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我国狂犬病病毒及其传播流行规律
狂犬病病毒为单股不分节段的负链RNA病毒,病毒基因组由11928-11932个核苷酸组成,依次排列着N、P、M、G和L5个狂犬病病毒的结构基因,其长度分别为1 424、991、805、1675、6475个核苷酸,分别编码核蛋白(NP)、磷蛋白(NSP)、基质蛋白(MP)、糖蛋白(GP)和转录酶大蛋白(LP).
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A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体体外表达鉴定
目的从构建的A型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein)噬菌体单链抗体库中筛选阳性克隆,在大肠杆菌HB2151中表达流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体,为研究A型流感病毒免疫渗漏试剂盒建立基础.方法经过连续三轮固相"亲和-洗脱-富集"筛选,丰富噬菌体抗体库中阳性克隆的比例,采用ELISA、SDS-PAGE和Western-blot方法对大肠杆菌培养上清液和细菌周质腔蛋白进行分析目的产物.采用亲和层析方法对细菌周质腔蛋白进行分离纯化并进行单链抗体滴度分析.结果从96个克隆中筛选到10个阳性克隆,其中三个阳性信号较强,分别为A1、E1和G3.其A450分别达到0.469、0.582和0.507.A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体主要表达于细菌周质腔中,亲和纯化产物稀释4096倍,ELISA结果仍为阳性.结论利用噬菌体抗体库技术,初步在大肠杆菌中表达了A型流感病毒噬菌体单链抗体.
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低渗肿胀实验、苯胺蓝染色及染色质扩散实验检测精子核蛋白及膜完整性对比研究
目的 通过对低渗肿胀实验(HOST)、苯胺蓝(AB)染色实验、染色质扩散(SCD)实验、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)实验、AB/HOST实验,SCD/HOST实验、HOST/TUNEL实验的检测结果中精子活性分级进行比较,探索优化精子活性的检验方法. 方法 选取2012年5月-2016年10月已育成年健康男性志愿者30例.每例样本分为7组,分别为:HOST组、AB组、SCD组、TUNEL组、HOST/AB组和HOST/SCD组、HOST/TUNEL组.分别进行相应方法的染色,观察精子尾部肿胀及核蛋白、DNA受损情况,计算各级活力精子的比例. 结果 单独AB和单独HOST与HOST/AB比较,精子分级差异有统计学意义;单独SCD和单独HOST与HOST/SCD比较,精子分级差异有统计学意义;单独TUNEL和单独HOST与HOST/TUNEL比较,精子分级差异有统计学意义. 结论 HOST/AB联合染色及HOST/SCD联合染色是对精子的核蛋白、DNA及膜完整性判断更为准确和实用的方法.
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安徽省阜阳市10只可疑狂犬脑组织狂犬病病毒抗原检测分析
近年来安徽省阜阳市狂犬病疫情持续上升,为此2004年我们采集疑似狂犬10只,记录其发病症状及咬伤人和动物情况,并取犬头送卫生部武汉生物制品研究所基因工程室做狂犬病实验室检测,死犬其余部分焚烧消毒.抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体、HRP标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体由该室制备[1];异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG抗体由该所免疫研究室提供.用间接免疫荧光法(IFA)和双抗体夹心ELISA检测样品中狂犬病毒[2].
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北海道型汉坦病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性
目的 构建北海道型汉坦病毒(HOKV)核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于HOKV的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增HOKVFusong-Cr-247株的NP基因,并将该基因片段克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化到One ShortTM TOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用Kpn I和Not I双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast PUUV-S重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后.转化到DH10BacTM E.coli 感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Baemid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h后收获细胞.用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果 实验应用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统,成功构建了含普马拉类汉坦病毒核蛋白基因的重组杆状病毒表达载体.并在昆虫细胞中获得表达.IFA结果显示,感染细胞的胞浆中有亮绿色荧光颗粒,SDS-PAGE和Western blot检测细胞表达产物的50×103(M)的蛋白条带,证实重组病毒感染昆虫细胞后表达了相应的重组核蛋白,与预计的结果相符.并能与抗汉坦病毒抗体结合.结论 成功表达具有HOKV免疫原性及反应性的重组核蛋白,为研制HOKV的诊断试剂奠定了基础.
