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CFSE/PI双标法检测CIK细胞对顺铂预处理肿瘤细胞的杀伤活性
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞,具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点.如何对CIK细胞的效应功能进行客观准确的评价,如何使CIK和化疗有机地结合在一起,对CIK的临床应用具有重要的意义.
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精子功能检测技术的应用浅析
人的体外受精初由Roek和Menkin(1944年)进行实验,他们从卵巢取出卵子,培养后与精液共孵育45小时,133个卵子有4个受精,并达到2~3个卵裂球阶段.继而,由Schettles(1955年)将卵子与精子共同培养,并在培养液中加入输卵管液,发现部分受精卵发育到桑葚胚阶段.
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CIK细胞及其中穿孔素在抗肿瘤中的作用
细胞免疫比体液免疫在抗肿瘤效应中发挥着更重要的作用.细胞毒性T细胞(CTL)和NK细胞杀伤靶细胞的作用机制已较清楚,主要是通过细胞直接杀伤和分泌抗肿瘤细胞因子两种途径.在抗肿瘤的细胞免疫应答中CTL及NK细胞起着重要作用.CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3,McAb,IL-2,IFN-γ,IL-1α)共同培养诱导后获得的一群异质细胞.由于该细胞同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点.
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肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养时的肝细胞功能
目的:利用原代培养的大鼠肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,研究骨髓间质干细胞对肝细胞功能的影响,以便更好用于肝细胞移植及生物人工肝.方法:采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离大鼠旰细胞,获得有活性生的肝细胞进行原代培养.台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活性;光镜下动态观察细胞形态学改变,并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能.比较肝细胞单纯培养及其与骨髓间质干细胞共同培养时细胞的功能.结果:培养7 d时两组均仍然维持白蛋白分泌及尿素合成功能;共同培养组与单纯肝细胞培养组在白蛋白分泌(13.75>2.179,P<0.05)及尿素合成功能(7.27>2.179,P<0.05)存在显著性差异,共同培养组明显高于单纯培养组.结论:肝细胞与骨髓间质干细胞共同培养,可以使肝细胞维持特异性功能,提高肝细胞活性.
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幽门螺杆菌对肝细胞系HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA表达的影响
目的:研究幽门螺杆菌(H pylori)处理对肝细胞系HepG2cyclinD1,PCNA mRNA表达的影响.方法:将H pylori与HepG2共同培养1 h、3 h、6 h、12 h和24 h,采用半定量RT-PCR方法分析共培养不同时间后HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA的表达水平.结果:CagA++H pylori与HepG2细胞共同孵育1 h后,即可见cyclinD1 mRNA表达升高,3h达高峰,约为对照的4.0倍(P<0.01);共同孵育3 h后即可见PCNA mRNA表达升高,6h达高峰,约为对照的2.0倍(P<0.05).而CagA-Hpylori和HepG2细胞共同孵育后,未见两基因的表达升高.结论:CagA+H pylori能诱导HepG2 cyclinD1,PCNAmRNA表达升高,提示其在肝癌的发生中起一定作用.
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生物人工肝研究的若干新进展
生物人工肝的研究在近年取得了较大进展.聚氨酯泡沫(PUF)等新型材料用于肝细胞培养、肝细胞与骨髓细胞共同培养以及肝细胞生长因子的应用对肝细胞的生长与代谢是有益的;培养液中添加激素与氨基酸有助于恢复受血浆损伤肝细胞的功能;甘氨酸及ZVAD-fmk等细胞保护剂有益于维持生物人工肝的代谢功能;甲磺酸萘莫司他(NM)可预防FHF血浆对肝细胞的损伤作用,保持猪肝细胞在FHF患者血浆中的活性,使猪肝细胞生物人工肝性能进一步增强;纤维膜孔隙、膜组成成分及暴露时间是影响猪内生逆转录病毒(PERV)跨膜传播的主要因素;生物人工肝的疗效得到进一步验证;一些学者对物理型人工肝或/和中间型人工肝与生物人工肝组成的混合型生物人工肝进行了新的尝试.
