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幽门螺杆菌VacA毒素的初步纯化
早期发现幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)液体培养上清中含有导致哺乳动物上皮细胞产生空泡的物质,后来证实是由一种相对分子质量(Mr)约为87000或95000的Hp分泌蛋白引起,因而命名为致空泡变性细胞毒素(VacA).
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幽门螺杆菌诱导大鼠胃粘膜细胞分泌胃蛋白酶原
为研究幽门螺杆菌(Hp)超声提取物对大鼠胃粘膜细胞系合成与分泌胃蛋白酶原的影响,大鼠胃粘膜细胞OUMS-37(34代)在DMEM培养基中培养3*!d后细胞生长到紧密状态时,换以新鲜的培养基,加入Hp超声提取物或试剂后,采用酸变性法,按指定时间取培养上清及细胞裂解液测定胃蛋白酶原活力。
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川崎病TH1/TH2功能状态的研究
川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种急性弥漫性血管炎,婴幼儿发病多见,至今,该病病因及发病机理不明,从病人的流行病学特征推测可能与病原体感染或毒素超抗原引起免疫学异常有关.本研究通过对KD患儿急性期、恢复期PPD皮试的观察以及外周血血清IgE的变化、外周血CD4 T细胞CD30表达和外周血单个核细胞(PBMC)培养上清IL-4、IFN-γ水平的测定,了解KD急性期TH1/TH2功能平衡状态及免疫发病机理.
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流式细胞术测定CD3+细胞胞内IL-2表达的研究
几乎所有的细胞因子均可由各种不同类型细胞在体外由有丝分裂原、钙离子载体、佛波醇酯(PMA)等物质诱导产生,从而为各种因子调控机理的研究提供了方便。传统的生物测定技术、酶联免疫法等只能检测分泌在体液或细胞培养上清中的因子,也不能确切分析产生各类因子的细胞类型。而流式细胞术(Flow cytometry,FCM)以单细胞分析为基础,通过特异性染色技术,可快速及准确地多参数定性和定量细胞膜、浆、核内多种物质,从而精确判断各细胞亚群中因子的表达情况〔2〕。本研究用PMA和钙离子载体(ionomycin,IONO)共刺激人外周血单个核细胞,通过monensin阻断、三聚甲醛(paraformaldehyde)固定、皂角素(saponin)破膜等方法,借助抗CD3、抗IL-2单克隆抗体,用FCM同时检测CD3+细胞和胞内IL-2阳性的细胞,分析了不同PMA及IONO浓度条件下,IL-2阳性CD3+细胞的百分率,为细胞亚群中各种因子的测定和研究提供了实验依据。
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慢性乙型肝炎患者TH1/TH2细胞因子应答状况
IL-10和IFN-γ分属于TH1、TH2类细胞因子,它们在乙型肝炎病毒(HBV)持续感染的发生机理中起重要作用。为了探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV抗原特异性TH1/TH2类细胞因子应答情况,我们选择43名此前未行免疫治疗或抗病毒治疗并经肝脏穿刺活检证实的CHB患者,并以年龄近似的10名体健者作为正常对照。常规分离外周血单核细胞(PBMC),以106/ml的密度接种于24孔板,加入终浓度为1μg/ml的rHBcAg刺激培养72?h,用ELISA法检测培养上清中IL-10(pg/ml)和IFN-γ(pg/ml)的含量。结果表明,CHB病人PBMC培养上清中IFN-γ水平与正常对照组比较无明显差异(501.02±131.73 vs 534.46±121.33),IL-10水平则增高,与正常对照组相比差异非常显著(398.74±79.55 vs 279.45±67.93,P<0.001)。将CHB病人按血清病毒定量分为A(HBV DNA定量<20pg/ml)、B(HBV DNA定量为20~200pg/ml)、C(HBV DNA定量>200pg/ml) 3组,各组IFN-γ平均值为618.13±97.01,469.82±80.11,405.38±98.98,B、C组与A组比较P<0.01;IL-10水平依次为,330.51±59.73,400.44±69.52,466.11±71.49,可见在高病毒量组IL-10水平明显较高,A组与C组比较,P<0.001;B组与C组比较,P<0.01。
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不同种属来源明胶及其他因素对明胶酶谱法检测金属蛋白酶的影响
金属蛋白酶-2(MMP-2,明胶酶A)与金属蛋白酶-9(MMP-9,明胶酶B)在多种生理过程中起作用,病理状态下如肿瘤、心血管疾病和呼吸系统疾病,则这些酶的表达和活性增加[1-2].明胶酶谱法多用于检测血浆、细胞培养上清及组织中的金属蛋白酶-2和9的活性[3],我们先前的实验发现不同来源的明胶直接影响明胶酶谱法结果,不同方式处理样本对酶的活性检测有影响,本研究就明胶的来源(自猪、牛皮肤提取)是否影响金属蛋白酶活性的检测,以及不同样本量、样本储存温度、反复冻融等因素对明胶酶谱法检测金属蛋白酶活性的影响进行探讨.