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汉坦病毒中国疫苗株Z10核蛋白免疫原性的研究
汉坦病毒株Z10是浙江省卫生防疫站出血热重点实验室于80年代分离成功,具有血凝滴度高、抗原性强等特点[1],后用作生产肾综合征出血热(HFRS)Ⅰ型和双价疫苗的毒株,用该病毒株生产的疫苗接种疫区人群,经现场流行病学考核,保护率在95%以上,具有很好的防病效果[2].为研究Z10株核蛋白的生物学特性,我们将Z10株核蛋白基因插入到原核表达质粒pET28a,构建成重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行核蛋白的表达,并将表达产物免疫家兔,研究其免疫原性,为进一步研究基因工程疫苗打下基础.
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2006-2009年济南市麻疹病毒流行株的基因测定分析
自1954年麻疹病毒(MV)分离成功以来,一直被认为是单一血清型.1998年5月,WHO规定对MV基因定型至少对血凝蛋白(HA)全长编码序列或核蛋白(N)基因碳末端450个核苷酸序列进行分析.至目前已发现MV存在8个基因组(A-H)23个基因型[1].
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SARS-CoV核蛋白和宿主细胞相互作用的初步研究
寻找与SARS-CoV核蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,从而探索SARS-CoV的致病机理.可溶性表达SARS-CoV核蛋白,利用His标签和离子交换层析对表达的蛋白进行了纯化,获得较纯的可溶性核蛋白.再将SPR/BIA技术与MALDI-TOF MS技术结合起来,使用SPR生物传感芯片作为亲和吸附的表面,分别捕获2BS细胞和A549细胞裂解液中与SARS-CoV核蛋白相互作用的细胞蛋白,收集足够量的相互作用蛋白,再利用MALDI-TOF-MS分析获得蛋白的性质.结果鉴定出与SARS-CoV核蛋白相互作用的蛋白:26S蛋白酶调节亚单位S10B(蛋白酶体亚单位p42)(蛋白酶体26S亚单位ATPase 6)(P62333),属于泛素/蛋白酶体系统;目前国内外尚未见类似报道.此研究初步发现了一种与SARS-CoV核蛋白在细胞外相互作用的蛋白,但这种相互作用在SARS-CoV感染及SARS的发生发展中发挥的作用还有待于深入研究和探索.
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尼帕病毒和亨得拉病毒核蛋白基因在杆状病毒表达系统的表达及反应原性鉴定
利用改造的昆虫杆状病毒表达系统转移载体,成功地对尼帕病毒(NiV)和亨得拉病毒(HeV)的核蛋白基因进行了分泌表达.重组蛋白表达的时效性分析结果显示,Sf9细胞感染重组病毒72～96h后,蛋白的表达量达到高峰,大规模表达可分别获得2.3～2.4mg/L纯化的目的蛋白.应用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)对两种重组N蛋白与兔抗NiV和HeV阳性血清的反应性进行鉴定,结果表明两种重组N蛋白和阳性血清有很好的反应性,并且在血清学上有交叉反应.该研究为今后开展流行病学调查和诊断试剂的研制打下了基础.
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抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用的研究
本文报道在内质网和细胞浆内稳定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体,研究抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用及其抗病毒作用机理.在获得稳定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体的细胞系的基础上,用MTT法检测细胞内表达抗汉坦病毒单链抗体对细胞增殖的影响,证实细胞内抗体的表达不会影响到细胞的生长.不同时间收集病毒感染毒后细胞培养培养上清和细胞裂解物,用ELISA方法检测细胞内外病毒结构蛋白含量的变化,结果表明定位于细胞内质肉和细胞浆内的抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体均能不同程度降低感染细胞上清中的核蛋白含量,但是不能或轻微抑制细胞内汉坦病毒核蛋白的合成.利用病毒微量滴定免疫荧光方法,对细胞内抗体与病毒的增殖关系进行了研究,证实无论在内质网还是在胞质,抗核蛋白细胞内抗体都能够抑制病毒的增殖,具有抗病毒活性.抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体不能抑制病毒结构蛋白的合成,其抗病毒效果是通过抑制病毒的包装而实现.
