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猪逆转录病毒与生物人工肝的使用
生物型人工肝(bioartificial liver,BAL)或组合型生物人工肝(hybridbioartificial liver,HBL),是目前国内外公认接近自然肝脏,功能也全面的人工肝脏支持系统[1].所谓生物型人工肝,就是在整个治疗系统中包含有活的肝细胞或组织,因此具有相应生物活性的人工肝支持系统.在生物人工肝领域,因为猪解剖、生理特点与人类相似,猪细胞来源广泛,经济适用,因此目前应用多的生物部分是猪肝脏细胞.但目前已知,作为异种细胞猪肝细胞内存在着猪内源性逆转录病毒(porcine endogenousretrovirus,PERV),有引起生物人工肝治疗患者PERV感染的危险.因此,本文就猪内源性逆转录病毒及猪源性生物人工肝的安全性问题作一简要总结.
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培养于TECA型生物人工肝的猪肝细胞生物转化功能的测定
了解培养于TECA型生物人工肝(BALSS)中猪肝细胞活性和生物转化功能的变化.将新鲜分离的特种猪肝细胞培养于TECA-BALSS的生物反应器中,通过BALSS中空纤维管膜与含盐酸利多卡因的RPMI-1640培养液进行6h交叉灌流.对照组BALSS内无猪肝细胞.采用胎盘蓝染色法测定肝细胞活率.用高压液相法测定利多卡因浓度.结果显示:猪肝细胞在TECA-BALSS中培养6h时,其细胞活率达89.7%;随着交叉灌流时间的增加,其体液环路中的盐酸利多卡因浓度逐步下降,6h时的转化率达80%,显著高于无肝细胞对照组的转化率2.5%(P＜0.01).这表明采用TECA-BALSS可大量的培养猪肝细胞,不仅肝细胞能维持较高的存活率,并能发挥肝细胞的生物转化功能.
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壳聚糖纳米纤维支架对猪肝细胞分泌猪内源性逆转录病毒的影响
探讨壳聚糖纳米纤维支架对肝细胞的PERV分泌量以及其感染性的影响.将新鲜分离的猪肝细胞接种于壳聚糖纳米纤维支架或普通条件下连续培养7d,分为实验组（Nano组）和对照组（Hep组）.每天收集培养液检测逆转录酶(RT)活性,并通过RT-PCR和实时定量PCR测定PERV RNA水平.通过western blot检测细胞裂解液中PERV gag 30蛋白含量.细胞培养液体外孵育HEK293细胞以测定其感染性.结果表明:实时定量PCR、RT活性以及western blot具有相似的变化趋势.在体外培养10 h和2d出现PERV分泌高峰然后逐渐下降.除第6dPERV RNA水平和第5d蛋白水平实验组明显高于对照组外,其余均无明显差异.体外感染实验无HEK293细胞感染.壳聚糖纳米纤维支架会延长猪肝细胞的PERV分泌时间但对分泌量以及体外感染性并无明显影响,可安全用于生物人工肝.
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原代小型猪肝细胞微载体培养及其功能特性
目的研究原代小型猪肝细胞微载体培养方法的建立及肝细胞功能特性.方法将3.20×107个的肝细胞及2g/L cytodexTM 3微载体连同40ml含100ml/L Hyclone小牛血清及其他辅助因子的RPMI 1640培养基加入250ml已硅化的方瓶中培养.对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察.同时测定不同培养时期肝细胞生物合成及生物转化功能.结果肝细胞产量为6.8×109～8.1×109(7.58±0.57)×109/肝细胞;肝细胞活率为92.0%～99.0%(96.25%±3.10%);肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;接种培养后肝细胞呈明显的朝CytodexTM 3聚集,二者易相粘贴,粘附在微载体上的肝细胞增殖生长旺盛;当肝细胞数为3.20×107个时,接种后24h肝细胞尿素及白蛋白合成量分别为1.22mmol/L及0.075g/L;随着时间的延长,利多卡因的转化率逐渐增加,在24h时即达到100%.结论使用微载体培养的小型猪肝细胞具有较旺盛的增殖生长能力、良好的生物转化及生物合成功能,可作为体外生物人工肝较为理想的细胞来源.