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多粘菌素B及其模拟肽体外抗内毒素的实验研究
目的:观察PMB及其模拟肽处理前后FITC-LPS与PMBC的结合能力及培养上清中IL-6、TNF α的含量变化.方法:LPS(或FITC-LPS)100μg/L分别与PMB100 mg/L、peptide 0 100 mg/L、peptide 1 100 mg/L、PBS,37℃孵育30 min后(分别加入50 mL/L NHS)刺激PBMC,用流式细胞仪检测FITC-LPS与PBMC的结合能力及CD14表达;ELISA法检测培养上清中细胞因子TNF α、IL-6含量.结果:FITC-LPS分别与PMB、peptidel孵育后,细胞膜平均通道荧光显著减少,LPS与PBMC的结合能力显著降低(分别为8.1±1.8 vs 15.8±4.5 P<0.01;8.5±2.0vs15.8±4.5 P<0.01).100μg/L LPS刺激PBMC3h后CD14阳性率明显增加;LPS分别与PMB和peptidel预孵育后可显著降低LPS刺激PBMC细胞膜CD14表达(分别为45.5±6.2%vs68±5.5%P<0.01;43.2±4.1%vs68±5.5%P<0.01).LPS刺激PBMC分泌TNF-α和IL-6显著增加,LPS分别与PMB和peptidel预孵育后能显著减少细胞因子TNF-α(分别为15.30±1.0vs45.9±5.7 P<0.01;18.2±0.9vs45.9±5.7P<0.01)和IL-6分泌(分别为50.5±4.2 vs176.4±12.1 P<0.01;58.1±4.1 vs176.4±12.1 P<0.01).结论:多粘菌素B及其模拟肽(Peptidel)可能通过下调PBMC CD14表达,降低细胞因子水平来减少LPS诱导的炎症反应.
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肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养时的肝细胞功能
目的:利用原代培养的大鼠肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,研究骨髓间质干细胞对肝细胞功能的影响,以便更好用于肝细胞移植及生物人工肝.方法:采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离大鼠旰细胞,获得有活性生的肝细胞进行原代培养.台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活性;光镜下动态观察细胞形态学改变,并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能.比较肝细胞单纯培养及其与骨髓间质干细胞共同培养时细胞的功能.结果:培养7 d时两组均仍然维持白蛋白分泌及尿素合成功能;共同培养组与单纯肝细胞培养组在白蛋白分泌(13.75>2.179,P<0.05)及尿素合成功能(7.27>2.179,P<0.05)存在显著性差异,共同培养组明显高于单纯培养组.结论:肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,可以使肝细胞维持特异性功能,提高肝细胞活性.
