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杂色曲霉素对人外周血单个核细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的影响
目的探讨杂色曲霉素(ST)对体外培养的人外周血单个核细胞表面(HPBMc)HLA-Ⅰ分子表达的影响.方法采用流式细胞定量术(FCM)和免疫印迹(Western blot)分析方法,研究不同浓度ST(0.125、0.25、0.5、1和2 mg/L)处理后人外周血单个核细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的变化.结果FCM定量分析结果表明,经不同浓度ST处理24小时后,与对照组相比,各组细胞HLA-Ⅰ的平均荧光强度均降低,以较高浓度(0.5、1和2mg/L)ST处理组降低更明显(P<0.05).在0.125mg/L到2mg/L的浓度范围内,随ST处理浓度的升高,HLA-Ⅰ荧光指数逐渐降低,两者呈明显的负相关(r=-0.841,P<0.01).免疫印迹结果也表明,随ST浓度的增高,HLA-Ⅰ分子降低越明显.结论提示在0.125mg/L到2mg/L的浓度范围内,ST抑制人外周血单个核细胞表面HLA-Ⅰ分子的表达呈现出负的剂量-反应关系.
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Ag85B表位多肽对体外单核细胞增殖影响的研究
目的 通过观察Ag85B不同表位多肽对人外周血单个核细胞(PBMC)增殖的影响,筛选出增殖活性较强的Ag85B表位多肽,为制备结核新疫苗提供理论基础.方法 采用的实验方法为人工预测Ag85B的表位,并合成多肽.将不同表位多肽体外刺激人外周血单个核细胞,利用CCK-8法测定单核细胞同一时相的吸光值,计算各自的增殖指数,并与BCG、Ag85B抗原等作对比.结果 ①Ag85B表位多肽组的OD450值及增殖指数均高于阴性对照组,且高于传统抗原BCG;②5条多肽中,28aa多肽的OD450值及增殖指数高,且显著高于BCG(PIOD450 =0.001<0.01,P增殖指数=0.013 <0.05),但低于PHA;③28aa多肽的0D450值及增殖指数明显低于Ag85B,差异有统计学意义(POD450=P增殖指数=0.000< 0.01).结论 预测的Ag85B表位多肽抗原具有一定的免疫原性,其中28aa多肽可作为优势表位多肽,但是否可用于表位多肽疫苗候选抗原还需进一步研究.
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CFSE/PI双标法检测CIK细胞对顺铂预处理肿瘤细胞的杀伤活性
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞,具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点.如何对CIK细胞的效应功能进行客观准确的评价,如何使CIK和化疗有机地结合在一起,对CIK的临床应用具有重要的意义.
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荧光定量聚合酶链反应检测人类疱疹病毒7型方法的建立及应用
1990年,首次从健康人外周血单个核细胞中分离到人类疱疹病毒7型(human herpes rirus type 7,7).HHV-7为双链DNA病毒(145kb),主要感染CD4+淋巴细胞、唾液腺.
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RT-PCR酶联杂交法定量测定人PBMC中的IL-1βmRNA
IL-1β是由淋巴细胞和非淋巴细胞分泌的一种细胞因子,除参与免疫调控、神经内分泌及抗肿瘤等多种生理过程外,并与发热、炎症以及某些疾病的病理变化有关,因而在临床及科研中,很多情况下需要了解IL-1β mRNA的表达水平[1].目前,主要采用点杂交、RT-PCR标准曲线法及实时荧光PCR等对IL-1β mRNA进行定量.这些方法,仍存在着某些不足,本研究利用特制的DNA结合板,设计了一种酶联夹心杂交方法,能简便、准确地对RT-PCR扩增后的人外周血单个核细胞(PBMC)中的IL-1β mRNA进行定量.
