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HCV IRES特异性抑制性RNA结构模拟及在体外对病毒翻译启动的抑制作用
[摘要]目的 计算机模拟IRNA二级结构,研究HCV IRES特异性抑制性RNA对HCVIRES介导蛋白翻译的体外抑制作用.方法 应用计算机软件模拟IRNA二级结构;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA,以AatⅡ和Xba Ⅰ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酸载体pGEMRz中;应用酶切方法、PCR方法和测序法对重组载体进行三重鉴定.
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PcDNA3.1(+)-MCP-1和PcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα.方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro DNA疫苗奠定了基础.
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人hTERT正反义逆转录病毒表达载体的构件建和鉴定
目的:构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义逆转录病毒表达载体.方法:采用基因重组技术,用限制性内切酶EcoRI将hTERT基因从克隆载体pGRN-145上酶切下,并将其正向及反向克隆到去磷酸化逆转录病毒载体pLXSN中,NotI和XhoI酶切鉴定结果结果:经NotI和XhoI双酶切后,正义重组质粒被切成1438和7838bp两个片段,反义重组质粒被切成1438、1992和5898bp三个片段,与理论计算长度相符.结论:成功构建了hTERT正、反义逆转录病毒载体.
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乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达
目的:为进一步探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的功能,在真核生物酵母细胞中表达X基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法以HBV ayw亚型全序质粒pCP10为模板扩增X基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoRI和PstI双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBKT-7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析,以明确HBxAg是否在其中表达.结果:成功地扩增出HBx基因,测序鉴定符合Gene Bank报告序列;酶切回收的HBx基因成功地克隆入酵母表达载体pGBKT-7并转化入酵母细胞AH109中,Western免疫印迹显示X基因在酵母细胞中表达,表达产物在胞内存在,相对Mr为35000左右结论:成功地构建了HBxAg在酵母表达载体,并在酵母细胞中表达
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乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及人肝细胞株HL-7702转染
目的:构建表达乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株.方法:用PCR法扩增HBV X基因序列,将其添A后连至PUCmT载体上,用EcolI和HindⅢ双酶切PUCmT-X和PcDNA3载体,连接酶切片段PcDNA3及X片段以构建重组质粒PcDNA3-X.用脂质体转染法将PcDNA3-X及空质粒PcDNA3导入肝细胞HL-7702中,G418选择培养,RT-PCR鉴定其稳定表达.结果:已构建的PcDNA3-X经序列测定含有完整的HBV X基因片段,转入HL-7702细胞后经RT-PCR证实该细胞有稳定表达X蛋白.结论:成功构建了表达HBV X基因的肝细胞株,为进一步探讨HBV X基因在肝炎与肝癌发生中的作用提供了理想的实验模型.
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人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达
目的:构建含人CD81基因的真核表达载体,探讨CD81在COS-7细胞的表达,为研究丙型肝炎病毒(HCV)与CD81相互作用奠定基础.方法:从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81,应用双酶切回收基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAX1;通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞;应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物.结果:重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确,并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白.结论:成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81,并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子,该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型.
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羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关.为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.CPN是分子量280 kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位.核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA.前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录.前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用.核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621 nt).CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达.方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点.用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上.核心启动子经MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.
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HCV-Fc融合基因疫苗真核表达载体的构建及表达
目的:构建能表达HCV C-Fc融合基因的真核表达载体,为进一步修饰和转染树突状细胞,制备能高效表达HCV C和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备.方法:用分别含有Kpn Ⅰ和XholⅠ酶切位点的HCV C区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCVl-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV C区基因片段回收后,以Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切,定向插入到含IgGl Fc基因的质粒pIgC3双粘端位点之间,获得重组表达质粒pHCVFc.通过Kpn Ⅰ双位点酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定.以抗HCV C单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pHCV-IgFc在人肝癌细胞7 721中的瞬时表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,pHCV-IgFc插入片段为HCV C区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7 721细胞中瞬时表达.结论:构建的质粒pHCV-IgFc可以在7721细胞中瞬时表达HCV C区基因,为研究HCV C-Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础.
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短发夹RNA抑制外源荧光素酶在肝癌细胞中的表达
目的:构建含荧光素酶(1uciferase,luc)基因的短发夹状RNA(shorr hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其在肝癌细胞Bel-7402中抑制外源荧光素酶的表达.方法:设计的两条反向重复的多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,再与双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-luc重组质粒,与荧光素酶基因表达质粒pCMV-luc共转染肝癌细胞株BEL-7402,检测其对荧光素酶表达的影响.结果:PCR和DNA序列分析证实了重组质粒构建成功.pshRNA-luc对共转染的pCMV-luc中的荧光素酶具有明显的抑制作用,抑制率可达86%(P<0.01).结论:构建的pshRNA-luc表达质粒能有效地抑制荧光素酶在肝癌细胞中的表达,为RNA干扰用于肿瘤的基因治疗打下基础.