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双歧杆菌黏附素的提纯及鉴定
目的:双歧杆菌已广泛应用于益生菌及发酵乳的研制.由于双歧杆菌黏附于肠黏膜表面是其发挥作用的首要条件,开展对其黏附机制的研究有着重要意义.但目前有关双歧杆菌与肠黏膜上皮细胞的黏附机制所知不多,我们从青春型双歧杆菌中分离及纯化其黏附素.方法:黏附试验为检测青春型双歧杆菌与人肠上皮细胞系Lovo细胞间的黏附.收集双歧杆菌培养上清并用300 g/L硫酸铵沉淀,在4℃下8000r/min离心30min收集沉淀物.沉淀物溶解于0.01 mol/L pH7.4 PBS,加入至0.02 mol/LpH7.0 PBS平衡的Superdex 75柱中进行洗脱,速度为0.7mL/min,226 nm波长检测光密度ABS值.收集合并活性组分,冷冻干燥.干燥物溶解后加入至0.05 mol/L pH8.0PB平衡的Q-Sepharose FF柱中,先用同一缓冲液洗脱,然后分别用含0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L及1.0mol/L氯化钠的0.05 mol/L,PB进行阶段洗脱,速度为1.5 mL/min,检测各峰黏附活性,活性组分用SDS-PAGE进行分析.结果:使用硫酸铵沉淀对双歧杆菌黏附素进行了分离,沉淀物进一步经Superdex 75凝胶过滤和Q-SepharoseFF离子交换色谱纯化.结果黏附素不能结合与Q-Sepharose柱,经SDS-PAGE分析,证实纯化的黏附素成分基本单一,其M约为16ku.结论:双歧杆菌黏附素可能为一种M 16 ku的蛋白质,并且存在于培养液上清中.
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抗纤复方Ⅰ号对肝星状细胞细胞外基质及其降解酶表达的影响
目的:研究乙醛对肝星状细胞(HSC)细胞外基质(ECM)及其降解酶表达的影响及中药抗纤复方Ⅰ号(KXI)的干预作用.方法:大鼠HSC体外原代及传代培养,大鼠灌以KXI制备药物血清,用乙醛及药物血清处理HSC.以放射免疫分析法及RT-PCR分别检测培养上清中层粘连蛋白(LN)及HSC中α1(Ⅰ),α1(Ⅳ)型胶原及基质金属蛋白酶-1,2(MMP-1,2)mRNA的表达.结果:培养上清中LN含量在100 μmol/L乙醛处理24 h后显著增加(52.0±12.1 vs 10.0±0.3,P<0.01),100 mL/L药物血清起抑制作用(19.2±7.8 vs 52.0±12.1,P<0.01);100 μmol/L乙醛刺激HSCα1(Ⅰ)型胶原及MMP-2 mRNA的表达明显增强,100mL/L药物血清抑制其作用;100 μmol/L乙醛减弱HSCαl(Ⅳ)型胶原及MMP-1 mRNA的表达,100 mL/L药物血清则使二者表达有所增强.结论:KXI能抑制乙醛刺激的HSC中LN的分泌,αl(Ⅰ)型胶原及MMP-2 mRNA的表达;而增强乙醛所抑制的HSC中αl(Ⅳ)型胶原及MMP-1 mRNA的表达.
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丹芍化纤方对体外大鼠肝细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响
目的:探讨丹芍化纤方抗肝纤维化的作用机制.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞,用MTT法测定肝细胞的增生,荧光实时定量PT-PCR(Real Time RT-PCR)法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测培养上清中的白蛋白.结果:丹芍化纤方药物血清对肝细胞的增生及白蛋白合成有促进作用,能显著下调肝细胞内caspase-3mRNA的表达,其表达水平与正常大鼠血清组比较有显著性差异,呈明显的浓度依赖关系.结论:丹芍化纤方发挥抗肝纤维化作用与其促进肝细胞增生、蛋白合成功能,抑制肝细胞凋亡有关.