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TNF-α影响肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的表达
目的:探讨肿瘤坏死因子(TNF-o)对肠黏膜上皮细胞间紧密连接的影响.方法:应用免疫荧光方法检测在肿瘤坏死因子(TNF-α)0,50,100和200 μg/L作用下,与结肠癌上皮细胞株(CaCo2细胞株)共同培养24 h,以及用TNF-α100μg/L与CaCo2细胞共同培养0,4,8和24 h,观察TNF-α对紧密连接蛋白(zonula occluden 1,ZO-1)表达的影响.并应用半定量RT-PCR方法检测TNF-α用上述相应的时间和浓度作用后对肠黏膜上皮细胞ZO-1 mRNA表达的影响.结果:用TNF-α100和200μg/L作用24h后ZO-1的免疫荧光明显减少,并呈剂量依赖性;用TNF-α 100 μg/L作用24 h时ZO-1免疫荧光明显减少,并呈时间依赖性.应用半定量RT-PCR的方法检测结果:TNF-α作用24 h时,ZO-1 mRNA从TNF-α 0 μg/L的1.1926降至100 μg/L的0.7834和200 μg/L的0.7081;TNF-α100 μg/L作用4 h,ZO-1mRNA为(95.5±5.5%);8 h为(82.0±5.4%);24 h降至低为(67.7±5.7%),与对照组相比P<0.01.结论:TNF-α是通过抑制肠上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1表达引起肠黏膜上皮细胞间紧密连接破坏.并且是通过抑制ZO-1 mRNA引起肠上皮细胞ZO-1蛋白表达降低.
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中药复方胃康宁对人胃癌细胞VEGF及其受体表达的作用
目的:研究胃癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flt、KDR的表达与中药胃康宁的调控作用.方法:以不同剂量的中药复方胃康宁制剂给SD大鼠灌胃制备含药血清,然后以含药血清培养胃癌细胞,共同培养两代后,分别用免疫组化法和RT-PCR检测不同剂量组胃癌细胞中VEGF及其受体Flt、KDR的表达情况.结果:与对照组(VEGF162.78±0.58,Flt:172.65±0.65)相比,VEGF及其受体Flt在用药组胃癌细胞中的表达减弱,染色变浅(VEGF:186.82±0.22,195.35±0.45,1 72.62±0.52,Flt:198.44±0.44,188.66±0.46,197.01±0.91,P<0.05),并且与用药剂量有一定的关系;VEGF mRNA及其受体Flt mRNA、KDR mRNA在用药组胃癌细胞中的表达也受到抑制.结论:中药胃康宁对胃癌细胞血管内皮生长因子及其受体Flt、KDR的表达有抑制作用.
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幽门螺杆菌对人肝细胞系HepG2细胞蛋白质组的影响
目的:初步观察Hpylori对人肝细胞系HepG2蛋白质的差异表达,为进一步探讨Hpylori对肝细胞的病理作用机制奠定基础.方法:将Hpylori与HepG2共同培养6 h,采用双向电泳技术,对Hpylori处理和未处理HepG2细胞蛋白质进行分离和比较分析.结果:图像分析探测到Hpylori处理前后HepG2 2-DE图谱的平均蛋白质点数分别为988±94个、996±68个,蛋白质点的匹配率为86.4%.发现对照和H pylori处理HepG2蛋白表达有明显差异,主要是蛋白表达量的增加和减少,其中在Hpylori处理后有10种蛋白(Mr/pI:91 326/6.21,90 640/6.68,87 833/5.65,81 139/6.55,63 805/6.24,60 445/7.38,47 592/5.28,46 293/7.21,43 415/7.64,21 704/5.66)表达增强,8种蛋白(Mr/pI:70 839/7.02,56 403/6.58,44 076/6.86,43 744/7.21,42 497/6.64,37 567/7.17,22 342/7.49,21 112/5.63)表达降低.结论:Hpylori处理前后HepG2的蛋白质组具有差异,这些差异表达的蛋白质可能参与了Hpylori对肝细胞的病理作用过程,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究Hpylori与人类肝脏疾病的关系.
