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中和性流行性感冒病毒基因工程抗体在昆虫细胞中的全基因表达、纯化及鉴定
将中和性流行性感冒(流感)病毒基因工程抗体IV-2、IV-6的轻链和重链Fd段基因,分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc,构建成杆状病毒表达载体pAC-L-Fc-Ⅳ-2和pAC-L-Fc-Ⅳ-6,转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现抗体的分泌型表达,表达产物进行亲和层析分离纯化.SDS-PAGE电泳和Western blot法证实有完整免疫球蛋白的表达,免疫印迹法证实它们能与流感病毒血凝素蛋白特异性结合.经间接竞争性抑制ELISA法测定,抗体与流感病毒抗原结合的解离常数KD值分别为2.5×10-9M和3.0×10-9M.流感病毒基因工程全抗体经在昆虫细胞中的表达、纯化和抗体特性鉴定,获得了两株纯化的全抗体,可用于以后的动物模型呼吸道粘膜被动免疫抗感染的研究.
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丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究
以杆状病毒-昆虫细胞表达系统Bac-to-Bac为模型,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨.根据核心蛋白的亲水性分析结果,设计了三种长度的基因片段(C173、C191和C215),经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,获得三种重组病毒(rvBACC173、rvBACC191和rvBACC215)用于表达分析.SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验表明,昆虫细胞能够识别核心蛋白第191和192位氨基酸之间的切点并低效率切割;但不能够识别173～191位之间的切点.间接免疫荧光试验表明,截断型核心蛋白C173定位于细胞核内,而C191和C215则停留在细胞浆中.rvBACC173感染的细胞在核内出现单一的"类晶体样结构",电子显微镜分析证实,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体.试验结果还表明,第173至191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达,并且影响蛋白在细胞内的分布.间接ELISA实验证实,部分纯化的核心蛋白可用作诊断试剂检测人血清中的特异性抗体.
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大黄鱼虹彩病毒腺苷三磷酸酶(ATPase)基因的克隆与表达
虹彩病毒(iridovirus)是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感染性的致病病原,由虹彩病毒所致疾病给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失.近年来,许多国家相继报道了在患病鱼、蛙和龟等水生经济动物中分离到虹彩病毒[1-4].
关键词： 大黄鱼 虹彩病毒 腺苷三磷酸酶(ATPase) 昆虫细胞 表达 -
人脂联素基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达
目的 利用杆状病毒表达系统探讨人脂联素(ADPN)基因在Sf9昆虫细胞中的高效表达.方法 利用PCR方法扩增人脂联素基因,与pFastBac1质粒连接,转化入含有穿梭载体bacmid的大肠杆菌DH10Bac中,筛选发生转座作用的重组穿梭载体 Bacmid-ADPN并转染Sf9昆虫细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物.结果 重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,能够表达出与脂联素多克隆抗体相结合的蛋白,蛋白分子质量约为30 ku.结论 人脂联素基因在真核细胞中成功得到表达,为进一步研究其生物学活性和作用机制奠定基础.
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人Ⅱ型CD74基因胞外端片段在昆虫细胞中的表达
目的 建立应用昆虫杆状病毒表达系统表达人Ⅱ型CD74胞外端片段的技术平台.方法 运用分子克隆技术,分别将CD 74胞外端全长(73～232aa)和与MIF结合的核心区(109～192aa)片段置于表达载体pFastBacDual的PPH启动子下,重组质粒转入含有Bacmid的大肠杆菌DH10Bac后与病毒基因组重组,提取重组病毒杆粒基因组,转染Sf-21细胞系.用RT-PCR检测目的 基因mRNA,用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达.结果 CD74胞外端全长(73～232 aa)可实现在昆虫细胞中的表达,目的 蛋白可被His标签抗体和CD74抗体识别;在细胞感染72 h、病毒接种滴度MOI为8时,目的 蛋白可实现大表达量.CD74与MIF结合的核心区(109～192 aa)片段在mRNA可实现转录的情况下未实现目的 蛋白表达.结论 成功建立人Ⅱ型CD74胞外端全长在昆虫细胞Sf-21中的表达平台,并获得了目的 蛋白表达的优化条件.