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消瘢方对体外CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究
目的:探讨消瘢方抗肝纤维化作用的机理.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Hcoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,先加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞24 h,再用四氯化碳(CCl4)蒸熏法制造肝细胞损伤模型.分别用MTT法及荧光实时定量RT-PCR法检测CCl4损伤后肝细胞的增殖、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测细胞培养上清中的谷草转氨酶(AST)活性.结果:消瘢方药物血清能显著地促进CCl4损伤后肝细胞的增殖(P<0.05,P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞内有一定量的caspase-3mRNA表达(6.96±0.69 ng),加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,肝细胞caspase-3mRNA的表达(6.31±0.64,6.01±0.68,5.54±0.58 ng)稍低于CCl4损伤模型,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,肝细胞caspase3mRNA的表达(5.51±0.72,4.87±0.45,3.08±0.82 ng)显著下调(P<0.05,P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞培养上清中AST活性为1203.91±86.85 nkat,加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,其培养上清中AST活性降低为1092.39±57.01,1025.54±29.17,996.03±53.68 nkat,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,其培养上清中AST活性(998.70±30.67,885.51±44.82,753.48±35.17nkat)显著降低(P<0.05,P<0.01).消瘢方药物血清对CCl4损伤后肝细胞增殖的影响、下调肝细胞caspase-3mRNA的表达及降低肝细胞培养上清中AST活性的作用,均呈明显的血清浓度依赖关系.结论:消瘢方抗肝纤维化机理与其保护肝细胞免受损害、抑制肝细胞凋亡有关.
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细胞因子诱导慢性乙型肝炎患者树突状细胞的免疫功能
目的:探讨体外培养诱导慢性乙型肝炎患者外周血来源的树突状细胞(dendritic cells,DC)功能状态改善的途径方法:以GM-CSF+IL-4诱生的慢性乙型肝炎患者外周血来源的DC作为对照组,三个实验组再分别加入TNF-α或IFN-γ或TNF-α+IFN-γ联合培养.FCM检测细胞表面免疫分子CD1a,CD83,CD80,CD86,CD40,HLA-DR的表达水平并进行细胞计数,MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增生能力及ELISA法检测DC培养上清中细胞因子IL-6,IL-12的分泌水平.结果:在培养6、9d,各实验组诱导生成的DC数量明显多于对照组(P<0.01).在培养8d,各实验组DC的CD1a、CD83、CD80、CD86、CD40分子表达较对照组明显增高(P<0.01,P<0.05);各实验组DC表达的HLA-DR分子高于对照组(P<0.05;P<0.01),且以TNF-α+IFN-γ组表达高.各实验组DC刺激同种异体淋巴细胞增生的能力较对照组增强(P<0.05).培养6d各实验组DC培养上清中IL-12的浓度高于对照组(P<0.05),尤以IFN-γ组更为明显(P<0.01),而IL-6的浓度则显著低于对照组(P<0.01).结论:采用GM-CSF+IL-4联合TNF-α或IFN-γ或TNF-α+IFN-γ体外培养体系,能有效的改善慢性乙肝患者DCs的免疫功能状态.
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肝靶向十六酸拉咪呋啶酯固体脂质纳米粒抗乙肝病毒的研究
目的:探讨肝靶向十六酸拉咪呋啶酯固体脂质纳米粒抗HBV的作用.方法:以半乳糖苷为载体,构建十六酸拉咪呋啶酯固体脂质纳米粒(PLN-LAGS),将其靶向导入2.2.15细胞,共同温育10 d后,观察对细胞的毒性作用;同时将LAP-GSLN尾静脉注入小鼠体内,R P-H P L C测定拉米呋定(lamivudine,LA)在血清、肝、肾、肺及脾中的分布,用ELISA和荧光定量PCR检测多个时期培养上清中HBsAg,HBeAg和HBV DNA.结果:LAP-GSLN在肝脏中具有靶向性,LAP-GSLN组肝脏的含药量为LA组的3.3倍;导向后4d出现对HBV-DNA的抑制,在药物浓度10.0 m/L时LAP-GSLN组HBV DNA<1.11×107拷贝/L,而单纯LA组则为5.06×109拷贝/L;6 d出现对HBsAg,HBeAg抑制,在药物浓度0.01mg/L时,LAP-GSLN,LA组对HBsAg,HBeAg抑制率分别为52.9%,53.9%;32.2%,31.1%;在药物浓度10.0 mg/L时,LAP-GSLN,LA组对HBsAg,HBeAg抑制率分别为67.2%,69.0%;45.1%,41.0%.未发现对2.2.15细胞的毒性作用.结论:小剂量半乳糖介导十六酸拉米呋定脂质纳米粒能快速有效的抑制HBV抗原表达和DNA复制.