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间充质干细胞用于慢性创面治疗的作用途径及其相关机制
间充质干细胞(MSCs)是一类存在于大多数成体器官中的类成纤维细胞群,在特定条件下能够向不同的谱系细胞分化。Falanga等[1]将 MSCs 与造血细胞共同培养,发现 MSCs可以促进造血干细胞的增殖,提示 MSCs 具有分泌生物活性因子并调节其他细胞功能的能力。MSCs 在进入创面或是其他损伤组织时会被激活,起到促进创伤愈合和改善局部缺血的作用。目前 MSCs 作用于创面的机制尚未完全清楚,但MSCs在调节免疫应答和免疫排斥反应方面的功能,以及在促进创面愈合和减少瘢痕形成等方面的重要作用均已得到证实。本文就MSCs治疗皮肤慢性难愈性创面的常用方法及其在细胞及分子水平上可能涉及的作用机制综述如下。
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人成骨细胞与外周血单核细胞共同培养诱导破骨细胞样细胞
目的探讨人外周血单核细胞与原代人成骨细胞共同培养体外转化为破骨细胞样细胞的条件,并观察其体外生长、功能情况.方法分别分离培养人成骨细胞,外周血单核细胞,并在含1,25(OH)2D3(10-7 mol/L),地塞米松(10-8 mol/L)及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(25 ng/ml)的条件液中共同培养,用相差显微镜,抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)观察破骨细胞样细胞生长情况,应用扫描电镜(SEM)观察骨片陷窝以反映其功能.结果共同培养中的单核细胞逐渐融合;TRAP染色阳性多核细胞在第7天明显增多;骨片陷窝呈现多种形态.结论人原代成骨细胞与人外周血单核细胞共同培养可以诱导出破骨细胞样细胞,但应该选择分化程度较低的细胞以及控制接种密度.
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体外分层渗透共培养研究胆管癌细胞株QBC939对正常内皮细胞的作用
目的 在体外分层渗透共培养体系中研究胆管癌细胞对正常内皮细胞的作用.方法 建立胆管癌细胞株QBC939与正常内皮细胞的体外分层渗透共培养体系,以同期单独培养的正常内皮细胞为对照,用免疫荧光法检测内皮细胞与胆管癌细胞共培养后,内皮细胞F-actin,pp125FAK,蛋白水解酶MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达变化,用Realtime PCR,Western印迹检测内皮细胞共培养前后,ppl25FAK,MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA及蛋白表达变化.结果 与同期单独培养的正常内皮细胞对照相比,内皮细胞F-actin表达增强,pp125FAK、MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA及蛋白表达增加(P<0.01).结论 胆管癌细胞能通过旁分泌作用导致内皮细胞骨架系统改变,并能诱导内皮细胞蛋白水解酶的基因表达及蛋白合成,表明肿瘤细胞对邻近内皮细胞还可以通过肿瘤细胞的内分泌、旁分泌等作用分泌各种细胞因子,作用于内皮细胞上的特异性受体,发挥其对内皮细胞mRNA表达的调控作用,而导致内皮细胞发生形态、行为的改变.
