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建立引物双标记的聚合酶链反应-酶联免疫吸附法检测军团菌mip基因
建立一种新的检测嗜肺军团菌mip基因的引物双标记聚合酶链反应-酶联免疫吸附(PCR-ELISA)法,应用于豚鼠军团菌感染的早期检测和诊断.其方法是将一对嗜肺军团菌引物分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素,经PCR扩增后,将标记有生物素的PCR扩增产物加入链酶亲和素包被的微孔板中,洗去未结合物后直接加入碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体,待与荧光素结合后,再加入底物产生显色反应,ELISA仪测得A值.
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血管紧张素转移酶基因缺失型与妊娠高血压综合征的关系
对妊娠高血压综合征(PIH)孕妇的ACE基因分布进行初步研究,以探讨PIH遗传倾向的分子生物学基础.1.研究对象:PIH组60例,年龄24~33岁,平均27.8岁,其中重度18例,中度20例,轻度22例,按乐杰主编<妇产科学>第四版诊断标准分类.对照组110例,以随机原则,抽取健康孕妇,年龄23~30岁,平均25.7岁.两组孕妇均为单胎、初产,既往无高血压、心脏病和肾病史.2.方法:用新鲜全血(EDTA-2NA抗凝)3 ml,取富含白细胞层,蛋白酶消化白细胞,后用盐析法,冷乙醇提取絮状DNA.采用PCR技术检测血管紧张素转移酶基因的多态性,引物为5′- CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT -3′及5′- GATGTGGCCATCACACATTCGTCAGAT- 3′.扩增产物在含有0.5 μg/ml 溴乙锭的2% 琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下观察(图1).
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分子生物学技术在诊断细胞学中的应用
自人类开始重组DNA实验25年后的今天,分子生物学技术已经成为一种定量的分子诊断(molecular diagnostics)手段,并在不断影响着传统的诊断技术.一般认为,常用的分子生物学技术包括核酸杂交分析和各种基因扩增方法,但不包括免疫细胞化学法.目前临床常用的技术有Southem印迹杂交、多聚酶链反应(PCR)及其扩增产物的电泳分析、原位杂交和荧光原位杂交(FISH)等;其他较新的分子生物学技术,如生物芯片和核酸扩增的原位检测,亦将很快用于细胞学的研究和诊断[1,2].传统的肿瘤细胞学诊断方法是根据经验来判断是否为恶性细胞,缺乏客观指标;而分子生物学技术具有高度的特异性和敏感性,是细胞学诊断的重要手段.
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Blast-病毒物种鉴定的新方法
采集自愿献血员中56份HCV-Ab阳性血样,常规分离血清,应用RT-nPCR对HGV-NS3区进行核酸扩增,PCR扩增产物与PMD18-T载体连接,转染DH5d工程菌株,挑选白色菌落,经内套PCR验证克隆阳性者,以碱裂解法提取质粒DNA,应用荧光染料Big Dye标记、Sanger双脱氧末端终止法进行重组DNA的核酸序列测定.将测得的核酸序列,经国际互联网络输入到NCBI的GenBank数据库的局部序列相似形查询(Blast)的查询框中,借助于GenBank数据库中的资料和计算机分析程序中的BlastN软件,与数据库中所有已知的核酸序列进行序列同源性比对搜索分析.