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乙型肝炎病毒核壳蛋白变异株在HepG2细胞的HLA-Ⅰ表达
目的:研究HBV adr亚型野生株和核壳蛋白变异株在HepG2细胞表面的HLA-Ⅰ/抗原肽复合物的表达.方法:通过定点突变技术将1.2拷贝HBV野生型质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,野生株和变异株重组质粒分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp以稳定表达.重组载体EBO-野生株、EBO-V60和EBO-L97分别作内切酶双酶切和序列测定鉴定,再用脂质体介导转染HepG2细胞,ELISA(Abbott)试剂盒定量检测各株培养上清HBV抗原,转染细胞用FITC标记的鼠抗HLA-ABC单抗染色,流式细胞术分析细胞表面HLA-I表达.结果:3株重组载体经内切酶消化,电泳后显示2条区带,分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体大小相同.测序结果证实EBO-V60和EBO-L97分别在nt2078 C→G和nt2189 A→C,保持原定点突变.EBO-野生株的培养上清HBeAg定量S/CO值明显高于变异株V60和L97,3株HBsAg定量S/N值接近,HBsAg表达相近表明实验的转染效率相当.EBO空载体转染的HepG2细胞HLA-I轻微表达,3株重组载体转染细胞HLA-I的荧光强度不同,野生株增强为18.2,L97明显升高至34.5,而V60降低至3.4.结论:HBV能增强HepG2细胞表面HLA-I/抗原肽复合物的表达,核壳蛋白热点变异V60和L97可使宿主细胞HLA-Ⅰ表达发生变化.
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透射电镜及激光共聚焦技术观察体外丙型肝炎病毒感染的人胎盘滋养层细胞
目的:探讨体外分离培养的人体胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)的可能性,以及滋养层细胞感染HCV后的超微结构改变.方法:采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞后,以HCV RNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染试验,应用RT-PCR法定性及定量检测感染后细胞培养上清中HCV RNA,透射电镜观察HCV感染后滋养层细胞的超微结构改变,并用激光共聚焦技术观察免疫荧光染色后HCV NS5在滋养层细胞中的定位.结果:HCV感染后的细胞培养上清中可间断检测到HCVRNA,而对照组始终未检出;激光共聚焦观察显示HCV NS5主要定位于细胞核周;HCV感染后滋养层细胞超微结构发生了明显改变,主要表现为溶酶体大量增生,粗面内质网增生,脂滴减少,出现空泡状结构,并可观察到病毒样颗粒.结论:HCV可以感染滋养层细胞,并导致滋养层细胞的超微结构发生类似黄病毒科病毒感染后的改变.
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非甾体类抗炎药对胃癌SGC7901细胞增生及环氧合酶活性的影响
目的:探讨非甾体类抗炎药(nonstemidal anti-imqammatory drugs,NSAID)对体外培养的胃癌细胞SGC7901生长及环氧合酶活性的作用.方法:用MTT法观察阿司匹林、尼美舒利对胃癌细胞SGC7901生长的影响;免疫细胞化学方法检测Ki-67及COX-2蛋白表达;采用放射免疫分析法测定细胞培养上清PGE2水平.结果:阿司匹林和尼美舒利呈时间、剂量依赖性方式抑制细胞增生,减少Ki-67蛋白表达.胃癌细胞SGC7901COX-2蛋白表达阳性,并伴有PGE2释放,尼美舒利可减少PGE2产生,但对COX-2蛋白表达无影响.结论:阿司匹林和尼美舒利均可抑制COX-2表达阳性的胃癌细胞SGC790l生长,尼美舒利通过抑制COX-2酶活性而减少PGE2释放,该研究提示COX-2可能在胃癌细胞SGC7901增生中起重要作用.