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甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化
为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPWt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性.限制性酶切反应与测序表明.三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示.三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T＝25℃,t＝10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western bIot检测显示.纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合.这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性.
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细胞水平狂犬病病毒感染的RNA干扰
以质粒pSilencer2.1-U6 Hygro为基础,设计并构建了针对狂犬病病毒(RV)糖蛋白和核蛋白mRNA的共9个siRNA表达载体,转染BHK-21细胞系后,在潮霉素-B的筛选压力下,获得9个稳定转录相关siRNA的BHK-21细胞株.1000TCID50的RV分别感染24孔板内的上述9株细胞,48h后以直接免疫荧光法检测各株细胞上RV的增殖,结果显示,在经不同siRNA表达载体转染的BHK-21细胞中,RV增殖水平有不同程度下降,RV增殖水平低者为对照细胞的1%,即RNA干扰效应高可阻断99%RV的感染.针对其中阻断水平超过90%的靶序列G69和N19,人工合成其双链siRNA,瞬时转染BHK-21细胞后,仍可达到80%以上的感染阻断率.本试验为有效阻断RV早期感染提供了新选择,为通过RNAi研究RV的基因组功能提供了新的依据.
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六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白抗原性初步研究
初步研究六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)抗原的抗原性,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据.利用原核表达系统表达纯化六种致病性白蛉病毒核蛋白,并分别免疫新西兰白兔.通过间接ELISA方法及Western-blotting方法对所获得的兔免疫血清进行交叉反应检测,确定其抗体ELISA滴度.此外,分别用上述六种致病性白蛉病毒NP抗原包被ELISA反应板并对发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)病人血清进行间接ELISA检测,确定其血清学交叉反应及IgG抗体滴度.通过原核表达系统表达并纯化的六种白蛉病毒NP抗原浓度及纯度均达到免疫和检测要求.ELISA及Western-blotting检测结果显示六种病毒NP抗原兔免疫血清中的每种血清与其余五种病毒NP抗原可能存在血清学交叉反应.SFTSV病人血清与除SFTSV-NP以外的五种NP抗原亦可能存在部分交叉反应.本研究初步评价了原核表达的六种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反应性,为相应诊断试剂的研制奠定了基础.
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汉滩病毒S基因的分段表达及其线性和构象型抗原表位分析
构建汉滩病毒76-118 N蛋白及其分别从N-端和C-端缺失的共6个突变体,在大肠杆菌BL-21中进行表达,并对其中一些蛋白进行了纯化.通过Western blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,N蛋白及6个缺失突变体都与组特异性抗体L13F3呈阳性反应,而缺失突变体与型特异性抗体AH30呈阴性反应.构建汉滩病毒76-118 N蛋白及其6个缺失突变体的真核表达载体,并在COS7细胞中进行表达.通过间接免疫荧光试验(IFA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,病人血清与真核表达的N蛋白及6个缺失突变体呈阳性反应.而仅有N蛋白及缺失N端1～30位氨基酸序列的NPN30与型特异性抗体AH30呈阳性反应.证实组特异性抗体L13F3结合的抗原表位位于N端1～30位氨基酸;而C端抗原表位对于型特异性抗体AH30与N蛋白的识别和结合具有重要意义,缺失N端100位氨基酸序列可能破坏羧基端构象型表位,也可以影响N蛋白与AH30的结合.
