全身症状(发热＞37.5℃、头痛、肌肉酸痛).慢性咳嗽、有明确诱因的肌肉酸痛、头痛等症状者经临床医生确认后排除.疑似病例咽拭子经real time PCR方法检测hMPV核酸阳性者为确诊病例.通过查看校医院门诊日志、设计统一调查表逐班调查、建立日报制度以及对病例同宿舍学生进行访谈等方式开展病例搜索.收集患者临床表现、症状出现及消失时间等信息.
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2011-2013年北京市急性呼吸道感染病例人偏肺病毒流行状况分析
为探讨北京地区人偏肺病毒(hMPV)流行规律,本研究在北京市18个区县选择城乡有代表性的区县建立监测哨点,对急性呼吸道感染病例中hMPV感染状况进行连续性监测.1.对象与方法:(1)标本来源:2011年1月至2013年4月选择北京市东城区隆福医院、第六医院、朝阳区垂杨柳医院、丰台区东方医院、通州区潞河医院和顺义区医院作为哨点医院.每家哨点医院每月采集10～20份急性呼吸道感染病例的鼻咽拭子、痰液样本标本,送北京市疾病预防控制中心实验室检测.6家哨点医院3年共采集合格鼻咽拭子、痰液标本1963份.
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苏州地区儿童呼吸道偏肺病毒感染的流行特征
人偏肺病毒(hMPV)是从呼吸道感染的儿童中新发现的一种病毒,本研究探讨苏州地区hMPV感染的流行特征.1对象与方法:选取苏州大学附属儿童医院呼吸科2005年11月至2006年10月间1932例急性呼吸道感染患儿,男1196例(61.9%)、女736例(38.1%).＜6月龄590例、6月龄～1岁399例、1～3岁527例、3～5岁213例、＞5岁203例.
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乌鲁木齐地区儿童人偏肺病毒感染状况初步研究
目的 了解人偏肺病毒(hMPV)在乌鲁木齐地区儿童呼吸道感染患者中的致病情况.方法 选取2006年11月至2007年4月因呼吸道感染于新疆维吾尔自治区人民医院儿科住院患儿和部分门诊患儿的呼吸道分泌物及咽拭子标本共209份.通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测hMPV的M基因片段.并对阳性标本进行测序,用BLAST及DNAStar软件进行分析.结果 共检出2例阳性标本,占总例数1.0%.将2份阳性标本扩增的hMPV M基因片段进行对比,同源性为83.8%.进一步选取GenBank中与本次扩增目的基因相同的hMPV M基因片段做基因进化树分析,结果提示2例标本可能属于不同的2种基因型.结论 hMPV是乌鲁木齐地区儿童呼吸道感染病原之一,在一个流行季节当地可同时有2种不同基因型的hMPV流行.
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上海地区人偏肺病毒致儿童急性下呼吸道感染的分子流行病学研究
目的 建立可靠的TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR方法 ,检测临床样本中人偏肺病毒(hMPV)N基因,以了解2006年10月至2008年2月期间上海地区hMPV致儿童急性下呼吸道感染(ALRTI)的临床与分子流行病学特点.方法 为了明确hMPV在儿童ALRTI中的地位,用直接免疫荧光方法 检测呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒,A、B型流感病毒,1、2和3型副流感病毒7种儿童常见呼吸道病毒抗原,结合肺炎支原体、沙眼衣原体荧光定量PCR检测结果 及细菌学培养结果 进行分析.结果 2006年10月至2008年2月上海地区ALRTI儿童鼻咽分泌物中hMPV的检出率为3.86%(24/622),2006-2007年冬季和2007-2008年冬季检出率分别为6.60%(14/212)和1.11%(2/180);hMPV致儿童ALRTI以＜5岁儿童多见.该期间上海地区hMPV仅见A2亚型株流行.呼吸道病毒是上海地区儿童ALRTI主要病原,在儿童ALRTI中hMPV感染可能仅次于RSV,是常见的呼吸道病毒.结论 hMPV是上海地区儿童ALRTI的重要病原体.
