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编码基因pac的DNA疫苗经胃肠粘膜免疫SD鼠的研究
变形链球菌(Streptococcus mutans, S.mutans)是主要的致龋菌,细菌表面蛋白PAc是其主要的毒力因子之一.抗PAc抗体能有效阻止S.mutans在牙面的非蔗糖依赖性粘附,从而可以预防龋病的发生.DNA防龋疫苗的成功研制[1,2],给免疫防龋的粘膜免疫提供了崭新的思路.核酸疫苗经粘膜免疫可以通过共同粘膜免疫系统(common mucosal immune system, CMIS)诱导循环及粘膜特异性抗体的反应,更重要的是粘膜IgA的应答,这无疑是免疫防龋的关键所在.本实验用bupivacaine(布比卡因)作为编码变形链球菌表面蛋白pac基因的表达质粒pCIA-P的载体,经由胃、直肠粘膜免疫SD鼠,评价DNA复合体疫苗的免疫效能,探索合适的防龋途径.
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变形链球菌GbpA的GBD融合蛋白诱导SD大鼠产生免疫应答
目的研究变形链球菌葡聚糖结合蛋白A(glucan binding protein-A, GbpA)的GBD融合蛋白免疫SD大鼠时,其所诱导的血清和唾液特异性免疫反应. 方法用纯化的变形链球菌GbpA的GBD融合蛋白皮下免疫SD大鼠,免疫后间隔一定的时间收集大鼠的血清及唾液,间接ELISA检测血清及唾液中特异性抗GBD抗体. 结果 GBD融合蛋白免疫大鼠,可引起血清中IgG及唾液中IgA的显著提高.另外,GBD融合蛋白免疫大鼠,38d采血,血清中抗GBD抗体效价高,后逐渐降低. 结论变形链球菌GbpA的GBD融合蛋白具有免疫原性,可供研制防龋疫苗参考.
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变异链球菌表面蛋白质抗原真核表达质粒的构建及免疫动物的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans, S.mutans)是龋病主要致病菌,S.mutans的表面蛋白质抗原PAc是其主要毒力因子之一,参与了唾液介导的S.mutans在牙面的粘附。S.mutans PAc分子的氨基端不仅富集免疫显性T、B细胞表位,而且含有唾液糖蛋白结合区,因此氨基端是理想的表位多肽防龋疫苗选择区。此外,Streptococcus sobrinus(S.sobrinus)的PAg分子与S.mutans PAc分子的氨基端具有保守的B细胞表位,以PAc分子该区段制备的多肽疫苗可激发宿主对S.sobrinus的交叉保护性反应。因而,初次以变异链球菌表面蛋白质抗原PAc氨基端的编码基因构建真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察所诱导的体液免疫应答,为基因疫苗防龋的动物实验提供资料。
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携带sbr基因的农杆菌二元载体系统的构建及稳定性分析
利用转基因植物生产防龋疫苗,其中一个主要的步骤是如何将目的基因转入植物组织中.对于双子叶植物番茄来说,农杆菌为载体的基因转移法是合适的,因此本实验构建含sbr基因的农杆菌二元载体系统,并分析质粒在农杆菌中的稳定性,为下一步植物遗传转化奠定基础.
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含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建
人类致龋菌变形链球菌(S.mutans)的一种表面蛋白PAc,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作S.mutans的重要毒力因子,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原.我们选择pac基因中编码PAc主要免疫活性区域的DNA序列, 制备出待表达DNA片段, 经亚克隆至pGEM-T质粒后,再克隆到高效哺乳动物表达质粒pCI中构建成含pac基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒,从而为防龋DNA疫苗的免疫实验研究完成了重要准备.
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防龋疫苗主动免疫的现状与未来
防龋疫苗的研究已有近40年的历史,多种防龋疫苗经证实确有防龋效果,然而防龋疫苗进入临床应用前必须解决使用安全性、防龋高效性、成本经济性等问题.近年来,随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展,从分子水平对变形链球菌 (Mutans Streptococci,以下简称变链菌)主要毒力因子表面蛋白抗原 (surface protein antigen,PAc,又称为抗原B、I/II、IF、P1)和葡糖基转移酶 (glucosyl~transferaes, GTFs)的认识逐步深入,极大地推动了防龋疫苗的研究.国内外学者就防龋疫苗的免疫原、免疫佐剂和免疫途径进行了大量的研究,取得了许多新的进展.
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新型防龋疫苗——变形链球菌基因疫苗防龋应用基础研究
1.主要研究内容:(1)基因疫苗的构建;通过基因重组技术成功地构建了含主要致龋菌变形链球菌毒力因子基因的重组质粒pcDNA3-pac、pcDNA3-gtfB、pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP.(2)基因疫苗的鉴定:经双酶切、测序等分析证实目的基因片段插入相位正确,未改变其阅读框架.