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狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位研究
为阐明狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位,本研究通过合成肽模拟B细胞线性抗原表位,采用免疫学方法对生物信息学分析获得的狂犬病病毒CVS-11核蛋白潜在B细胞线性抗原表位进行验证.结果显示,狂犬病病毒CVS-11核蛋白355～369、385～400位氨基酸序列合成肽免疫小鼠血清经间接酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗多肽抗体效价达到1∶12 800以上;抗多肽抗体在免疫印迹试验(Western blot,WB)中识别变性狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原,在间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody,IFA)中识别感染BHK-21细胞的狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原.因此,狂犬病病毒CVS-1l核蛋白355～369、385～400位氨基酸序列经证实为B细胞线性抗原表位.
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基于甲型流感病毒核蛋白的抗病毒靶点研究进展
甲型流感是对人类健康和社会稳定构成极大威胁的急性呼吸道传染病,具有极高的发病率和死亡率.由于甲型流感病毒的高变异性和频繁的耐药性,使得新靶点的抗病毒药物的研发显得非常重要.甲型流感病毒的核蛋白高度保守,是一个潜在的抗病毒药物的靶点,国内外已有相关报道.中草药作为祖国的传统医学宝藏,在防治甲流方面也表现出了独特的优势.本文从甲型流感病毒结构与功能出发,阐述甲型流感病毒核蛋白作为抗病毒靶点的研究进展.
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流感/禽流感病毒致病性研究进展
流感病毒是引起流行性感冒的病原体,它属正粘病毒科(Orthomyxoviridae),是具有包膜和分节段的单链负RNA病毒.甲、乙型流感病毒基因组均含8个节段,而丙型流感病毒仅含7个节段.根据流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)抗原特性及其基因特征的不同,流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型.
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抗汉坦病毒核蛋白单链抗体的构建与表达
汉坦病毒核蛋白在病毒各个基因组片段核糖核蛋白(RNP)复合物的形成,以及RNP复合物装配入病毒颗粒中发挥重要作用.体外研究表明,核蛋白与病毒RNA的特异性结合结构域位于第175～217个氨基酸残基,羧基端其它部分为非特异性结合结构域.为了在细胞内病毒复制的正常过程中研究核蛋白的功能,应用噬菌体表面呈现技术,分别从鼠杂交瘤细胞和人外周血淋巴细胞天然抗体库中,筛选出两株不同抗原结合位点的抗汉坦病毒核蛋白抗体L13 F3和H34Fab抗体,并在大肠杆菌中进行表达.L13 F3 Fab抗体的抗原结合位点位于核蛋白氨基端25～65个氨基酸之间,H34的抗原结合位点位于核蛋白的羧基端的一半.分别使重链可变区羧基端与轻链可变区氨基端通过9个氨基酸寡肽连接起来,构建成单链抗体,并在大肠杆菌内进行表达.通过酶联免疫吸附试验(ELSIA)、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot检测,确定所构建单链抗体与母抗体的抗原结合特性无差别.单链抗体分子量小,易于操作并保留了全部的抗原结合活性,是在细胞内探索汉坦病毒核蛋白功能的良好工具.
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大肠杆菌胞内的共表达策略
大肠杆菌表达系统因其具有系统工具成熟、表达水平高、易于操作和成本低廉等优点而成为表达外源蛋白常用的表达系统之一.但该系统在表达外源蛋白,尤其是真核蛋白时也存在不少缺陷,其中主要的是由于大肠杆菌胞内缺乏帮助蛋白正确折叠的机制,所以相当一部分在大肠杆菌中表达的外源蛋白都聚集成沉淀,即以包涵体的形式存在,从而丧失了生物活性.
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胃癌组织中黏蛋白MUC5AC的表达及其临床意义
黏蛋白是一种高分子富含糖链的糖蛋白,是上皮细胞产生黏液中的主要成分,广泛存在于消化道,对细胞起着保护和润滑作用.目前已有9种黏蛋白的核蛋白基因序列被克隆[1].我们采用免疫组化SP法检测74例胃癌组织、44例癌旁黏膜和20例正常黏膜中MUC5AC的表达,旨在探讨其在胃癌发生、发展过程中的作用.