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哮喘患者外周血单个核细胞肿瘤坏死因子α转换酶的表达
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是支气管哮喘炎症过程中重要的前炎因子,具有生物活性的可溶性TNF-α是由肿瘤坏死因子α转换酶(TACE)蛋白水解其无活性的膜结合前体而来[1].我们的研究观察了哮喘患者外周血单个核细胞(PBMCs)TACE mRNA和蛋白的表达,及其培养上清TNF-α的水平,同时观察了吸入糖皮质激素对TACE mRNA和TNF-α的影响,旨在探讨TACE在哮喘发病中的可能作用地位.
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成纤维细胞生长因子-10上调人角朊细胞TGFα的分泌
目的:探讨成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)促创面肉芽组织形成的作用机制.方法:将不同浓度的FGF 10分别加入细胞培养液中,于作用后24、48和72h收集细胞培养上清,采用ELISA方法测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF的含量,同时进行细胞计数.结果:当细胞接种密度为2 500细胞/cm2时,24h的培养上清中未能检测到GM-CSF,48h的上清中125 ng/ml和500ng/ml FGF-10组GM-CSF的浓度及单个细胞的GM-CSF的分泌均显著高于对照组(P<0.05).72h的培养上清中仅500ng/ml FGF-10组GM-CSF的分泌量显著高于对照组(P<0.05).当细胞接种密度为5 000细胞/cm2时,16~500ng/ml的FGF-10各组GM-CSF浓度显著高于对照组(P<0.05),但单个细胞的GM-CSF分泌量与对照组无显著差异(P>0.05),48h收集的培养上清中,与对照组相比,FGF-10各组的GM-CSF均未升高,且48h各组单个细胞的GM-CSF分泌量与该培养皿中的细胞总数呈负相关(r=-0.881,P<0.05).结论:实验结果提示FGF-10可能通过刺激GM-CSF的分泌,从而间接作用于成纤维细胞、内皮细胞等,促进创面肉芽组织形成.
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间充质干细胞培养上清对小鼠皮肤损伤修复的实验研究
目的 探讨人脐带来源间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)培养上清对小鼠皮肤损伤组织的修复作用.方法 分离培养人脐带来源MSC,采用无血清培养基培养48 h后,收集上清并制成冻干粉.采用打孔器在小鼠背部打孔,建立小鼠皮肤损伤模型,从建模当天起将1 mg/ml MSC上清冻干粉溶剂用棉签涂抹于皮肤损伤处直至伤口愈合,3次/d,对照组则用PBS涂抹,分别在涂抹后0、4、7、10 d观察创面愈合情况,实时荧光定量PCR法检测皮损处炎症因子IFN-γ、TNF-α和生长因子FGF、TGF-β、VEGF的表达,Masson染色法检测损伤部位胶原纤维含量.结果 涂抹冻干粉溶剂后0~4 d,皮肤损伤处炎症反应明显,对照组反应较实验组更明显;第4天后,皮损部位见愈合,且实验组的愈合率[(90.1±4.0)%]显著高于对照组[(53.3±5.8)%](P<0.01).实验组IFN-γ、TNF-α的表达显著低于对照组(P<0.001);FGF、TGF-β、VEGF的表达则显著高于对照组(P<0.001);Masson染色结果表明,MSC组的皮肤损伤部位胶原纤维含量明显增加.结论 人MSC上清具有促进小鼠皮肤损伤的修复作用.