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沈阳地区肺炎支原体分离株P1蛋白基因限制性酶切图谱分型研究
采用P1基因PCR扩增产物酶切图谱分析方法对沈阳地区分离的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)菌株进行分型,以便了解本地区MP的流行情况,为临床诊断提供依据。 MP临床分离株的分离和鉴定:取临床诊断为肺炎支原体肺炎患儿的咽拭子标本放3ml支原体肉汤培养基置37℃培养7~10?d,分别转种于支原体肉汤培养基和支原体固体培养基,用血球吸附实验和MP生长抑制试验鉴定分离株。结果:6株临床分离株血吸附实验结果阳性。用MP感染阳性患者的血清做MP生长抑制实验,6株分离株亦均呈现阳性结果。
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PCR快速检测粪便中志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌IpaH基因及其临床应用
煮沸法从粪便标本中快速抽提出细菌DNA作为聚合酶链反应(PCR)模板,用自行设计的1对特异性引物扩增位于志贺菌和侵袭性大肠埃希菌染色体和质粒DNA上的多拷贝侵袭性质粒抗原(Ipa)H基因,扩增产物为620bp,以常规细菌培养检出率为对照.用20种常见肠道病原菌标准菌株的DNA抽提物进行PCR反应的方法来对PCR反应的特异性进行检验.用DNA序列分析的方法对PCR扩增产物的特异性进行检验.共检测81份门诊粪便标本,细菌培养阳性有27例,福氏志贺菌25株,宋内志贺菌2株,培养阳性率为33.3%,PCR检测阳性有39例,阳性率为48.1%,PCR检测阳性率比常规细菌培养阳性率高14.8%,其中细菌培养阳性的标本PCR检测均为阳性,29例住院病人经过正规治疗1周后,PCR检测12例仍然阳性.统计学分析显示两者之间差异有显著性(P<0.05).标准菌的PCR检测和PCR产物的DNA序列测定结果显示我们设计的PCR方法具有较高的特异性.本研究中采用的PCR方法是一种快速简便、特异性高和敏感性强的检测细菌性痢疾病原菌的现代分子生物学方法.
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乌鲁木齐市部分高危人群庚型肝炎病毒感染现状及5′ UTR区基因序列分析
新疆地处我国西部边陲,存在着各型肝炎散发流行的危险因素,庚型肝炎病毒在乌鲁木齐市的流行现状尚未见报道.在新疆医科大学第一附院收集了267份各类人群的血清,用酶标法检测血清中庚型肝炎病毒抗体(抗-HGV),再以庚型肝炎病毒NS3区为引物运用RT-PCR法对抗-HGV(阳性)血清进行庚型肝炎病毒核酸(HGV RNA)的扩增检测,阳性扩增产物为83bp.后,选择该病毒5′非编码区为引物对第一次RT-PCR扩增HGV RNA(阳性)血清,再次进行
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随机扩增多态性方法对17例院内感染念珠菌的感染方式研究
念珠菌是常见的条件致病性真菌,随着广谱抗生素及免疫抑制剂的广泛应用、恶性肿瘤和免疫缺陷患者的逐年增加、介入性治疗手段的广泛应用,念珠菌的感染日益增多[1].尤其易引起住院患者的感染,因此念珠菌感染的诊断和分型已成为临床工作中的重要研究课题.有报道称,白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌均可引起医院内的流行.由于随机扩增多态性DNA(RAPD-PCR)是一种以PCR反应为基础、可根据扩增产物的条带的数量及大小反映各菌株之间明显的差异方法.利用此种方法可分析三种临床常见念珠菌的传播情况.
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内蒙籍汉族儿童过敏性紫癜多器官损害与HLA-DQA1基因的关联性
我们收治儿童过敏性紫癜(AP)累及关节、胃肠、肾、心、肝、肺、脑中2个或2个以上器官受损的多器官损害44例,男23例,女21例,平均发病年龄8.91岁±2.57岁。诊断和器官损害标准符合实用儿科学有关章节。另选90名健康儿童作为对照组,男46名,女44名,平均年龄8.86岁±4.39岁。两组研究对象均为祖籍三代居住内蒙,无血缘关系和风湿性疾病及其家族史。以经典饱和酚/氯仿法从静脉血中提取DNA。应用PCR-SSP技术进行HLA-DQA1等位基因型别分析(方法见:Olerup等.应用PCR-SSP进行HLA-DQA1和DQB1基因分型.组织抗原杂志,1993)以β珠蛋白为内对照物。PCR条件为:预变性92℃ 2min;变性92℃ 30s;退火61℃ 45s;延伸70℃1min;共32个循环,后于70℃,延伸10min。扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳,经紫外光透射检出DNA条带,确定其基因型,并分别出基因频率。各组间基因频率比较采用卡方或Fisher检验。当P<0.05时,依Woolf公式计算出相对危险率RR以及病因分数EF和预防分数PF。
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用PCR分析高水平耐四环素淋病奈瑟菌质粒类型
1985年美国首次分离出高水平质粒介导的耐四环素淋病奈瑟菌(hight-level plasmid mediated tetracycline-resistant N.gonorrhoea,TRNG)以来,在世界各地引起广泛流行,欧洲、非洲、亚洲、拉丁美洲等地区都有报道,有些地方TRNG在质粒介导型耐药菌株中分离率居首位.根据限制性内切酶谱将TRNG分为"荷兰型"和"美国型"两种[1],"美国型"与1600 bp的扩增产物相关,"荷兰型"与700 bp大小的扩增产物相关.1991年成都地区首次分离出TRNG[2],现已成为本地区流行的主要耐药菌株.我国过去对TRNG分型主要采用琼脂稀释法测定对四环素的小抑菌浓度或质粒抽提等方法,未对其携带的质粒类型进行基因分型.我们对1999年-2002年我所性病门诊收集的476株淋病奈瑟菌采用琼脂稀释法和聚合酶链反应对其携带的质粒类型进行检测和分析,现报告如下.
