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杆状病毒在基因治疗中的应用进展
基因治疗的核心技术之一是获得高效、安全的基因转移载体.目前的非病毒载体(脂质体、多聚物、纳米载体等)和病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和逆转录病毒等)都还各自存在着某些缺陷,而杆状病毒由于安全性高、可插入基因片段大、操作性好等优点展现了在基因治疗中的巨大应用前景,开辟了杆状病毒应用的新领域[1].就杆状病毒作为基因载体在体内外和癌症基因治疗中的应用进展及其相关问题(如介导体内基因表达时遇到的障碍和解决措施等)作一综述.
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尼帕病毒和亨得拉病毒核蛋白基因在杆状病毒表达系统的表达及反应原性鉴定
利用改造的昆虫杆状病毒表达系统转移载体,成功地对尼帕病毒(NiV)和亨得拉病毒(HeV)的核蛋白基因进行了分泌表达.重组蛋白表达的时效性分析结果显示,Sf9细胞感染重组病毒72～96h后,蛋白的表达量达到高峰,大规模表达可分别获得2.3～2.4mg/L纯化的目的蛋白.应用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)对两种重组N蛋白与兔抗NiV和HeV阳性血清的反应性进行鉴定,结果表明两种重组N蛋白和阳性血清有很好的反应性,并且在血清学上有交叉反应.该研究为今后开展流行病学调查和诊断试剂的研制打下了基础.
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禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定
本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白.首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC.通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC.通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性.
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狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备
为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体.本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac Ⅰ中,获取的重组质粒pFastbac Ⅰ-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac E.coli感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M.用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M.用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性.用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价.结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25 kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力.本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础.
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乙型脑炎病毒样颗粒疫苗的制备及其免疫保护效率的初步评价
将乙型脑炎病毒prME及其信号肽基因片段克隆到穿梭载体AcBacmid中,构建重组穿梭载体AcBac-prME.Lipofectine介导其转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac-prME.Western-blotting、间接免疫荧光试验及电镜观察,证实Ac-prME介导prME在Sf9细胞中高效表达,且形成了病毒样颗粒.小鼠免疫和攻毒试验表明,该病毒样颗粒免疫可以使小鼠获得有效抵抗乙型脑炎病毒强毒株攻击的能力,保护率高达100％,从而为研制基于乙型脑炎病毒样颗粒的亚单位疫苗奠定了基础.
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杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定
将EV71P1和3CD基因片段克隆人同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bacmid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD).用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析.电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs).进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素.选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带.纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础.
关键词： 杆状病毒 肠道病毒71型(EV71) 病毒样颗粒(VLPs) 制备 鉴定 纯化 -
苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒E25序列突变对其入核定位和芽殖型病毒体增殖的影响
为了认识杆状病毒E25不同区段序列对其入核运输和定位及对病毒复制的作用,用egfp依次替代苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒e25不同区段序列或插入其不同位点构建7个e25突变体,分别插入e25缺失型或野生型bac-mid构建了14个e25突变型bacmids,用于对Sf9细胞的转染感染实验.免疫荧光和共聚焦显微镜分析显示,由EGFP替代E25 2～45aa构成的融合蛋白在被转染细胞质中弥散分布;EGFP插入1aa/2aa处构成的融合蛋白沿核膜外侧分布,未入核;EGFP替代46～118aa或插入118aa/119aa处形成的E25-EGFP在细胞核膜内、外侧和核质中呈稀疏点块状分布.EGFP替代119～228aa或插入45/46aa或C-末端的融合蛋白的定位与野生型bacmid转染细胞中的E25相似,呈环状或弥散分布.这些结果显示虽然E25 N-端序列对其定向入核运输和膜定位是必需的;但其中间段序列对其入核运输和定位也有一定影响.在正常E25和E25-EGFP突变子同时存在的情况下,不同的E25-EGFP突变子与正常E25呈现共定位特征,显示E25可能以二聚体或多聚体形式存在.在转染-感染实验中,只有兼含正常e25和2～45aa编码序列被替代的e25突变体的bacmid能够产生高感染性芽殖型病毒体(Buddedvirus,BV);其它e25突变型bacmids只能产生少量或完全不能产生感染性BV,显示E25结构严谨,所有替代和插入突变都导致其功能丧失或异常.