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杭州地区2011-2013年儿童呼吸道感染人偏肺病毒分子流行病学研究
目的 了解杭州地区儿童人偏肺病毒(hMPV)的分子流行病学特点.方法 收集2011年1月至2013年12月杭州市2所哨点医院儿科呼吸道门诊和住院病例2 593例,门诊病例采集咽拭子1 676份,住院病例采集气管吸取物917份.用实时荧光定量PCR方法检测hMPV核酸,阳性样本用RT-PCR方法对hMPV融合蛋白(F)部分基因片段扩增和序列测定.所测基因序列与GenBank代表株核苷酸同源性比较,并构建基因进化树.结果采用描述性统计和样本率的x2检验.结果 杭州地区呼吸道患儿hMPV检出率为6.51％(169/2 593).门诊检出率为6.62％(111/1 676),住院检出率为6.32％(58/917),检出率差异无统计学意义(x2=0.086,P=0.769).2岁和3岁组检出率高,分别为14.14％(28/198)、14.01％(22/158),与其他组比较差异有统计学意义(x2=38.654,P=0.000).冬春季检出高于夏秋季(x2=67.032,P=0.000).测序的88株阳性基因序列与GenBank参考株核苷酸序列同源性为81.6％～ 100.0％,基因进化树分析显示分属于2个基因型的4个亚型.2011-2012年B1亚型占优势,2012年底至2013年A2型为流行.＜1岁组A基因型(67.56％,25/37)与≥1岁组(43.13％,22/51)检出率差异有统计学意义(x2=5.143,P=0.023).结论 杭州地区儿童呼吸道感染hMPV存在4种基因型,＜1岁组A基因型感染较多,2、3岁组hMPV检出率高.
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北京地区2004-2006年婴幼儿急性呼吸道感染中人偏肺病毒感染的研究
目的 了解北京地区急性呼吸道感染婴幼儿中人偏肺病毒(hMPV)的感染情况.方法 采集2004年7月至2006年6月首都儿科研究所附属儿童医院门诊和住院呼吸道感染患儿的咽拭子和鼻咽洗液临床标本3330份,进行细胞培养和间接免疫荧光检测病毒;同时提取标本中病毒RNA后经逆转录聚合酶链反应扩增位于hMPV M基因的片段,经琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段.结果 从3330份临床标本中检测到110份hMPV阳性标本,阳性率3.3%.hMPV感染的患儿男女比例为1.5∶1,其中＜1岁年龄组患儿占46.4%(51/110),1～岁年龄组患儿占11.8%(13/110),2～5岁年龄组患儿占33.6%(37/110),＞5岁年龄组患儿占8.2%(9/110).hMPV感染患儿的临床症状以肺炎占的比例大,为44.5%(49/110);其次是诊断为上呼吸道感染(22.7%,25/110);诊断为毛细支气管炎的占10.9%(12/110),其中诊断支气管炎占7.3%(8/110).2004年7月至2005年6月期间几乎每个月份(除2005年5月和6月)都检出hMPV感染的阳性标本,未出现明显的流行高峰.而2005年7月至2006年6月期间hMPV出现了较为明显的流行,于2006年4月为高峰,阳性检出率为17.1%.110例hMPV感染的临床标本中有6份标本存在与其他呼吸道病毒的合并感染.hMPV和同期的人呼吸道合胞病毒的感染高峰没有重叠.结论 hMPV是北京地区婴幼儿急性呼吸道感染(尤其是下呼吸道感染)的重要病毒病原之一,其感染对2岁以下婴幼儿威胁更大.
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儿童感染人偏肺病毒的研究进展
人类偏肺病毒(hMPV)是临床上较为多见的一种病毒,其发病情况、发病机制及治疗尚不明确,但其在临床的检出率并不低,且常引起较为严重的急性下呼吸道感染,极大的危害患儿的生命健康.目前,西医尚未研究出针对此类病毒的特效药物,中医药对小儿偏肺病毒肺炎的临床研究报道也较少,文章针对此问题结合近年文献作一综述.