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等位基因特异性多重聚合酶链反应技术对载脂蛋白E基因多态性检测的评价
载脂蛋白E(apolipoproteinE,apoE)是血浆主要载脂蛋白之一,具有明显的遗传多态性,3种常见的等位基因(ε2、ε3、ε4)分别编码3种主要异构体(E2、E3、E4),产生6种不同的基因型(ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4).apoE基因多态性不仅是心血管疾病的一种重要易患因素,而且与Alzheimer病密切相关.目前国内外检测apoE基因多态性的方法很多,因而快速简便的检测方法也就成为研究中关注的焦点.等位基因特异性多重聚合酶链反应(PCR)技术(multi-ARMS)是利用TaqDNA聚合酶对引物3′端核苷酸的特异性,在不同的反应体系中分别加入与待检测位点野生型、突变体相配的一对引物,通过扩增产物的有无来判定该位点是否突变.
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两种DNA探针杂交检测结核分枝杆菌的研究
我们比较了结核分枝杆菌(结核菌)基因组DNA及其聚合酶链反应(PCR)产物的灵敏度与特异性,并对结核病人痰标本进行了检测。 一、材料和方法 1.菌种来源:24种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所,11种非分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。 2.标本收集:90份痰标本来自本院结核科住院病人,经X线检查、临床表现确诊。30份非结核病人痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北京大学第三医院呼吸科住院病人。 3.标本DNA提取:采用本室研制的标本前处理试剂盒。 4.引物:引物a:根据文献[1]报道设计。扩增产物为350 bp,5′-GAAGTCGTAACAAGC,5′-CAAGGCATCCACCAT;引物b:根据引物a扩增产物测序结果,选择碱基差异性设计,扩增产物为250 bp,5′-CGGCAGCGTATCCATTGATG,5′-CACGAAAACGCCCCAACTG。 5.PCR扩增:引物a扩增参数:94℃,1 min;45℃,3 min;72℃,1 min;循环30次,后72℃延伸10 min。引物b扩增参数:94℃,1 min;61℃,1 min;72℃,1 min;循环30次,后72℃延伸10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
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一次腹泻病原菌的随机扩增多态DNA特征
RAPD(随机扩增多态DNA)分析细菌基因组结构的突出优势是无须知道待测细菌的遗传背景,技术成熟简便,从扩增产物可以比较不同属、种、型及株系间的DNA指纹特征.1998年6~10月,呼和浩特地区发生小儿急性肠炎,为进一步认识腹泻的病原菌,对保存菌株进行了RAPD分析.一、材料与方法12株福氏志贺菌2a型、2株福氏志贺菌6型和5株奇异变形杆菌进行细菌基因组DNA的RAPD分析.随机引物选择CyberSyn生物工程公司的CY10系列套式引物,PCR扩增在PE 480型上进行.收集生长对数期菌体,0.9% NS洗涤2次,15 000 r/min离心5 min,用EB平板测定DNA含量,稀释至4 ng/ml.25 μl常规反应体系,40个循环,退火温度根据引物的不同选择从37℃到40℃.1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下拍照记录.
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突变受阻性扩增系统快速检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的初步研究
利福平(RFP)是结核化疗方案中的一个关键药物,它的应用可明显缩短结核病的疗程.因此,创建快速、简便的检测方法一直是基础研究中的一个重要课题.突变受阻性扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)[1]是一种可以检测任何已知点突变或小基因片段缺失的扩增技术,简便、可靠、无同位素污染.我们选择与结核分枝杆菌(结核菌)RFP耐药相关的rpoB基因中突变频率高的3种突变形式:531 TCG→TTG,526 CAC→TAC,516 GAC→GTC来设计ARMS特异性突变引物,ARMS-聚合酶链反应(PCR)扩增后结合微孔板探针杂交酶免疫技术(EIA)加以检测其扩增产物,进而推断其RFP耐药与否.