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流式细胞术测定CD3+细胞胞内IL-2表达的研究
几乎所有的细胞因子均可由各种不同类型细胞在体外由有丝分裂原、钙离子载体、佛波醇酯(PMA)等物质诱导产生,从而为各种因子调控机理的研究提供了方便。传统的生物测定技术、酶联免疫法等只能检测分泌在体液或细胞培养上清中的因子,也不能确切分析产生各类因子的细胞类型。而流式细胞术(Flow cytometry,FCM)以单细胞分析为基础,通过特异性染色技术,可快速及准确地多参数定性和定量细胞膜、浆、核内多种物质,从而精确判断各细胞亚群中因子的表达情况〔2〕。本研究用PMA和钙离子载体(ionomycin,IONO)共刺激人外周血单个核细胞,通过monensin阻断、三聚甲醛(paraformaldehyde)固定、皂角素(saponin)破膜等方法,借助抗CD3、抗IL-2单克隆抗体,用FCM同时检测CD3+细胞和胞内IL-2阳性的细胞,分析了不同PMA及IONO浓度条件下,IL-2阳性CD3+细胞的百分率,为细胞亚群中各种因子的测定和研究提供了实验依据。
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线粒体DNA在百草枯中毒机制中的作用
目的 利用体外实验研究线粒体DNA (mtDNA)在百革枯(PQ)致病机理中的作用.方法 首先用PQ处理人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549细胞),应用CCK-8法检测细胞生存率,然后利用绝对定量PCR的方法检测培养上清液中mtDNA的含量,以激光共聚焦成像法检测线粒体膜电位来验证PQ对线粒体的损伤作用.接着通过Transwell趋化实验检测mtDNA对入外周血单个核细胞(PBMC)及中性粒细胞(PMN)的趋化活性,并用流式细胞术确定趋化细胞的亚型.同时应用Xcelligence系统和体外血管通透性试剂盒检测了mtDNA对血管通透性的影响.后验证mtDNA在细胞增殖方面的作用.结果 PQ致A549细胞损伤的半数致死浓度为600 μmol/L,且A549细胞的生存率及对线粒体的损伤存在浓度和时间依赖关系(P<0.05).PQ致细胞损伤释放出的mtDNA可以非特异地趋化单核细胞,但在血管通透性方面没有影响.并且mtDNA不能直接刺激人成纤维细胞的增殖,但可以引起主要的促纤维化因子TGF-β1的增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 PQ损伤细胞释放的mtDNA在PQ所致炎症及增殖反应中起着重要的作用.
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超抗原葡萄球菌肠毒素B对人外周血单个核细胞的抑制作用
目的 探讨葡萄球菌肠毒素B(SEB)初次和再次刺激对人外周血单个核细胞(PBMC)的影响.方法 以不同浓度100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml、0.1 μg/ml、0.01 μg/ml、0.001 μg/ml、0.0001 μg/ml的葡萄球菌肠毒素B刺激人外周血单个核细胞,同时设阴性对照及阳性对照植物血凝素(PHA)组,培养48 h后MTT比色法检测单个核细胞的增殖情况.10 μg/ml葡萄球菌肠毒素B间隔48 h重复刺激两次后,同时设阴性对照及PHA组,于第二次刺激后培养48 h,MTT比色法检测单个核细胞的增殖情况.结果 不同浓度组葡萄球菌肠毒素B初次刺激人外周血单个核细胞,10 μg/ml组PBMC增殖强,与PHA组间无显著性差异,刺激增殖率分别达23.1%和24.3%.间隔48 h再次刺激后,PHA组可继续促进PBMC增殖,而10 μg/ml SEB组可抑制PBMC增殖,抑制率达19.7%.结论 SEB初次刺激人PBMC可引起其增殖,反复刺激可抑制其增殖.
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CIK细胞及其中穿孔素在抗肿瘤中的作用
细胞免疫比体液免疫在抗肿瘤效应中发挥着更重要的作用.细胞毒性T细胞(CTL)和NK细胞杀伤靶细胞的作用机制已较清楚,主要是通过细胞直接杀伤和分泌抗肿瘤细胞因子两种途径.在抗肿瘤的细胞免疫应答中CTL及NK细胞起着重要作用.CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3,McAb,IL-2,IFN-γ,IL-1α)共同培养诱导后获得的一群异质细胞.由于该细胞同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点.