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幽门螺杆菌18000u外膜蛋白编码基因的克隆及表达
目的:构建含幽门螺杆菌(Hp)18000 u外膜蛋白编码基因的重组载体并在E.coli BL2l中表达.为Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础.方法:用PCR从Hp染色体中,扩增18000 u外膜蛋白编码基因片段.将目的基因与pET32a(+)同时经BamH I,HindⅢ双酶切、纯化、连接,转化含有目的基因的重组载体.以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达.表达产物经纯化后,用ELISA法检测其抗原性.结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hpl8000 u的外膜蛋白编码基因,与Tomb等报道相比较,有2%编码基因发生变异,1.7%氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白为38000 u,其中pET32a(+)表达的蛋白约为20000u,可溶性表达产物占全菌总蛋白的21.3%.重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上.ELISA法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论:成功地克隆并表达Hp18000 u的外膜蛋白编码基因,为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了基础.
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人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆、表达及抗原性研究
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A编码基因的重组载体、进行核甘酸序列分析,并在E. coliBL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法:利用分子克隆技术从Hpylori DNA染色体中,扩增热休克蛋白A编码基因片段;将目的基因与载体pET32a(+)同时经kpnⅠ、BamH Ⅰ双酶切、纯化、连接后,转化含有目的基因的重组载体;以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达;表达产物经纯化后,用Western blot法检测其抗原性.结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hpylori热休克蛋白A编码基因,与GenBank报道的相比较,有1.6%的碱基(bp)发生变异,1.6%的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白Mr为33×103,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的18.96%.重组蛋白经Ni+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上.用Westernblot方法检测显示,该重组蛋白可被Hpylori阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论:成功地克隆并表达了H pylori热休克蛋白A码基因,为Hpylori蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.
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携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白活减毒鼠伤寒沙门菌口服重组DNA疫苗株的构建
目的:构建携带人幽门螺杆菌(Hpylori)中性粒细胞激活蛋白HP-NAP)基因(napA)的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌.结果:重组质粒经PCR及双酶切,证实成功构建了携带HP-NAP基因的重组真核表达质粒pIRES-napA,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207.所克隆435bp napA与GenBank中SS1-napA核苷酸和蛋白质的同源性均为98%.结论:成功构建并鉴定了携带HP-NAP基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗,为多价抗Hpylori口服DNA疫苗的研制奠定了基础.
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重组甘氨酸脱羧酶基因工程菌生产L-5-甲基四氢叶酸
目的:针对叶酸代谢通路中的甘氨酸脱氢酶(GDC)构建高效表达GDC的重组菌E.coli BL21(pET22b-gcvP)并检测L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)的增加量.方法:采用PCR法获得GDC基因gcvP,分别在其两端加上HindⅢ和Xho Ⅰ酶切位点,经HindⅢ和Xho Ⅰ双酶切后,连接到经同样双酶切的表达载体pET22b中,经限制性内切酶酶切和测序验证正确后,转化至E.coli BL21中.乳糖诱导重组蛋白表达,进行SDS-PAGE电泳,HPLC检测L-5-MTHF产量.结果:经双酶切与测序鉴定证实原核重组载体pET22b-gcvP构建成功,表达产物相对分子质量约为104×103,与GDC大小相符.与原始菌相比,重组菌的L-5-MTHF的产量增加了23.1%.结论:重组甘氨酸脱羧酶基因工程菌能够提高L-5-MTHF产量.
关键词: L-5-甲基四氢叶酸 甘氨酸脱羧酶 克隆 原核表达 双酶切 -
新型防龋疫苗——变形链球菌基因疫苗防龋应用基础研究
1.主要研究内容:(1)基因疫苗的构建;通过基因重组技术成功地构建了含主要致龋菌变形链球菌毒力因子基因的重组质粒pcDNA3-pac、pcDNA3-gtfB、pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP.(2)基因疫苗的鉴定:经双酶切、测序等分析证实目的基因片段插入相位正确,未改变其阅读框架.