关键词： 杆状病毒 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 被膜蛋白E25 入核定位 -
狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究
构建表达狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)的重组杆状病毒,评价其表达出的SRV9株糖蛋白对小鼠免疫效果.将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆入穿梭质粒Bacmid中,构建重组穿梭质粒Bacmid-G,以此转染Sf9细胞.对病变细胞培养物进行电镜观察,获得正确重组杆状病毒后,通过Western-blot、IFA及小鼠免疫实验鉴定表达产物的免疫反应性及免疫原性.正确构建重组穿梭质粒Bacmid-G;获得表达SRV9株糖蛋白的重组杆状病毒,其表达产物具有良好免疫原性；表达产物接种小鼠可诱导其产生抗狂犬病病毒中和抗体,中和抗体达到保护水平的比例为100％.本实验所获得的重组杆状病毒表达出的SRV9株糖蛋白具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该实验为进一步开发狂犬病亚单位疫苗奠定了基础.
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杆状病毒包埋型病毒粒子研究进展
杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的病原微生物,在其生活周期中产生两种不同形态的病毒粒子,即芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子.自然界中,杆状病毒通过经口感染的方式在其宿主的中肠中建立原发性感染,杆状病毒的包埋型病毒粒子在此过程中发挥关键作用.本文回顾了杆状病毒的基本特性,阐述杆状病毒包埋型病毒粒子的蛋白组成及分类,并着重介绍多粒包埋型病毒粒子的进化及在杆状病毒经口感染过程建立中的意义,对进一步了解杆状病毒的进化历程和侵染机制具有重要的指导意义.
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昆虫杆状病毒经口感染因子P74的结构和功能
杆状病毒(Baculovirus)是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,在自然界中以节肢动物(主要是昆虫)作为专一性宿主进行感染和传播.包涵体衍生型病毒是杆状病毒的一种表型,主要通过宿主经口食入引发感染.多种包涵体衍生型病毒囊膜蛋白在病毒原发感染过程中发挥作用,它们被称为经口感染因子.P74是早被鉴定且研究为深入的一种经口感染因子,本文从五个方面综述了国内外关于P74的研究成果.P74含有三个跨膜结构域和两个功能结构域.在病毒释放过程中,P74会分别受到包涵体内碱性蛋白酶和宿主中肠胰蛋白酶酶切,P74及其酶切产物和囊膜表面稳定复合物有微弱相互作用.作为病毒结合蛋白,P74和刷状缘囊膜中一个大小约为35kDa的蛋白存在相互作用,使得病毒结合到宿主细胞上.对P74结构和功能的深入研究将促进我们对昆虫杆状病毒原发感染详细分子机制的认识,并为农业生产病害控制提供参考.
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杆状病毒增效因子及其增效机理
杆状病毒是一类双链环状DNA病毒,具有宿主特异性强和环境兼容性好等特点.作为微生物杀虫剂,杆状病毒在农业可持续发展中应将发挥更加重要的作用.但是,杆状病毒杀虫剂自身的不足,如杀虫活性低和杀虫速度慢等,严重制约了其推广应用.一些增效因子能够改善杆状病毒的杀虫活性或杀虫速度.本文综述了杆状病毒增效蛋白、昆虫痘病毒纺锤体蛋白和荧光增白剂等7种对杆状病毒具有增效活性的增效因子的特性,并对其增效机理进行了逐个分析,旨在为高效病毒杀虫剂的研发以及病毒杀虫剂的推广应用提供借鉴和帮助.