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HPV31 L1 C端截短基因可在昆虫细胞表达体系中高水平制备L1 VLP疫苗
目的 利用昆虫细胞表达体系制备人乳头瘤病毒(HPV)31 L1病毒样颗粒(VLP)疫苗.方法 化学合成法获得昆虫Sf9细胞偏性密码子优化的、C端删除27个氨基酸编码序列的HPV31 L1截短基因( HPV31 L1MΔC),构建重组杆状病毒,感染Sf9细胞进行表达;分别采用超声破碎、含离子型表面活性剂(1% SDS等)或含非离子型表面活性剂(0. 5% TritonX-100)的裂解缓冲液,制备细胞裂解上清;氯化铯超速离心法纯化后经动态光散射及透射电子显微镜鉴定;0. 1 μg的HPV31 L1MΔC VLP于第0和2周肌肉免疫BALB/c小鼠,第4周采集血清分析中和活性.结果 3种裂解方法制备的上清均显示HPV31 L1MΔC蛋白的特异表达,其表达量约占裂解上清总蛋白的10%;采用非离子型表面活性剂获得的裂解上清纯化后,目的蛋白纯度高,产量达11. 5 mg/L;纯化蛋白的水化分子直径为103. 3 nm,均一性好;电镜分析为直径50~60 nm的VLP.免疫血清中HPV31中和抗体滴度为1 440.结论 HPV31 L1MΔC在昆虫细胞表达体系制备的VLP产量高、免疫原性好,可用于生产含HPV31 L1 VLP的多价疫苗.
关键词： 人乳头瘤病毒31型L1 病毒样颗粒 中和抗体 昆虫细胞 -
汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用
目的构建汉坦病毒(HV)Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体,探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用.方法以质粒pUCm-Z10M为模板设计引物,用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段,将G2片段克隆入pUCm-T质粒载体,碱法提取质粒pUCm-Z10-G2,酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa,构建重组体pFastBacHTa-Z10-G2,重组体转化感受态细胞E.coli DH10Bac后,经2轮筛选,提取重组质粒转染昆虫细胞sf9,并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白.结果获得含有编码HV Z10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒,转染昆虫细胞表达出G2蛋白,与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应,昆虫细胞内呈现特异性环状荧光.检测40份HFRS血清,与全病毒细胞抗原片的符合率为95％.结论成功构建HV Z10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体,并在昆虫细胞中表达.可利用重组G2蛋白检测HV感染.
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CYP2C9基因1300A＞T突变对体外药物代谢活性的影响
华法林是目前临床常用的抗凝药物，自20世纪40年代合成以来，该药广泛应用于临床抗凝和抗血栓治疗，至今仍无有效的替代品出现。华法林的有效治疗范围较窄，不同个体间维持剂量存在很大的差异，用药不当会导致出血或血栓形成等严重不良事件的发生［1-2］。近年来研究发现，基因多态性、药物相互作用及饮食等因素都会影响到华法林的临床药效，其中基因多态性是重要的因素之一［1-4］。我们在临床日常工作中发现1例华法林高敏感患者，其日常稳定服药量仅为常规剂量的1／2，本研究对该患者进行了细胞色素P4502C9（ cytochrome P4502C9，CYP2C9）、维生素K环氧化物还原酶复合物1（vitamin K epoxide reductase complex 1，VKORC1）及细胞色素P4504F2（cytochrome P4504F2，CYP4F2）基因测序分析，发现其CYP2 C9基因携带一种全新的突变类型1300A＞T，并将突变型CYP2C9蛋白在昆虫细胞微粒体中重组表达，体外添加探针底物药，以研究其主要体外药物代谢特性是否发生改变，为临床个体化用药提供理论支持。
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sTNFR1在昆虫细胞中的表达及鉴定
目的:研究可溶性肿瘤坏死因子受体(soluble TNFα receptor1,sTNFR1)在昆虫细胞中的表达.方法:应用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统,构建含有sTNFR1基因的杆状病毒穿梭载体Bacmid,转染sf21昆虫细胞进行高效表达,利用TALON金属鏊合层析进行重组蛋白的纯化.免疫印迹和细胞测活方法鉴定重组sTNFR1的生物学活性.结果:从无血清培养上清中可纯化得到约3mg/L的重组蛋白.免疫印迹反应和细胞活性实验表明,重组蛋白具有良好的抗原结合能力和抑制TNF对L929细胞的细胞毒作用.结论:重组sTNFR1在昆虫细胞中表达稳定,易于纯化,并具有良好的生物学活性.