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递送系统搭载防龋基因疫苗的研究现状
口腔防龋疫苗经国内外学者的研究,发展迅速,大多数疫苗已被证实在动物身上具有防龋作用.但防龋疫苗具有效价低、不稳定、易降解等缺点,给其应用带来了困扰.水凝胶、壳聚糖、脂质体等缓释系统能够保护疫苗本身的特性不被破坏,且能够按照需要缓慢释放,并具有靶向性等特点,其兴起有望解决防龋疫苗的缺点.该文结合有关文献就防龋疫苗搭载递送系统的研究现状进行综述.
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转基因番茄防龋疫苗的致突变性和生殖毒性研究
目的 研究表达变异链球菌表面蛋白PAcA、PAcP和霍乱毒素B亚单位(CTB)的转基因番茄防龋疫苗的致突变作用和生殖毒性作用.方法 将42只5周龄清洁级昆明小鼠随机分为7组,分别为高(5g/kg)、低(2 g/kg)剂量阴性对照(正常番茄汁)组和PAcA/CTB、PAcP/CTB蛋白-番茄汁染毒组以及阳性对照(100mg/kg环磷酰胺)组,每组6只,雌雄各半;除阳性对照组采用腹腔注射方式染毒外,其余6组均采用经口灌胃方式进行染毒,每天1次,连续染毒4 d;测定骨髓细胞微核率.同法进行精子畸形试验(阳性对照为20mg/kg环磷酰胺).将60只5~8周龄清洁级SD大鼠随机分为3组,分别为PAcA/CTB、PAcP/CTB蛋白-番茄汁染毒组和对照(非转基因番茄汁)组,每组20只,雌雄各半.进行子一代生殖毒性试验.结果 转基因番茄汁染毒小鼠骨髓细胞微核率、精子畸形率与阴性对照组比较,差异均无统计学意义.转基因番茄汁染毒亲代大鼠体重、孕鼠受孕率、正常分娩率与对照组比较,差异均无统计学意义;转基因番茄汁染毒胎鼠出生存活率、哺乳存活率,仔鼠生长发育(体重、身长、尾长)及骨骼发育情况与对照组比较,差异均无统计学意义;病理学检查均未见明显病理改变.整个试验期内,各组亲代、子代大鼠均未出现明显的中毒反应.结论本试验所用的转基因番茄防龋疫苗不会引起致突变作用和生殖毒性作用.
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佐剂在龋病粘膜免疫中的应用及展望
免疫防龋是预防龋病的重要途径,疫苗免疫机体的理想方法是口服免疫,口服免疫不但在受抗原刺激的粘膜部位产生免疫应答,还能在远处甚至全身诱导免疫应答.然而,大多数可溶性蛋白抗原口服免疫,其免疫原性低,而且常诱生免疫耐受,因此,为了提高防龋疫苗的免疫原性,有必要综述佐剂在龋病粘膜免疫中的现状及展望.
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201名在岗工人牙齿缺失情况分析
目的 了解201名在岗工人牙齿缺失情况,以便采取措施更好防治工人的牙齿缺失.方法 常规方法 检查工人的牙齿,用FDI公式记录法记录缺失牙的牙位.结果 各年龄组工人中缺失一个或两个牙者占大多数,缺失多的牙位是36、46,其次是37、47、26,龋病引起缺牙的人数为158例,占总缺牙人数的78.6%.结论 磨牙缺失较多,可引起咬合关系紊乱,咀嚼功能下降,201名工人缺牙的主要原因是龋病.因此要积极修复缺牙和防治龋病.
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变形链球菌葡聚糖结合蛋白研究进展
葡聚糖结合蛋白是变形链球菌致龋的重要毒力因子。与变形链球菌的粘附、聚集、细胞壁生理功能、酶活性和形成生物膜并维持其结构稳定起重要作用。该文就变形链球菌4种葡聚糖结合蛋白研究现状,葡聚糖结合蛋白与生物膜、防龋疫苗的关系及当前存在的问题作一综述。
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表达嵌合体蛋白PAcA/CTB的转基因番茄口服免疫大白兔的实验研究
目的:观察表达嵌合体蛋白PAcA/CTB转基因番茄防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性.方法:新西兰大白兔随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组3组,分别喂食3个剂量(目的蛋白量相差1.5倍)的转基因番茄汁、非转基因番茄汁和变异链球菌灭活全菌疫苗.每周免疫1次,连续免疫4周,ELISA法检测免疫前和免疫后不同时期血液、唾液样品中抗变异链球菌PAc的IgG、IgA抗体效价.结果:口服免疫后实验组与阳性对照组大白兔血液和唾液中均出现特异性的抗PAc抗体,抗体水平可维持数周,而阴性对照组抗体水平变化不明显.结论:表达嵌合体蛋白PAcA/CTB的转基因番茄能够诱导动物机体产生有效的系统免疫应答和黏膜免疫应答.