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近年北京人偏肺病毒基质蛋白、小疏水蛋白和粘附糖蛋白的遗传变异特征分析
为了探讨北京地区儿童中流行的人偏肺病毒( Human metapneumovirus,hMPV)结构蛋白基因特征,本研究着重对hMPV北京地区地方株的基质蛋白(Matrix protein,M)、小疏水蛋白(Small hydrophobie protein,SH)和粘附蛋白(Attachment protein,G)基因进行了基因特征的分析.本研究对2006年至2010年42株hMPV的M蛋白、49株SH蛋白和55株G蛋白基因特征进行了分析,进化分析显示北京地区流行的hMPV的这3个编码蛋白基因分别属于A2、B1和B2基因亚型.地方株M基因高度保守,A和B基因型之间存在7个氨基酸位点的变异(型内高度保守).不同基因型(A和B)和不同基因亚型(A2和B1、A2和B2)之间的SH基因的氨基酸同源性在60.7％～64.4％之间,而同一基因亚型内的氨基酸同源性则在93.3％～100％之间；同一基因型不同基因亚型之间(B1和B2)的氨基酸同源性在84.7％～88.7％之间.不同年份不同基因亚型G蛋白具有遗传多样性,使用不同的终止密码、核苷酸缺失和插入导致其核苷酸长度不同,变异程度相当高.不同基因型和不同基因亚型之间的G基因的氨基酸同源性在34.0％～38.6％之间,同一基因亚型内的氨基酸同源性在81.5％～100％之间；同一基因型不同基因亚型之间的氨基酸同源性在64.3％～69.2％之间.2008年至2010年的B2基因亚型的毒株大多数在多个位点出现了相同的氨基酸突变,同时出现了2个氨基酸的插入或重复插入,这些毒株在B2基因亚型内形成了一个新的进化簇.抗原位点预测分析显示不同基因亚型的SH和G蛋白的抗原位点均存在差异.
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来自肺炎患儿的A1基因亚型人偏肺病毒全基因组序列分析
人偏肺病毒(human metapne umovirus,HMPV)是婴幼儿呼吸道感染的重要病原之一.本研究目的在于分析在HMPV监测中发现的少见型别A1基因亚型BJ-1610的全基因组序列,为HMPV的进一步研究提供数据支持.BJ-1610来源于一名患有肺炎的3月龄女婴的鼻咽洗液标本.对该毒株进行全基因组RNA分段扩增、测序、序列拼接并分析其基因组特征、变异程度及是否存在重组等现象.BJ-1610株基因组全长为13 406 nt(KU821121).BJ-1610与HMPV参考株进行全基因和各蛋白核苷酸和氨基酸序列比较,显示全基因组的核苷酸相似性范围为81.2％～98.4％,其中相似性高的为澳大利亚株(KC562226),而SH和G基因则与其他澳大利亚株相似性更高.系统进化分析发现BJ-1610与HMPV A1基因亚型参考株位于同一分支,显示了与相似性分析相同的特征.对BJ-1610的膜表面蛋白F、SH和G蛋白序列进行分析结果显示,F蛋白为保守,SH基因编码区的终止密码发生了突变,导致终止密码后移15位,长度由552 bp变为567 bp;G蛋白氨基酸序列突变较多,并导致N-糖基化位点的减少.HMPV作为儿童呼吸道疾病的重要病原之一,对其流行株基因组的分析将对其流行特征、遗传进化、致病机理、疫苗研制和抗病毒药物研发等方面的研究产生积极的推动作用.
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人偏肺病毒感染小鼠肺内Toll样受体表达及PolyI:C对病毒感染的影响
探讨人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后肺组织Toll样受体(TLRs)表达变化及PolyI:C对病毒复制的影响.实验小鼠分为hMPV感染组、polyI:C+hMPV组、polyI:C+DMEM组、DMEM对照组,均在滴鼻后1、3、5、7、9和16d处死,取肺组织用于病毒滴度测定、病理检查、通过RT-PCR和实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺组织内TLRs mRNA的表达.结果显示:①与hMPV感染组相比,polyI:C+hMPV组小鼠肺内病毒复制水平明显减低,仅在感染后第5d及第7d检测到病毒;病理检查结果亦提示肺部炎症明显减轻.②RT-PCR结果提示:hMPV感染组小鼠与DMEM对照组相比,肺组织内大部分TLRs mRNA表达均升高.③实时荧光定量PCR结果提示:hMPV感染后小鼠肺组织TLR7-8 mRNA增高为显著,且有时间依赖性;滴鼻后24h,polyI:C+hMPV组TLR3的表达明显升高.提示:人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后,可上调小鼠肺组织Toll样受体表达,其中TLR7/8途径可能在启动天然免疫应答中起着重要作用;polyI:C可通过早期活化TLR3,抑制hMPV在小鼠肺内的复制,并减轻肺部炎症.