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人骨形态发生蛋白-7在昆虫细胞中的表达
骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)又称成骨蛋白-1(osteogenic protein-1,OP-1)是骨形态发生蛋白家族的成员,具有广泛的生理功能,尤其在诱导骨组织和肾组织形成方面起重要作用.至今已有大量报道证实BMP-7有助于骨及软骨组织缺损的修复,显示了良好的临床应用前景.此外,BMP-7能减轻大鼠急性缺血性肾衰竭的严重程度,将来有可能用于肾衰的治疗.人BMP-7全长cDNA编码431个氨基酸,分为信号肽段、前体肽段和成熟肽段.成熟肽具7个Cys,形成三个链内二硫键,两成熟肽单体通过一个链间二硫键形成二聚体.成熟肽单体有一个位点被糖基化.信号肽段、前体肽段参与BMP-7表达的胞内翻译后加工过程,这些加工过程只在真核细胞发生.在原核系统表达BMP-7很难得到活性产物,国内外文献尚未见到成功报道.文献已报道了人BMP-7蛋白在CHO细胞中的表达.我们在获得人BMP-7全长cDNA的基础上,采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达重组人BMP-7蛋白.
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在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M2及M5受体重组突变体
目的 为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台.方法 用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记.将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白.Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能.结果 通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体.将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变.Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力.结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究.
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利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性.方法 将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性.结果 重组Bacmid/bFGF DNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8.重组病毒在感染后48 h开始出现一相对分子质量为23 000大小的特异带,感染后72 h蛋白量明显增加,96 h蛋白量达到大,120 h蛋白量开始减少.在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带.Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应.MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖.结论 利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白.
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抗β淀粉样肽40人单克隆抗体在昆虫细胞分泌表达
目的 通过杆状病毒昆虫细胞系统重组表达抗β淀粉样肽40人单克隆抗体,为全人抗体治疗阿尔茨海默病创造条件.方法 将抗β淀粉样肽40人单链抗体重链可变区和轻链可变区分别克隆插入pAC-L-CH3的多克隆位点,构建成pAC-VH-VL表达质粒.将表达质粒和BaculoGold共转染SF9细胞后,用免疫荧光方法进行人IgG表达的检测.将感染重组杆状病毒的昆虫细胞培养液上清过蛋白A-琼脂糖亲和层析柱,洗脱纯化出的抗体经过SDS-PAGE电泳鉴定纯化蛋白质.结果 杆状病毒昆虫细胞系统抗β淀粉样肽40人单克隆抗体表达质粒pAC-VH-VL构建成功.将表达质粒和辅助病毒感染昆虫细胞后可见昆虫细胞表达人抗体.经过蛋白A-琼脂糖亲和层析,从昆虫细胞培养基中纯化出抗β淀粉样肽40人单克隆抗体.结论 通过基因工程手段在人抗Aβ40抗体可变区羧基端连接人抗体恒定区片段,通过杆状病毒昆虫系统分泌表达并纯化获得完整的人抗Aβ40单克隆抗体.
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兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性
目的 将兔出血症病毒(RHDV)VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力.方法 用Bac-to-Bac系统体外表达RHDV VP60全长基因.以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测.结果 SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68 KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人"O"、"B"型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击.结论 RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值.
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线粒体、细胞色素C、Caspase与细胞凋亡
细胞凋亡是机体在生长、发育和受到外来刺激时,清除多余、衰老和受损伤的细胞,以保持机体内环境平衡和维持正常生理活动的自我调节机制.研究表明,线粒体、细胞色素C的释放在细胞凋亡过程中起着非常重要的作用.细胞色素C释放到细胞浆后会诱导Caspase的激活,引起细胞凋亡.随着昆虫细胞培养技术的发展,对多种昆虫细胞凋亡的过程亦有了进一步的认识,但凋亡过程的确切机制尚存在许多未知领域.