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定量聚合酶链反应测定技术
聚合酶链反应(PCR)现已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测.由于PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量,使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量.近年来,研究人员为克服上述影响因素,研究了各种相对准确的定量PCR方法[1-3].
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福建西北林区人单核细胞埃立克体病分子流行病学调查研究
[摘要]目的 了解福建西北林区人单核细胞埃立克体病的存在情况.方法 评价以查菲埃立克体16S rRNA基因序列高变区构建引物进行的半套式PCR的敏感性和特异性,并用此种半套式PCR技术检测从福建武夷山市和宁化县采集的蜱类、野生动物内脏和血液及人群血液标本中的查菲埃立克体DNA,对有代表性的阳性标本的扩增产物进行克隆和序列测定,并与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较.
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原代猪肝细胞PERV检测及其意义
目的:探讨猪肝细胞内源性逆转录病毒(PERV)检测方法及意义.方法:采用体外二步灌流法获取猪肝细胞,使用特异性引物对其前病毒序列进行观察;以未逆转录PCR为对照,采用RT-PCR方法检测原代猪肝细胞PERV携带及释放情况,并用套式RT-PCR对扩增产物进行鉴定.结果:原代猪肝细胞基因组中可检测到PERV前病毒序列,肝细胞中亦可检测到特异性的PERV RNA序列.在缺乏有丝分裂原刺激的情况下,猪肝细胞普通培养的不同时段均可检测到病毒释放,并可持续至细胞死亡.结论:中国实验小型猪肝细胞携带PERV病毒序列,猪肝细胞普通培养时可释放该病毒,其感染性及生物安全性尚需进一步研究.
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人血管能抑素canstatin基因的分子克隆
目的:克隆血管能抑素canstatin基因,测定并分析其基因序列.方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出canstatin基因,克隆进载体pUCm-T获得重组质粒pUCm-T/canstatin,转化E.coliDH 5α,挑选出阳性克隆,测定基因序列.结果:从人胎盘组织中提取出RNA,10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示3条清晰条带,分别对应28 S,18 S,5 S.分光光度计测定总RNA的A260=0.879,A280=0.410,A26:A280=2.095,总RNA浓度为1.8 g/L.RT-PCR扩增产物与预期的目的基因canstatin长度一致.RT-PCR产物与载体pUCm-T连接过夜后,转化E.coliDH5α,在LB平板上生长出蓝色和白色菌落.挑选6个白色菌落做酶切鉴定,其中一个菌落经BamHI酶切后,只出现l条特异性条带,位置与酶切前质粒相近,而经HindⅢ酶切后,出现2条特异性条带,其中l条与酶切前质粒位置相近,另l条与目的基因位置基本一致,证实为阳性克隆.测定该阳性克隆基因序列,结果显示其与Genbank中公布的canstatin基因序列完全一致.结论:成功克隆了canstatin基因,为进一步研究其抗肿瘤作用打下基础.
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PcDNA3.1(+)-MCP-1和PcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα.方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro DNA疫苗奠定了基础.
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ntPCR-RFLP检测HBV阿德福韦耐药变异-rtN236T变异
目的:建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异-rtN236T变异的快速检测方法.方法:根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物,使野生株(rt236N)PCR产物中含有DraI酶切位点(5'TTTAAA3'),而变异株(rt236T)无此限制性酶切位点.同时PCR扩增2份已行HBVRT区基因测序证实未出现rtN236T变异的慢性乙型肝炎患者血清及自行构建的对照质粒,扩增产物经DraI酶切,30 g/L琼脂糖凝胶电泳后,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析.结果:所建立的ntPCR-RFLP方法灵敏度高,可以检测到106copies/L的HBV DNA;特异性强,其RFLP分析结果与DNA测序结果一致.结论:ntPCR-RFLP方法灵敏、特异、简便、实用,适用于ADV耐药变异的临床监测工作.