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中和性流行性感冒病毒基因工程抗体在昆虫细胞中的全基因表达、纯化及鉴定
将中和性流行性感冒(流感)病毒基因工程抗体IV-2、IV-6的轻链和重链Fd段基因,分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc,构建成杆状病毒表达载体pAC-L-Fc-Ⅳ-2和pAC-L-Fc-Ⅳ-6,转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现抗体的分泌型表达,表达产物进行亲和层析分离纯化.SDS-PAGE电泳和Western blot法证实有完整免疫球蛋白的表达,免疫印迹法证实它们能与流感病毒血凝素蛋白特异性结合.经间接竞争性抑制ELISA法测定,抗体与流感病毒抗原结合的解离常数KD值分别为2.5×10-9M和3.0×10-9M.流感病毒基因工程全抗体经在昆虫细胞中的表达、纯化和抗体特性鉴定,获得了两株纯化的全抗体,可用于以后的动物模型呼吸道粘膜被动免疫抗感染的研究.
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多种缺损及突变的PrP蛋白在杆状病毒中的表达和纯化
PrP蛋白多肽序列上存在有不同的功能区域,影响着蛋白质构象、理化特性和生物学功能.为了获得不同缺损及突变的仓鼠PrP蛋白,以PCR方法获得不同大小的PrP基因片段,利用PCR大引物点诱变法获得带有突变糖基化位点PrP序列.所有PCR产物测序鉴定正确后,分别与pFASTBAC Hb质粒连接,与穿梭载体DH10BAC转座,构建各种重组病毒.Western blot证实,8种不同长度的仓鼠PrP蛋白可在昆虫细胞Sf9中表达,包括全序列的PrP1-231,信号肽缺失的PrP23-231;N端缺损的PrP90-231和PrP120-231;C端缺损的PrP1-199、PrP1-174和PrP1-160.糖基化位点突变:PrP23-231(N181Q).其中不带信号肽序列的PrP蛋白均呈HIS融合蛋白,而N端带有信号肽的PrP蛋白则不能与Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱结合,但可以同PrP特异性抗体发生免疫沉淀反应.这提示PrP信号肽序列在昆虫细胞中可能也发挥着与哺乳动物细胞相似的作用.不同缺损及突变的PrP蛋白的表达和纯化为进行蛋白生物学性状研究奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究
以杆状病毒-昆虫细胞表达系统Bac-to-Bac为模型,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨.根据核心蛋白的亲水性分析结果,设计了三种长度的基因片段(C173、C191和C215),经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,获得三种重组病毒(rvBACC173、rvBACC191和rvBACC215)用于表达分析.SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验表明,昆虫细胞能够识别核心蛋白第191和192位氨基酸之间的切点并低效率切割;但不能够识别173～191位之间的切点.间接免疫荧光试验表明,截断型核心蛋白C173定位于细胞核内,而C191和C215则停留在细胞浆中.rvBACC173感染的细胞在核内出现单一的"类晶体样结构",电子显微镜分析证实,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体.试验结果还表明,第173至191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达,并且影响蛋白在细胞内的分布.间接ELISA实验证实,部分纯化的核心蛋白可用作诊断试剂检测人血清中的特异性抗体.
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同时表达蓝舌病毒四个主要结构蛋白可装配成病毒样颗粒
为研制蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)基因工程疫苗和进一步研究BTV结构与功能的关系,对BTV病毒样颗粒(VLP)的装配进行了研究.同时在昆虫细胞中表达BTV主要结构蛋白VP7、VP3、VP2与VP5,将细胞裂解液超速离心纯化后,发现主要存在两种形态的颗粒:一种与前文报道的病毒核心样颗粒(CLP)相同,直径约为60nm～70nm,蛋白壳厚10nm～15nm;另一种大小为70nm～80nm,蛋白壳厚20nm～30nm,与完整空心BTV颗粒形态一致.这些颗粒是由VP2/3、VP5与VP7组成的,不含核酸和其它任何BTV蛋白,并且具有诱导中和抗体的活性和血凝活性,与预期结果一致.以BTV13 VP7与VP3蛋白为内壳,以与其基因相比变异较大的BTV10 VP2、VP5为外壳,成功地实现了VLP装配,提示BTV颗粒内壳与外壳蛋白间相互作用引发装配的区域可能是保守的,VP2蛋白的高变性对其与内壳间的相互作用并无影响.