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人Cosmc胞外段蛋白在昆虫细胞Sf-9中的表达与纯化研究
目的：：利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达人Cosmc胞外段蛋白，为体外研究Cosmc蛋白的结构和功能奠定基础，同时也为 O-连接糖基化及相关疾病的研究提供思路。方法：采用 Bac-to-Bac 系统，构建重组转移质粒pFastBac1-Cosmc extracellular domain(pFastBac1-Cosmc ED)，转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，获得重组转座子rBacmid-Cosmc ED。在脂质体介导下，重组病毒感染Sf-9无血清细胞，在Sf-9中表达Cosmc 胞外段蛋白，由于Cosmc N端加有昆虫细胞信号肽HBM( Honey Bee Melittin)且不含有跨膜段，所以Cosmc胞外段蛋白表达后分泌到培养基上清中，通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测，并通过Ni-NTA亲和层析柱对其进行纯化分析。结果：SDS-PAGE和Western blot分析显示得到一条分子量约为33 kD的特异性条带，与目的蛋白大小相符，质谱结果进一步证明所得蛋白为Cosmc胞外段蛋白。结论：Sf-9细胞中可成功表达Cosmc胞外段蛋白，为进一步研究Cosmc的结构和功能奠定基础。
关键词： 人Cosmc 胞外段 昆虫细胞 杆状病毒表达系统 表达纯化 -
人重组FGFR1在昆虫细胞膜上的表达
目的：将人重组成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)表达在昆虫细胞膜表面，用作筛选成纤维细胞生长因子(FGFs)拮抗肽探针。方法：将人FGFR1 cDNA克隆人昆虫病毒的转递质粒pFastBac I上，然后转座到昆虫病毒Bacmid上。以重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9并表达人FGFR1，以Western印迹和ELISA对表达出的蛋白质进行鉴定。结果：FGFR1 cDNA片段2 100 bp，重组FGFR1表达产物分子量78 kD。ELISA结果显示，人重组FGFR1高效地在昆虫细胞Sf9膜表达。结论：这个表达系统能很好地表达出人重组FGFR1，并能准确地将其定位到昆虫细胞膜的表面。
关键词： 成纤维细胞生长因子受体1 昆虫细胞 表达 -
I-Ad/IgG2b Fc二聚体融合蛋白的构建表达及鉴定
目的:构建I-Ad/IgG2b Fc杆状病毒表达载体,使其在Sf9昆虫细胞内表达.方法:利用RT-PCR从BALB/c小鼠淋巴细胞中扩增出I-Ad α、I-Ad β和IgG2b Fc目的基因序列,运用重叠PCR将I-Ad α和I-Ad β分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,形成I-Ad α-Fos和I-Ad β-Jun;利用酶切位点XbaⅠ将I-Ad α-Fos与IgG2b Fc段相连,形成I-Ad α-Fos-IgG2b Fc重组序列;分别将I-Ad α-Fos-IgG2b Fc和I-Ad β-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的PPH和PP10两个启动子的下游,构建出重组载体pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc];采用PCR及限制性内切酶对所构建的载体进行鉴定并测序;将pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]转入DH10Bac感受态,使其在转座子的作用下形成重组杆粒病毒Bacmid+[I-Ad/IgG2b Fc],利用脂质体转染试剂将重组表达载体转染至Sf9昆虫细胞,P4后大量感染Sf9昆虫细胞,收集上清通过PEG20000浓缩可得到I-Ad/IgG2b Fc二聚体融合蛋白,通过双抗体夹心ELISA及Western blot对表达的蛋白进行检测.结果:PCR及酶切鉴定以及测序结果证实所构建的pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]重组载体具有正确的序列;双抗体夹心 ELISA和Western blot结果表明重组杆粒能成功感染Sf9昆虫细胞,并且表达的融合蛋白具有正确构象.结论:成功构建pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]杆状病毒表达载体,并在Sf9昆虫细胞中表达,为研究I-Ad限制性的T细胞奠定了基础.
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人神经生长因子在昆虫细胞中的表达
神经生长因子(NGF)在外周及中枢神经系统的发育及存活方面起着重要的作用.它可以促进外周感觉神经元及背根神经节神经元的增生.中枢神经系统中,NGF主要存在于前脑底部胆碱神经元中,其脑中含量的减少与Alzheimer病引起的记忆力减退及老年斑沉积呈正相关[1].因此NGF药用方面的作用已受到人们的重视,它可望成为治疗Alzheime病的新型药物.
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重组人β-神经生长因子在昆虫细胞中的表达、纯化及其生物学活性
目的 在昆虫细胞中表达重组人β-神经生长因子(Recombinant human β nerve growth factor,rhβ-NGF),并对表达产物进行纯化和生物学活性鉴定.方法 构建rhβ-NGF杆状病毒表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF],利用脂质体cellfectionⅡ将质粒转染至昆虫细胞Sf9中,用转染细胞的上清反复感染Sf9细胞,大量收获含目的蛋白的培养上清,利用离子交换层析和分子筛层析纯化rhβ-NGF,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过鸡胚背根神经节培养法检测rhβ-NGF的生物学活性.结果 重组表达质粒Bacmid+ [rhβ-NGF]经测序证实构建正确；重组病毒感染的Sf9细胞可表达rhβ-NGF;纯化的rhβ-NGF蛋白经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约14 200的单一条带,纯度大于98％,能与兔抗人NGF单克隆抗体特异性结合,并能刺激神经节突起生长,其比活性约为600 000 AU/mg.结论 成功在昆虫细胞中表达了有生物学活性的rhβ-NGF,为其大量制备奠定了基础.