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乙型肝炎病毒促进肝星状细胞纤维化因子的表达
目的 研究HepG2.2.15细胞株在体外能否促进肝星状细胞(HSC)中肝纤维化相关因子的表达,进而探索HBV促肝细胞纤维化的机制.方法 将HepG2和HepG2.2.15细胞株分别在体外与HSC共培养,以单独培养的HSC为对照组.取培养后24、48和72 h 3个时间点,以实时定量PCR检测HSC中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)mRNA的表达;以免疫印迹法定量检测HSC中MMP-2和TIMP-1的表达.结果 与对照组和与HepG2共培养的HSC比较,与HepG2.2.15细胞株共培养的HSC中MMP-2和TIMP-1 mRNA的表达明显增高,以72 h的差异为显著(F值分别为11.91和23.13,P值分别为0.008和0.001);与HepG2.2.15共培养的HSC中MMP-2和TIMP-1蛋白的表达亦明显增高(F值分别为20.70和6.54,P值分别为0.002和0.03).结论 与HepG2.2.15细胞株共培养后,HSC中肝纤维化相关因子的表达明显增强.体外试验证明HBV具有诱导肝细胞纤维化的重要作用.
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腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子基因在体外骨髓基质干细胞中的表达及其生物学活性实验研究
本研究中我们将腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子(Adv-GDNF)基因感染体外培养的骨髓间质干细胞(BMSCs), 从基因转录水平检测GDNF在体外BMSCs中的表达.同时我们还将体外感染的BMSCs与脊髓背根神经节共同培养,间接观察了BMSCs表达的GDNF的生物学活性.
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卵巢上皮性癌细胞培养上清液增强CD+4CD+25调节性T淋巴细胞增殖及免疫抑制功能的实验研究
CD+4CD+25调节性T淋巴细胞是一类具有抑制CD4+和CD8+T淋巴细胞活化和增殖功能的免疫调节细胞.近的研究发现,在卵巢上皮性癌(卵巢癌)患者外周血及腹腔内,这类细胞的比例显著增加,可能是卵巢癌患者免疫功能下降和生存率低下的重要原因之一[1].我们先前的体外实验也证实,卵巢癌细胞株SKOV3的培养上清液和健康人外周血淋巴细胞共培养后,能诱导其中的CD+4CD+25调节性T淋巴细胞比例增加[2].为了进一步阐明其机制,我们将卵巢癌细胞培养上清液和纯化的CD+4CD+25调节性T淋巴细胞共同培养,观察其增殖、表型及功能是否发生改变.
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蛛网膜细胞与血性CSF共同培养后HLA-DR的表达变化
目的 研究蛛网膜细胞(Ar细胞)与血性脑脊液(CSF)共同培养后人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)的表达变化.方法 (1)Ar细胞的培养、鉴定和HLA-DR基础表达的观察.(2)采用Ar细胞和血性CSF共同培养的方法,用流式细胞仪(FCM)和免疫荧光染色观察Ar细胞HLA-DR的表达改变. 结果 95%以上培养的Ar细胞均有HLA-DR的基础表达.在血性CSF刺激下,Ar细胞HLA-DR的表达明显增强,免疫荧光法和FCM检测出了一致的时间表达变化模式,在1-5d呈基础表达状态;6d左右表达开始升高;7d、8d表达显著增强,此时荧光颗粒数量和强度高,阳性细胞数可达61.2%;第9天后表达逐渐降低,阳性细胞数减少,第10天时减低至12.5%,荧光数量和强度亦明显降低. 结论 在血性CSF刺激下,Ar细胞通过HLA-DR表达增高,可以发挥抗体提呈细胞(APC)的功能,提示其可能与SAH并发症尤其是迟发性脑缺血(DCI)的发生机制相关.