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北京地区人偏肺病毒膜表面糖蛋白G编码基因和特征的分析
为了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)膜表面糖蛋白G编码基因的特征,提取2003年和2004年各6份hMPV阳性的临床呼吸道标本中的RNA,经用随机引物合成cDNA后,用特异性引物扩增G蛋白全基因,克隆至pBS-T载体中并进行测序.用生物软件与GenBank中hMPV的基因序列进行比较和种系进化分析.12株hMPV可以分为两个主要的进化簇1和2.每个进化簇还可以再分为不同的亚进化簇.3株(2003年)hMPV属于进化簇1;9株(3株2003年和6株2004年)hMPV属于进化簇2.这12株hMPV G蛋白基因的核苷酸长度在624～711nt,使用了两种不同的终止密码,编码的氨基酸长度为208～236 aa,蛋白质分子量为22.9～25.8kD.与进化簇2相比,进化簇1的3株hMPV都出现了3个核苷酸的缺失,但未改变读码框架.同一进化簇内的hMPV G蛋白基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.7%～100%和91.8%～100%,不同进化簇间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为56.3%～57.4%和34.3%～38.2%.疏水性分析表明这12株hMPV G蛋白是典型的Ⅱ型跨膜锚定蛋白,分别与两个进化簇代表株的疏水图一致.这些hMPV的G蛋白氨基酸的替换集中在胞外区.它们都含有高百分比的脯氨酸(P)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T),含有相当数量的位于胞外区的O-连接糖基化位点.这些hMPV的G蛋白的N-连接糖基化位点数目和位置不尽相同.通过对G蛋白基因的分析显示,2003年和2004年北京地区流行的hMPV分属于两种不同的进化簇.基因分析显示hMPV的G蛋白是高糖基化的膜表面蛋白,具有与同属于副粘病毒科、肺病毒亚科的人呼吸道合胞病毒(hRSV)的G蛋白相似的基因特征,推测其功能和在感染免疫中的作用相当于hRSV的G蛋白,但有待进一步深入研究予以证实.
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北京地区两株人偏肺病毒M蛋白基因的原核表达及抗原活性分析
人偏肺病毒(Human metapneumovirus, hMPV)是近发现的可引起人类呼吸道感染的一种副粘病毒,现被归类于偏肺病毒属(Metapneumovirus),是至今发现的第一个与人类疾病相关的偏肺病毒属成员[1].目前已经受到世界范围的重视,已有十多个国家报道了不同年龄组人群中hMPV的感染情况.
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天津地区人偏肺病毒G蛋白特性分析
目的 了解天津地区人偏肺病毒(hMPV)G蛋白特性,为深入研究(hMPV)奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增hMPV的G基因片段,测序后通过生物信息学软件分析核苷酸同源性,绘制种系发生树,并对推导的G蛋白氨基酸序列的糖基化位点、跨膜序列及二级结构进行预测.结果 天津地区hMPV G蛋白由217～238个氨基酸组成.种系发生树分析显示,hMPV可分为A2a、A2b和B2 3个亚型,A2b为优势流行型.A2亚型内的核苷酸同源性在90.1%～99.5%,推导的氨基酸同源性在80.4%～99.1%;A、B亚型之间核苷酸同源性为57.4%～60.3%,推导的氨基酸同源性为30.3%～37.1%.hMPV G蛋白的S和T总含量在30.9%～34.0%之间,A和B型间差异无统计学意义(P>0.05).N-糖基化位点在2～6之间.10株A2亚型hMPV G蛋白的跨膜区为N-端33～55位氨基酸,1株B2亚型hMPV G蛋白为N-端27～49位氨基酸.G蛋白氨基酸变异多发生在膜外区.二级结构预测显示,柔性结构占G蛋白氨基酸总数的62.7%～84.1%,其中以无规则卷曲为主,占60.8%～84.1%.该区域也多集中在膜外区,成为抗原表位的可能性较大.结论 天津地区hMPV的优势流行型为A2b,其G蛋白特性有地区流行特点.
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急性呼吸道感染患儿中检出B1基因亚型人偏肺病毒
目的 初步了解急性呼吸道感染(acute respiratory infection,ARI)住院儿童中人偏肺病毒(human metapneumovirus,HMPV)感染情况.方法 于2017年1月1日至12月31日在山西省儿童医院呼吸科采集居住在太原市的、年龄1～5岁的ARI儿童鼻咽洗液标本,通过逆转录-聚合酶链式扩增技术(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测HMPV核蛋白(nucleoprotein,N)基因,对扩增得到的阳性PCR产物进行序列测定、同源性比较和系统进化分析.结果 于2017年2月份、11月份采集的标本中分别检测到l份、2份HMPV阳性标本.PCR产物核酸和推导氨基酸序列与GenBank中已有HMPV相应核酸和推导氨基酸序列同源性分别高于83％、90％.系统进化分析显示检测到的HMPV为B1基因亚型HMPV.结论 太原市儿童ARI中流行的HMPV主要是B1基因亚型.