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BamH Ⅰ+Xho Ⅰ双酶切质粒电泳弥散原因初探
目的 探讨TaKaRa公司(中国大连)快速限制酶BamH Ⅰ+Xho Ⅰ 37℃双酶切质粒pET-28a、pET-28a-SDHA产生弥散的原因. 方法 比较4种条件下酶切对弥散的影响:①BamH Ⅰ+Xho Ⅰ 37℃双酶切Elution Buffer(EB)洗脱或水洗脱的质粒;②NdeⅠ+Xho Ⅰ 37℃双酶切EB洗脱或水洗脱的质粒;③先BamH Ⅰ 30℃酶切,再XhoⅠ 37℃酶切;④BamH Ⅰ分别于30℃、37℃单酶切. 结果①amH Ⅰ+Xho Ⅰ 37℃双酶切EB或水洗脱的质粒均产生严重弥散;②NdeⅠ+Xho Ⅰ 37℃双酶切EB洗脱或水洗脱的质粒无弥散;③BamH Ⅰ 30℃酶切+Xho Ⅰ 37℃酶切,无弥散;④BamH Ⅰ 30℃单酶切无弥散,37℃单酶切严重弥散. 结论BamH Ⅰ+XhoⅠ 37℃酶切质粒电泳弥散是BamH Ⅰ在此温度下的星活性所致.
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限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切条件的优化
目的:探讨KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的优化条件。方法 KpnⅠ和EcoRⅠ不同的酶切体系,酶切含有上述两种限制性内切酶酶切位点的载体pEGFP-Ano2,DNA琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,以获取KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的优化条件。结果50μL酶切体系,KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的适宜条件:首先在1×L缓冲液情况下,应用1μL KpnⅠ酶切1μg质粒1 h,再加入1×H缓冲液和0.01%BSA,应用1μL EcoRⅠ继续酶切1 h。结论获取KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒的适宜条件,为今后应用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切实验提供科学的参考依据。
关键词: KpnⅠ EcoRⅠ 双酶切 优化 DNA琼脂糖凝胶电泳 -
人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建
目的 克隆人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因编码区cDNA序列,构建并鉴定TGF-β1真核表达载体.方法 设计含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的TGF-β1cDNA引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以人白细胞mRNA为模版,扩增TGF-猹1基因,纯化PCR产物,TA克隆,双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,用双酶切后形成分子量1.2kb的条带,符合物理图谱,表明表达载体构建成功,序列测定结果与预测结果完全一致.结论 成功克隆了TGF-猹1基因,并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.
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PCR-双酶切鉴定STGC3抑癌基因重组子假阳性研究
目的:探讨PCR与双酶切技术联合使用鉴定阳性重组子的特异性和可靠性,评价长期保存的重组质粒再次测序的必要性.方法:对随机选取已经过测序验证的三组STGC3/pcDNA 3.1(+)、一组STGC3/pGEM Easy T Vector重组子首先经过LB氨苄平皿培养挑单克隆筛选,然后单独或联合使用PCR和双限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切方法鉴定,将阳性样品送交生物工程公司测序,比较并评价两者结果的一致性.结果:三组STGC3/pcDNA 3.1(+)重组子经PCR-双酶切检测阳性而不能通过测序,说明该检测方法在运用中确实存在假阳性,同时证明重组载体在长期保存后有必要再次鉴定.结论:保存过程中的杂菌污染、实验室操作中的质粒交叉污染以及重组载体基因突变是基因工程操作中不可忽视的问题;PCR-双酶切鉴定重组载体存在假阳性的问题,实验设计中应包含阳性与阴性(污染)对照,并有足够的重复实验.
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基因工程法生产L-5-甲基四氢叶酸的研究
目的 在E.coli BL21 (DE3)中表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原醇(MTHFR),并检测MTHFR的表达情况及L-5-甲基四氢叶酸的增加量.方法 采用PCR法获得MTHFR基因(metF)全长DNA,分别在其5'端和3'端加上BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点.经BamH Ⅰ和SacⅠ双酶切后,连接到经同样双酶切的表达载体pET-28a(+)中,经限制性酶切、菌落PCR和测序验证正确后,转化至E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测MTHFR表达量,HPLC检测L-5-甲基四氢叶酸量.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pET28a-MTHFR构建成功,表达产物相对分子质量约为33 000,与MTHFR大小相符,工程菌的L-5-甲基四氢叶酸的产量显著增加.结论 通过将MTHFR的基因导入L-5-甲基四氢叶酸产生菌能够提高L-5-甲基四氢叶酸产量.
关键词: L-5-甲基四氢叶酸 原核表达 双酶切 -
弓形虫RH株SAG2基因片段的克隆、表达、纯化与鉴定
克隆弓形虫RH株膜表面抗原2(SAG2)编码基因,构建原核重组表达质粒PET23a-SAG2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达及纯化SAG2蛋白.PCR扩增503bp的SAG2编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α.限制性酶切分析及测序鉴定后以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD-18T-SAG2质粒与表达质粒载体Pet23a的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位点,构建重组体Pet23a-SAG2,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.表达产物经金属鏊合层析纯化.用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达与纯化产物.PCR扩增出约503bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符;所构建的PET23a-SAG2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定,与预期结果一致.SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物约18kD.成功构建PET23a-SAG2表达质粒,诱导表达并纯化出了弓形虫RH株SAG2蛋白,并以免疫印迹鉴定.