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原代猪肝细胞PERV检测及其意义
目的:探讨猪肝细胞内源性逆转录病毒(PERV)检测方法及意义.方法:采用体外二步灌流法获取猪肝细胞,使用特异性引物对其前病毒序列进行观察;以未逆转录PCR为对照,采用RT-PCR方法检测原代猪肝细胞PERV携带及释放情况,并用套式RT-PCR对扩增产物进行鉴定.结果:原代猪肝细胞基因组中可检测到PERV前病毒序列,肝细胞中亦可检测到特异性的PERV RNA序列.在缺乏有丝分裂原刺激的情况下,猪肝细胞普通培养的不同时段均可检测到病毒释放,并可持续至细胞死亡.结论:中国实验小型猪肝细胞携带PERV病毒序列,猪肝细胞普通培养时可释放该病毒,其感染性及生物安全性尚需进一步研究.
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原代小型猪肝细胞的分离培养及其功能
目的:研究原代小型猪肝细胞的分离、培养及肝细胞的形态学变化及其功能特性.方法:用体外灌流装置,DTA和胶原酶两步灌流法消化分离小型猪肝细胞.在含100 ml/L小牛血清及其附助因子的RPMI 1640培养基中培养.对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察.同时测定不同培养时期肝细胞生化合成及生物转化功能.结果:(1)肝细胞产量为6.0×109～8.2×109(7.0 × 109±0.79×109)/每只猪肝;(2)肝细胞活率为90.0～99%(94.4±3.07%);(3)肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;(4)接种培养后肝细胞增生生长旺盛;(5)接种后20 h内每107个肝细胞尿素及白蛋白的合成量分别为1.21～1.50 mmol/L及0.58～0.80 g/L;(6)肝细胞数在1.25×107个～1.60×107个时,利多卡因的转化率在24 h时均在80%以上,随着时间的延长及肝细胞数的增多,利多卡因的转化率逐渐增加.结论:本方法分离获取的肝细胞产率高、活性高、增生生长旺盛、具有良好的生物合成及生物转化功能,可作为生物人工肝较为理想的细胞来源.
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生物人工肝研究的若干新进展
生物人工肝的研究在近年取得了较大进展.聚氨酯泡沫(PUF)等新型材料用于肝细胞培养、肝细胞与骨髓细胞共同培养以及肝细胞生长因子的应用对肝细胞的生长与代谢是有益的;培养液中添加激素与氨基酸有助于恢复受血浆损伤肝细胞的功能;甘氨酸及ZVAD-fmk等细胞保护剂有益于维持生物人工肝的代谢功能;甲磺酸萘莫司他(NM)可预防FHF血浆对肝细胞的损伤作用,保持猪肝细胞在FHF患者血浆中的活性,使猪肝细胞生物人工肝性能进一步增强;纤维膜孔隙、膜组成成分及暴露时间是影响猪内生逆转录病毒(PERV)跨膜传播的主要因素;生物人工肝的疗效得到进一步验证;一些学者对物理型人工肝或/和中间型人工肝与生物人工肝组成的混合型生物人工肝进行了新的尝试.
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培养猪肝细胞型生物人工肝的研究进展
生物人工肝研究的主要细胞材料是人肝细胞、肝肿瘤细胞株和猪肝细胞,但由于人肝细胞来源匮乏以及肿瘤细胞株潜在的不安全性,培养猪肝细胞型生物人工肝已经逐步成为人工肝研究和临床应用的主要对象.文章主要介绍了培养猪肝细胞型生物人工肝的动物实验、临床应用以及其生物安全性,同时探讨了该型生物人工肝存在的问题和应用前景.
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生物人工肝细胞材料研究进展
肝细胞是生物人工肝(bioartificial liver,BAL)中的核心生物成分,其研究颇受国内外学者的重视.猪肝细胞具有类似人肝细胞的高代谢功能,在BAL中可作为人肝细胞的替代品.重组具有氨清除等功效的人肝细胞系在BAL中取得了较好成效,具有一定的应用前景.为了探索一种永生化的、无致瘤性的、有分化功能的人肝细胞系,作为BAL生物成分的理想细胞来源,国外学者研究设计了一种可回复性永生化程序,为解决细胞材料问题提供了新的思路和手段.肝非实质细胞及某些种类细胞,对维持肝细胞的三维结构的生存环境,改善肝细胞的代谢活性和存活起重要作用,与肝细胞混合培养后明显促进肝细胞的增生和分化,其在BAL系统中的潜在价值已逐渐引起注意.然而,肝细胞的增生、长期培养、功能维持及人源肝细胞的严重短缺等都是亟待解决的问题.
