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pQE-hbFGF表达系统的构建及其蛋白质的表达和纯化
目的构建pQE-hishbFGF表达载体,通过一步纯化得到6×HishbFGF蛋白质.方法用PCR扩增目的基因hbFGF,连接到pQEA0载体上,转化到Top10菌株筛选重组子,经测序后将质粒转化到表达菌M15上,经IPTG诱导表达,超声波破菌后通过镍离子螯合层析一步纯化得6×HishbFGF蛋白质,ELISA鉴定产物,用MTT法检测产物促细胞增殖的生物活性.结果hbFGF基因插入pQE载体中,在M15中6×HishbFGF的表达量达到20%,且为可溶性表达.经一步纯化后得到N端带6个组氨酸的hbFGF蛋白,纯度为96%,6×HishbFGF具有免疫原性及促进NIH3T3细胞增殖的活性.结论6×HishbFGF蛋白质在M15中可溶性地高效表达,并经一步亲和层析得到纯度高活性高的产物,降低了生产成本,为大规模生产hbFGF及hbFGF的应用研究奠定了基础.
关键词： 人碱性成纤维细胞生长因子 pQE表达系统 可溶性表达 镍离子螯合层析 -
利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性.方法 将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性.结果 重组Bacmid/bFGF DNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8.重组病毒在感染后48 h开始出现一相对分子质量为23 000大小的特异带,感染后72 h蛋白量明显增加,96 h蛋白量达到大,120 h蛋白量开始减少.在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带.Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应.MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖.结论 利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白.
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PCR法检测转基因大豆毛状根的hbFGF基因
目的 通过检测转基因大豆毛状根的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),为利用毛状根生产药物实现工业化提供实验基础.方法 采用PCR检测方法,利用植物基因组DNA提取试剂盒,兔抗人bFGF单克隆抗体进行对转基因大豆毛状根hbFGF检测.结果 用PCR检测转基因大豆毛根,并在60条Hyg抗性大豆毛状根中鉴定出19条大豆毛状根整合状hbFGF,阳性率为32%.兔抗人bFGF单克隆抗体检测表明,hbFGF在转基因大豆毛状根中稳定表达.结论 转基因大豆毛状根能够稳定表达hbFGF基因,在工业生产中具有广阔的前景.
关键词： 转基因 大豆 人碱性成纤维细胞生长因子 -
人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析
目的:通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA在大肠杆菌DH5α中的表达,为bFGF进一步研究提供材料来源.方法:用多聚酶链反应(PCR)及DNA重组技术将PCR产物克隆到pGEM-5Z载体并测序,然后克隆到表达载体pXH上.结果:转化重组质粒pLX1的大肠杆菌经42℃温控诱导4～5 h,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约35 000,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的9.9%.经Factor Xa酶切后得到分子量约为17 000的bFGF,其生物学活性ED50为2.29 ng/ml.结论:经PCR方法扩增的bFGF可在大肠杆菌中高效表达,为其进一步结构与功能研究打下基础.
关键词： 人碱性成纤维细胞生长因子 高效表达 纯化 -
人碱性成纤维细胞生长因子(hu-bFGF)在毕赤酵母中的分泌表达
通过PCR技术从pMD18-T/hu-bFGF质粒中扩增出hu-bFGF基因,并将其克隆到pGEM-T Easy克隆载体中.经测序鉴定后,目的基因通过XhoⅠ和XbaⅠ酶切后,以正确的阅读框插入到pGAPZα-A的编码α-factor信号肽序列的下游,构建成pGAPZα-A/hu-bFGF重组分泌表达载体.表达载体用BlnⅠ线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,转化子经Zeocin抗性筛选、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE复筛获得分泌表达hu-bFGF的工程菌.Western Blot结果表明:重组蛋白能够与兔抗人bFGF抗体发生特异性反应,具有良好的抗原性.对工程菌培养条件的优化表明:以麦芽糖为碳源、培养基起始pH值为6.5、培养96 h时重组蛋白的表达水平高.
关键词： 人碱性成纤维细胞生长因子 毕赤酵母 分泌表达 优化 -
一种缺失核定位信号区的hbFGF的表达及纯化
目的:为了研究缺失核定位信号区的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)独特的转运机制,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达和纯化了缺失核定位信号区的hbFGF.方法:将PCR扩增得到的hbFGF cDNA片断克隆到表达载体pET3c中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过离子交换和肝素亲和层析从菌体上清中纯化目标蛋白,MTT法检测促分裂活性.结果:hbFGF的表达量约为全菌体蛋白的20%,纯化的缺失核定位信号区的hbFGF的促分裂活性与缺失核定位信号区的hbFGF标准品相当.结论:BL21(DE3)/pET3c表达系统能高效表达缺失核定位信号区的hbFGF,纯化得到的hbFGF可用于进一步的研究.
关键词： 人碱性成纤维细胞生长因子 核定位信号 纯化 -
重组人碱性成纤维细胞生长因子突变体[Ser69,87]的表达、纯化及其稳定性研究
目的:对野生型人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)进行突变改造以提高其稳定性.方法:采用PCR突变方法,将hbFGF cDNA第69位和87位的Cys密码子突变为Ser密码子,所得的突变片断插入表达载体pET3c的表达框架中,构建了表达菌株BL21(DE3)/pET3c-[Ser69,87]hbFGF,IPTG诱导表达.通过离子交换、肝素亲和两步层析的方法分离纯化突变体蛋白[Ser 69,87]hbFGF.MTT法测定重组蛋白的促分裂活性.并对突变体蛋白的抗蛋白酶水解能力、热稳定性及其酸碱稳定性进行了检测.结果:所构建的表达菌株,其[Ser69,87]hbFGF的表达量占菌体总蛋白的30%以上.经两步层析纯化,获得了纯度达98%的突变体[Ser69,87]hbFGF.纯化的样品促Balb/c 3T3细胞增殖的活性与野生型hbFGF相当.突变体[Ser69,87]hbFGF抗胰蛋白酶水解的能力较野生型hbFGF强;热稳定性和酸碱稳定性也较野生型hbFGF高.结论:突变体[Ser69,87]hbFGF的生物学活性与野生型hbFGF相当,其稳定性明显高于野生型hbFGF.
关键词： 人碱性成纤维细胞生长因子 突变体 稳定性 -
pcDNA3-hbFGF转染角朊细胞对真皮成纤维细胞增殖的生物学效应
目的:观察含外源性人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因的角朊细胞(human keratinocyte,HK),对真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast, HDFib)增殖的影响;探讨转hbFGF基因HK对创面愈合的生物学效应及作用机理,为这种转基因HK细胞用于创面基因治疗的可行性提供实验依据.方法:收集含真核表达质粒pcDNA3-hbFGF的HK细胞培养上清,加入培养的HDFib细胞内;MTT法测定细胞的增殖率、3H-TdR掺入法测定细胞DNA合成率、流式细胞仪分析细胞增殖周期.结果:加入转基因HK细胞培养上清的HDFib细胞,培养72h后,较正常对照组、加正常HK培养上清组、加转染空载体pcDNA3-neo的HK培养上清组,其细胞增殖分别增加1.0,1.5,3.0倍(P＜0.01);细胞DNA合成率分别提高1.6,2.3,3.4倍(P＜0.01);HDFib细胞周期分析显示加入转基因HK细胞培养上清24h时细胞处于S期的比例较其余对照组增加明显,至72h时无差别.结论:转染hbFGF基因真核表达质粒的HK细胞可以分泌活性物质促进HDFib细胞DNA合成及增殖;机理为刺激HDFib进入细胞分裂S期,其效应呈现时间依赖性.