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IL-2联合IL-12激活A-NK细胞治疗人肝癌HepG-2
目的:研究A-NK细胞体外抗肿瘤作用及小鼠体内抗肿瘤作用.方法:用淋巴细胞分离液分离健康人外周血中的血单个核细胞,PME(5 mmoL/L)室温处理40 min,PME处理后的人外周血单个核细胞重悬于AIMV中.分为四组分别为:IL-2(6 MU/L)组,IL-2(1MU/L)组,IL-12(5 ug/L)组,IL-2(1 MU/L)+IL-12(5 ug/L)组;每瓶细胞浓度为5×109/L,于37℃,50 mL/L CO2饱和湿化空气的培养箱中水平培养4-5 h,移去含未黏附于塑料表面的细胞悬液,收集黏附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞),MTT比色法检测A-NK细胞体外细胞毒作用;然后建立肝癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,以肿瘤体积、抑瘤率、生存期等指标观察A-NK对移植瘤的抑制作用.结果:A-NK+IL-2+IL-12组细胞毒活性明显高于其他三组(aP<0.05),体内实验表明A-NK+IL-2+EL-4/IL-12治疗组的移植瘤生长速度缓慢,体积明显小于生理盐水对照组(bP<0.05),生存期显著延长(cP<0.05).结论:IL-12辅助IL-2激活的A-NK细胞的体外杀伤活性较单独用IL-2或IL-12强,体内实验显示具有明显的抗肿瘤作用.
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CPG-ODN介导活化的人免疫细胞体外抗乙型肝炎病毒作用
目的:探讨CpG-ODN活化的人外周血单个核细胞(PBMC)体外对HBV复制和表达的抑制作用.方法:CpG-ODN体外刺激PBMC,ELISA测培养液IFN-α及IFN-γ的分泌;将CpG-ODN介导活化的PBMC与HepG2.2.15细胞按一定比例共孵育1d、2d和3d后,ELISA检测培养上清液中HBsAg、HBeAg的分泌,荧光定量PCR检测HepG2.2.15细胞内HBV DNA和HBV mRNA的含量;并以MTT和酶学检测活化的PBMC对HepG2.2.15细胞的杀伤作用.结果:CpG-ODN有效诱导PBMC分泌IFN-α和IFN-γ;CpG-ODN本身虽不能直接抑制HBV的复制,但由CpGODN介导活化的PBMC却能显著减少HepG2.2.15细胞对HBsAg、HBeAg的分泌,同时对HBV DNA和HBV mRNA的抑制作用亦明显增强;CpG-ODN介导活化的PBMC对HepG2.2.15的杀伤作用增强.结论:CpG-ODN可通过活化机体免疫细胞,而具有明显的抗HBV复制和表达作用.
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转导单链免疫毒素基因的PBMCs对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤活性
目的:用携带分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因(sFv-TNF-α)的重组逆转录病毒感染人外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMCs),使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白,观察转导的PBMCs对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用.方法:用感染生重组病毒产生细胞C22(PA317/PST)产生的病毒上清转导人PBMCs,采用PCR和RT-PCR方法对转导的PBMCs(PBMCs/PST)进行DNA和mRNA水平的分析.PBMCs/PST与SMMC-7721共培养,MTT法检测PBMCs/PST表达产物对肝癌细胞的体外杀伤活性.结果:PCR及RT-PCR结果显示PBMCs/PST中扩增出外源目的基因对应的电泳条带.MTT法检测结果,分泌型抗肝癌单链免疫毒素对体外培养肝癌细胞SMMC-7721的杀伤率为(38.2±6.7)%.结论:分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因可以在PBMCs中整合并稳定表达,其分泌的表达产物对 SMMC-7721具有一定的体外杀伤作用.