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中国对虾非包涵体型杆状病毒核衣壳的分离纯化
90年代以来,对虾病毒病害成为制约世界对虾养殖业发展的重要因素,包括中国在内的亚洲所有主要的对虾养殖国家和地区如泰国、日本、中国台湾、印尼等养殖的对虾均受到白斑病侵袭,造成巨大经济损失,其病原被认为是一组相关的白斑杆状病毒(white spot baculovirus，WSBV)[1].中国大陆沿海对虾养殖区自1993年开始全面暴发白斑病,已证实中国对虾非包涵体型杆状病毒(Penaeus chinensis non－occluded baculovirus,PcNOBV)是造成中国大陆养殖对虾暴发性流行病的主要病原[2],病毒形态学及多聚酶链式反(PCR)技术研究资料表明,PcNOBV属WSBV的一种[2,3].
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丙型肝炎病毒NS2-3蛋白酶基因在Sf9昆虫细胞中的表达
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)为单股正链RNA病毒,其基因组长约9.5kb,5'端和3'端各有一个长约345bp和60bp的非编码区,编码区含一个大开放读码框架,编码3 010aa～3 033aa残基的多蛋白前体.
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苜蓿尺蠖核型多角体病毒囊膜蛋白ODV-E18的核定向转运研究
苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)在细胞质中合成其囊膜蛋白,但在细胞核内组装并包埋病毒粒子,这些蛋白的核定向转运机制是人们甚感兴趣的课题.以AcMNPV多角体衍生型病毒ODV(occlusion-derived virus,ODV)的一种囊膜蛋白ODV-E18为对象,通过E18与一个标记短肽Flag融合的重组病毒的构建,以免疫荧光法跟踪检测E18蛋白的转运过程及形态,并利用酵母双杂交系统法(yeast two hybrid system),通过蛋白-蛋白相互作用的研究,寻找与E18紧密结合的可能的转运蛋白.研究结果表明,E18是先以核内模结构--微泡(microvesicle)的形式存在于核内的;一个被报道具有核定向转运功能的AcMNPV囊膜蛋白-ODV-E66能与E18形成紧密的复合体,推测E-66可能在E18的核定向转运中起着运载体的作用.
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杆状病毒反式激活蛋白IE-1诱导昆虫细胞凋亡及几种抑制剂对AcNPV诱导细胞凋亡的影响
为了探讨杆状病毒诱导细胞凋亡的机制,用含AcNPV-ie-1基因的重组质粒pGAM-ie-1转染斜纹夜蛾细胞SL-1和粉纹夜蛾细胞Tn-5B1.转染后24h通过光镜观察、DAPI荧光染料染色、DNA琼脂糖凝胶电泳等发现,SL-1发生了典型的凋亡,而同样的现象并没有在Tn-5B1细胞中出现.利用放线菌酮(cycloheximide,CHX)、莫能菌素(Monensin)及蚜栖菌素(aphidicolin)处理AcNPV感染的SL-1细胞,发现细胞凋亡被莫能菌素及蚜栖菌素抑制,被放线菌酮推迟.此结果为进一步研究杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的机制等奠定了基础.
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增强蛋白与多角体蛋白共包埋的研究
颗粒体病毒的增强蛋白(enhancin)是一种能显著提高核型多角体病毒(NPV)对昆虫感染力的病毒蛋白.构建了一种不形成多角体但表达粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白的重组病毒AcBBH-TnEn,将它与野生型AcMNPV共同感染SF21细胞,经SDS-PAGE、免疫印迹分析、荧光免疫等方法检测证实,增强蛋白与多角体可在同一细胞中同时表达,而且发现所形成的病毒多角体带有增强蛋白.这表明,可以通过混合感染的方式生产带有增强蛋白的病毒多角体.