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生物人工肝治疗猪实验性急性肝衰
目的初步探讨BAL治疗ALF的方法与效果,为进入临床Ⅰ期试验提供依据.方法构建包括双泵、肝素化、恒温、微囊化活性炭吸附及肝细胞生物反应器-中空纤维管的BAL循环系统,在循环回路中采用高流量再循环技术.将实验动物随机分成对照组(无肝细胞灌流组)与治疗组(肝细胞灌流组)两组.在细胞准备、模型制作及BAL循环系统安装完成后,对照组及治疗组分别进入实验.通过组间肝脏生化指标、生存时间及肝脏病理改变的差异性分析,判别BAL的体外肝脏支持效能.结果与对照组相比较,治疗组生化指标TBil,Alb,Amm,BUN,Cr,PT,Fib的变化水平差异显著,ALT,AST无差异,生存时间差异显著,肝脏病理改变无差异.结论原代正常猪肝细胞-中空纤维BAL可产生维持生命的多种肝功能,治疗猪ALF是有效的.
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膜截流分子量在新型生物人工肝免疫安全性中的作用研究
目的 探讨膜截流分子量对新型生物人工肝(bioartificial liver,BAL)支持系统免疫安全性的影响.方法 应用D氨基半乳糖静脉滴注比格犬建立肝功能衰竭模型.急性肝功能衰竭犬根据BAL隔离膜截流分子量的大小分为两组:A组:200 kD组；B组:1200 kD组.两组均接受新型2次BAL治疗,每次6h.观察各组体内IgG、IgM、50％补体溶血单位(CH50)变化及反应器内抗体漏过情况.结果 在第一次BAL治疗后两组的IgG和IgM水平均没有发生明显的变化.在第2次治疗后第7天,1200 kD组的IgG和IgM水平明显升高,200 kD组IgG和IgM水平仍未出现明显上升或下降.在第一次BAL治疗后,两组CH50都出现暂时性的下降,在治疗后1h达到低值,而后缓步上升,在7d后恢复至治疗前水平.反应器内培养液中IgG、IgM及CH50检测结果显示,1200 kD组在治疗结束后IgG、IgM及CH50含量显著高于200 kD组.结论 膜截流分子量可能是影响BAL异种免疫排斥的重要因素之一.
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大规模猪肝细胞低温保存方法的建立
目的建立大规模猪肝细胞的低温保存方法以满足生物型人工肝治疗的需要.方法用酶法从中国实验用小型猪肝脏分离出猪肝细胞;加入本实验室配制的含有10%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的营养液中;分别采用两种降温方法使(1～2)×1010猪肝细胞保存在-196℃液氮中;1个月后复温,观察在同一条件下培养不同时间后猪肝细胞形态、存活率和白蛋白、尿素、葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能.结果用两种降温方法保存的肝细胞,复温后细胞的存活率均较高(梯度降温组和程控降温组存活率分别较冻存前降低了4.7%和8.6%),其中前者肝细胞的尿素、葡萄糖合成功能较后者高.结论所建立的冻存方法简单易行,可保存大量的猪肝细胞.
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TECA生物型人工肝支持系统替代衰竭肝脏功能机制的实验研究
分析中国实验用小型猪肝细胞型生物人工肝支持系统(BALSS)替代衰竭肝功能的可能机制.使少肝急性肝衰(ALF)犬血液或1640培养液循环流经BALSS中空纤维管的内腔,与培养于中空纤维管外腔中的猪肝细胞营养液进行物质交换.测定1640液中利多卡因浓度、白蛋白和尿素浓度的变化;用蛋白电泳法测定1640液和猪肝细胞营养液中蛋白成分的变化;用透射电镜观察治疗ALF犬时BALSS中猪肝细胞超微结构的变化.结果显示BALSS循环6h时,1640液中利多卡因浓度明显降低;白蛋白和尿素浓度明显升高;分子量小于100kD的蛋白质成分明显增多.BALSS治疗ALF犬6h时,猪肝细胞的超微结构出现明显的损伤.提示此型BALSS的猪肝细胞通过透析膜可较好地发挥肝细胞的生物转化及合成代谢等功能,以此达到暂时替代衰竭肝脏功能的效应.