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抗肝癌单链免疫毒素基因修饰的PBMCs在动物体内的抑瘤作用
目的:用携带分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因(sFv-TNF-α)的重组逆转录病毒感染人外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMCs),使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白,观察转导的PBMCs/PST静脉注射后对荷肝癌裸鼠的抑瘤作用.方法:分离正常人PBMCs并用PHA和IL-2进行体外刺激培养,用感染性重组病毒产生细胞C22(PA317/PST)产生的病毒上清转导后,经尾静脉输入荷肝癌裸鼠体内,注射细胞数为每只1×106(0.2 mL),每5 d注射1次,共注射3次.定期观察记录肿瘤生长情况,注射3次后处死,取出瘤组织称质量、记录,进行统计学处理,并制备石蜡切片进行常规HE染色及免疫组化染色观察.结果:实验组肿瘤生长速率为(20.8±4.9)mg/d,对照组为(28.5±6.7)mg/d,经t检验,P<0.05.结论:经重组逆转录病毒转导的PBMCs/PST在课鼠体内对人肝癌细胞系SMMC-7721移植瘤具有一定的生长抑制作用.
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oxLDL对正常人外周血单个核细胞LOX-1及uPAR表达的影响
目的:探讨不同时间点不同浓度oxLDL对正常人外周血单个核细胞uPAR、LOX-1蛋白的表达情况的影响。
方法:选取正常人外周血经Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),用含20%自体血清的RPMI1640完全培养基培养。Western Blot方法检测不同浓度oxLDL对正常人单个核巨噬细胞干预24 h,72 h的uPAR、LOX-1的蛋白表达。统计分析:western blot以TotalLab Quant软件进行积分光密度值分析。统计分析,计量资料以Mean±SE表示,组间比较以one-way ANOVA进行分析,两组比较采用t检验,P<0.05则有统计学意义。 -
曲古抑菌素A对恶性淋巴瘤抗癌作用的研究
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)为新一代具有广泛应用前景的抗肿瘤药,可抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞分化和凋亡,并可发挥免疫调节作用[1].曲古抑菌素A(TSA)源自链霉菌代谢产物,先作为抗真菌药物使用,近来研究表明其具有明显的HDACI活性,对肝癌、胃癌、口腔癌及神经母细胞瘤等肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用[2],然而有关其对淋巴瘤细胞生长作用的报道较少.本实验主要研究TSA对B细胞非霍奇金淋巴瘤的Raji细胞与正常人外周血单个核细胞(NPBMNC)的细胞毒作用.
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过氧化物增生体激活型受体-γ激动剂对白细胞介素-6表达的影响
本研究通过观察同型半胱氨酸(HCY)对人外周血单个核细胞(PBMC)白细胞介素(IL)-6表达及过氧化物增生体激活型受体(PPAR)-γ激动剂对其的干预作用,为防治慢性血液透析患者动脉粥样硬化(MIA)综合征提供新的思路.
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人外周血单个核细胞向血管样细胞分化的体外研究
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卡维地络对人外周血单个核细胞TNF-αmRNA、IL-6mRNA转录的影响
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调节性树突状细胞在免疫反应中的作用
树突状细胞(dendritic cells,DC)是专职的抗原提呈细胞(APC),起源于骨髓CD34+造血祖细胞,在各种细胞因子的刺激下分化为前体DC(pDC)、未成熟 DC(iDC)和成熟 DC(mDC).DC广泛分布于脑以外的全身组织和脏器,数量较少,仅占人外周血单个核细胞的1%.DC是一类高度异质性的APC,因其在先天免疫或启动获得性免疫中的重要作用,一直受到免疫学家的重视.DC对免疫反应的作用决定于其在体内的分布位置、分化程度及其表达的细胞因子,且根据其不同的细胞表面标记区分为不同的亚型.DC对免疫系统的作用终是由其对"下游"细胞(如B细胞或T细胞)的作用体现出来的.
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趋化因子信号对人外周血单个核细胞的免疫活化作用
我们以健康人外周血单个核细胞(PMNC)作为研究对象,观察重组人RANTES(rhRANTES)刺激后PMNC的增殖反应和淋巴细胞表型变化,以及PDTC和CTLA4Ig对免疫活化效应的影响.