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巨噬细胞对血管内皮细胞周期和VEGF受体、HOXB2 mRNA表达的影响
目的研究巨噬细胞调节内皮细胞参与血管生成的机制.方法将人脐静脉血管内皮细胞系(ECV-304)细胞接种培养,待细胞60%融合时,以刀豆蛋白A(Con A)作为人巨噬细胞系U937的激活剂,将细胞分为4组进行培养,即单纯ECV-304培养组(对照组),Con A与ECV-304共培养组,U937与ECV-304共培养组,Con A、U937与ECV-304共培养组.于共培养48h后在倒置显微镜下观察细胞形态学的变化;用流式细胞仪检测细胞周期的变化;用RT-PCR技术检测内皮细胞VEGF受体KDR和同源盒(homeobox)HOXB2 mRNA表达水平的变化.结果 Con A刺激的U937细胞使内皮细胞间隙变大,细胞出现明显的类似神经元样的突起,形态不一,且S期明显增加(P<0.01),并使内皮细胞VEGF受体KDR和HOXB2 mRNA的表达水平明显上调(P<0.01).结论 Con A活化的巨噬细胞通过影响内皮细胞的形态、细胞周期、KDR及HOXB2 mRNA的表达来促进内皮细胞的增殖和迁移,从而调节血管的生成.
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嗜酸性粒细胞对支气管上皮细胞中p38 MAPK信号转导通路的活化作用观察
目的 探讨嗜酸性粒细胞在与支气管上皮细胞接触共培养过程中对后者炎性介质释放的影响.方法 用CD16抗体磁珠法分离嗜酸性粒细胞,免疫印迹(Western blotting)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管上皮细胞中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、激活转录因子(ATF)-2蛋白含量,微珠免疫沉淀结合免疫印迹法检测p38 MAPK活性.结果 经与嗜酸性粒细胞共同培养活化后,支气管上皮细胞中磷酸化p38 MAPK蛋白含量及其活性均显著上升,p38 MAPK信号转导通路链中下级底物蛋白质ATF-2(细胞内调控某些基因表达的转录因子)量也显著上升;多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞同样可以活化支气管上皮细胞,增加其细胞内p38 MAPK蛋白质磷酸化.p38 MAPK酶选择性抑制剂SB 203580可有效抑制p38 MAPK诱导其底物ATT-2磷酸化.结论 嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞接触共培养过程中对炎性介质表达和释放的调控作用可能是通过活化支气管上皮细胞内p38MAPK信号传导通路未实现的.
关键词: p38丝裂原活化蛋白激酶 上皮细胞 支气管 嗜酸细胞 共同培养 -
与原代皮层细胞共培养促进PC12细胞在NGF诱导下向神经元分化
目的建立体内细胞移植环境的体外共培养系统,研究原代皮层神经细胞对PC12细胞向神经元分化的影响.方法将绿色荧光蛋白(GFP)标记的PC12细胞植入原代神经细胞建立共培养系统,并以神经生长因子(NGF)诱导其中的PC12细胞向神经元分化,同时以单独培养的PC12细胞作为对照.激光共聚焦显微镜观察共培养体系及对照组中PC12细胞的分化和神经突起的形成情况.结果与原代皮层细胞共培养的PC12细胞受NGF诱导后,分化的比例更高(由57.13%提高到67.77%,P<0.01);数量多于对照组(由3.11提高到4.07,P<0.001);神经突起的长度明显高于对照组(由146.34μm提高到272.17μm,P<0.001).结论与原代皮层细胞共培养有利于PC12细胞在NGF作用下分化为神经元样细胞及形成神经突起.
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混合表皮细胞与脱细胞真皮基质构建复合皮的移植和转归研究
探讨混合表皮细胞与脱细胞真皮体外构建的复合皮作创面移植后的转归.将BALB/c小鼠的表皮细胞和人表皮细胞按一定比例混合,种植于脱细胞真皮基质表面,经体外培养后形成复合皮,然后移植于BALB/c小鼠全层皮肤缺损创面,观察人表皮细胞的转归.结果显示,复合皮移植后可封闭创面,人表皮细胞多位于新生表皮上层,随时间延长,数量逐渐减少并终被小鼠自体表皮细胞替代.提示两种不同的表皮细胞按一定比例混合培养构建复合皮可封闭全层皮肤缺损创面,可望节省自体皮源,缩短体外培养时间.