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高原猪肝细胞生物反应器的生物学活性
目的 了解在高原环境下,培养球形聚集体猪肝细胞中空纤维型生物反应器的生物学活性特征,为构建高原体外生物人工肝提供实验依据.方法 采用已适应本地高原环境的长白仔猪,并分离其肝细胞,经体外球形聚集体培养2 d后,移入中空纤维型生物反应器外腔中,内腔以培养液循环,继续培养10 d,观察培养细胞形态,检测外腔培养液中的总蛋白、白蛋白、尿素和乳酸脱氢酶水平变化.结果 经过2 d培养后,肝细胞形成了大量的结构较为稳定的球形聚集体;中空纤维反应器培养前,外腔培养液中总蛋白、白蛋白及尿素水平分别为(16.2±0.3)g/L、(5.9±0.3)g/L和(2.5±0.2)mmol/L,培养2 d后均呈现明显升高,差异有显著性(P＜0.05),4 d达高峰,分别为(22.7±2.4)g/L、(7.8±0.4)g/L和(4.6±0.5)mmoL/L,然后逐渐下降,培养8～10 d时明显低于4 d时水平;乳酸脱氢酶水平培养6 d时明显升高,差异有显著性(P＜0.05),8～10 d时进一步升高,差异有显著性(P＜0.05).结论 在高原环境条件下,以培养球形聚集体猪肝细胞2～6 d时制备的中空纤维型生物反应器的生物学活性良好,为进一步应用于构建高原环境下生物人工肝奠定了基础.
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猪逆转录病毒与生物人工肝及细胞移植
生物人工肝是近年国内外治疗重型肝炎及肝脏功能衰竭的研究热点,猪肝细胞因其来源广泛、功能稳定、解剖及生理与人相近、不易患病等优点成为目前生物人工肝及细胞移植使用较多的生物材料之一,但自报道猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染体外培养人细胞以来,跨种族间感染越来越引起人们的重视.本文拟就该病毒在生物人工肝及细胞移植中的研究进展综述如下.
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由猪肝细胞组成的人工肝支持系统的安全性问题
生物人工肝是近年国内外治疗重型肝炎及肝脏功能衰竭的新方法及研究热点.该方法是用体外培养的动物或人肝细胞暂时代替衰竭的肝脏,以期渡过衰竭期.由于猪的解剖、生理特点与人类相似,而且用于基因操作非常稳定,因此猪包括转基因猪是可能用于供体的动物.使用猪源性人工肝支持系统(XLSS)主要的缺陷有:(1)受体抗猪肝细胞的免疫反应;(2)猪肝细胞的生理功能及代替人肝脏的能力有限;(3)可能感染人畜共患疾病;(4)生命伦理学问题.本文主要介绍目前XLSS应用中争论的焦点.
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生物人工肝的安全性问题
以异种动物作为肝细胞来源的生物人工肝已进入临床试验阶段.本文从生物学评价以及使用动物肝细胞潜在风险角度讨论了生物人工肝的安全性问题.就生物人工肝的生物学试验、免疫反应、人畜共患疾病、生命伦理等问题展开讨论.
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聚砜膜生物反应器实验系统构建及对重型肝炎患者血浆的影响
背景:人工肝反应器性能的评价通常需要构建一个密闭实验装置模拟生物人工肝支持系统来对反应器内肝细胞的生物功能以及生物反应效率等进行综合评价,对聚砜膜中空纤维反应器的性能进行初步评价对优化生物人工肝支持治疗系统具有一定意义.目的:构建聚砜膜生物反应器实验系统,了解该系统对重型肝炎患者血浆的影响,观察聚砜膜中空纤维反应器作为生物人工肝反应器的可行性. 设计:重复测量实验.单位:第三军医大学西南医院全军感染病研究所.材料:选用7只新生1～7 d中国实验小型猪,雌雄不拘,由第三军医大学实验动物中心提供,许可证号码:F99017实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1试剂盒购自中国晶美生物工程公司;聚砜膜中空纤维反应器订制于中国上海德宏生物材料研究所;Cellco培养循环式人工毛细管培养系统购于美国Spectrum公司;7份重型肝炎患者血浆样本均取自住院慢性重型肝炎患者做血浆置换时分离的血浆.患者均对实验项目知情同意,实验经过医院伦理委员会批准.方法:实验于2004-01/2005-07在第三军医大学西南医院全军感染病研究所实验室完成.①实验过程:实验前12 h对实验猪进行断乳,清洁皮毛后分离肝细胞.将聚砜膜中空纤维反应器的内腔通过氧和二氧化碳弥散管与培养液贮池和Cellco培养液循环式人工毛细管培养系统连接成为密闭系统,外腔接口用洁净橡胶塞封闭. 用磁力搅动法将分离的肝细胞进行球形体培养,接种到本系统的聚砜膜中空纤维反应器外腔,然后加重型肝炎患者血浆样本200 mL于贮液池中,以80 mL/min的速度在反应器内腔及贮液池中循环.②实验评估:在循环的0,2,4,6 h从反应器内腔各取出2 mL循环液,用谷氨酸脱氢酶-紫外法检测上清中氨的水平,全自动生化分析仪上检测标本中总胆红素的含量,在全自动血凝仪上检测标本的凝血酶原时间,肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1的检测参照试剂盒说明书进行. 主要观察指标:聚砜膜生物反应器系统对重型肝炎患者血浆的血氨、胆红素、凝血酶原时间、肿瘤坏死因子α及转化生长因子β1的影响. 结果:①血氨、总胆红素、凝血酶原时间检测结果:重型肝炎患者血氨水平持续降低, 0～2 h下降明显,其后血氨水平下降趋势减缓;总胆红素水平持续降低,6 h的总胆红素水平明显低于0 h,差异有显著性意义 (P < 0.05);凝血酶原时间持续降低,6h的凝血酶原时间较0 h降低,差异具显著性意义(P < 0.05).②肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1检测结果:重型肝炎患者血浆的肿瘤坏死因子α及转化生长因子β1含量持续降低,其中6 h均明显低于0 h,差异具显著性意义 (P < 0.05). 结论:砜膜生物反应器实验系统能够清除重型肝炎患者血浆中的小分子有毒物质,补充有益成分,降低细胞因子水平,可作为生物人工肝反应器.
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原代猪肝细胞无血清培养
目的 研究原代猪肝细胞无血清培养及肝细胞的功能.方法 采用EGTA和胶原酶P两步法经肝静脉逆行灌注分离乳猪肝细胞,在无血清培养基中培养,并对不同培养时间的肝细胞生化合成及生物转化功能进行检测.结果 肝细胞产量为(1.5±0.1)× 1010/肝,活率为(90.3±1.5)%.接种培养后肝细胞增生旺盛,LDH漏出第2天达到高峰,然后逐渐下降并稳定于一定水平.随着时间的延长及肝细胞数量的增加,白蛋白合成及利多卡因转化率逐渐增加,呈时间及肝细胞数量的依赖关系.结论 采用本法分离获取的猪肝细胞产率高、活性强、具有良好的生物合成及生物转化功能,可作为生物人工肝较理想的肝细胞来源.
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冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中生存状态研究
目的研究冷冻复温后猪肝细胞在生物型人工肝支持系统(BALSS)中的生存状态.方法用酶法从中国实验用小型猪肝脏分离猪肝细胞,将1×1010猪肝细胞冷冻保存在-196℃液氮中,1个月后复温,将等量冷冻和新鲜猪肝细胞分别培养在BALSS中,比较其形态、存活率和白蛋白、尿素、葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能.结果冷冻保存的猪肝细胞,复温后存活率较高,在培养于BALSS时其生化功能、利多卡因转化功能及超微结构与新鲜肝细胞类似.结论用冻存方法保存猪肝细胞可试用于BALSS系统.