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阳离子脂质体乳剂增强防龋疫苗黏膜免疫效果的研究
目的:观察阳离子脂质体增强防龋疫苗诱导的小鼠特异性IgG和唾液IgA抗体水平.方法:以阳离子脂质体乳剂分别包被防龋DNA疫苗(pGJA-P/VAX)和基因重组rPAc蛋白疫苗,用DNA初免,2周后蛋白加强免疫的策略滴鼻免疫6~8周龄的BALB/c小鼠,分别收集初免后0、2、4、6、8、10、12、16周的血清和唾液,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清和唾液中特异性抗体的水平.结果:制备的乳剂疫苗CLE/DNA和CLE/rPAc的粒径分别为134.6 nm和230 nm,ZETA电位为36 mV和18.5 mV,乳剂疫苗免疫小鼠后可以诱导血清特异IgG和唾液特异IgA产生,并且实验组(LE/DNA初免+LE/rPAc加强免疫组)能产生较对照组(DNA初免+rPAc加强免疫组)更持久的黏膜免疫反应,两组比较差异有显著性(P<0.05).结论:阳离子脂质体乳剂是有效的基因疫苗载体,与防龋疫苗(DNA和rPAc蛋白)合用免疫小鼠,可增强血清特异性IgG和唾液特异性IgA抗体水平,延长抗体维持时间,具有较好黏膜免疫反应增强作用.
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转基因植物及其在龋病预防中的应用
利用转基因植物生产外源性蛋白是近期发展起来的一项新技术.所具有的经济、安全、使用方便等特点,使其成为现在的研究热点,也使得防龋疫苗及防龋抗体生产的商业化成为可能.本文就转基因植物的生产及其在龋病预防中的应用等方面作一综述.
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表面蛋白抗原防龋疫苗研究进展
表面蛋白抗原是变形链球菌组的主要毒力因子之一,已成为防龋疫苗的主要研究对象,现将表面蛋白抗原防龋疫苗的研究进展综述如下.
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变异链球菌葡糖基转移酶植物表达质粒p2355-gtfB的构建
目的 构建含变异链球菌葡糖基转移酶多个免疫显性抗原表位的植物表达质粒p2355-gtfB,为其转化植物研究奠定物质基础,为可食防龋疫苗研究提供条件.方法 以真核表达质粒pcDNA3-gtfB为模板,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增含编码变异链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB.将回收纯化的PCR产物经T-A克隆技术克隆于中间载体pMD18-T,双酶切鉴定插入方向后,将目的基因从中间载体释放,再克隆至高效的植物表达载体p2355,用电转化法转化根癌农杆菌EHA105,对重组质粒阳性克隆株进行筛选与鉴定.结果 通过对重组质粒T-gtfB进行酶切图谱分析,获得2.9kb和3.7 kb的2个片断,将重组质粒p2355-gtfB进行酶切、PCR及测序分析,显示p2355-gtfB中插入基因长度为3 675 bp,基因序列与双脱氧链终止法的测定结果相同,证明植物表达质粒p2355-gtfB构建成功,开放阅读框架正确.结论 本研究成功构建了含变异链球菌多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因的植物表达质粒p2355-gtfB,为可食性防龋疫苗的研究奠定了基础.
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变形链球菌毒力因子GTF多肽疫苗研究近况
变形链球菌是龋病主要的病原菌.变形链球菌定植至牙表面为产生龋齿关键的一步.这一过程由蔗糖依赖和蔗糖非依赖两种机制所介导,而后一机制与葡糖基转移酶(GTF)催化蔗糖合成可溶性和不可溶性的葡聚糖有关[1].所以,GTF被认为是变形链球菌重要的两种毒力因子之一.它在致龋过程中起的重要作用使它成为发展防龋疫苗的研究对象[2].随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的发展,对变链菌GTF认识的逐步深入,利用GTF分子中与某种特定功能有关并具有免疫原性的氨基酸序列制作的多肽疫苗,成为免疫防龋研究的热点.
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表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄防龋疫苗口服免疫大白兔的研究
目的 观察表达嵌合体蛋白PAcP/CTB转基因番茄防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性.方法 用PAc标准蛋白制作标准曲线,ELISA法检测番茄果实PAcP/CTB蛋白的浓度.实验动物按完全随机分组法分为3组,实验组喂食3个剂量(PAcP/CTB蛋白量相差1.5倍)的转基因番茄汁,阴性对照组喂食非转基因番茄汁,阳性对照组喂食变异链球菌灭活全菌疫苗.每周免疫1次,免疫4周,ELISA法检测大白兔唾液和血液样品中抗变异链球菌PAc的IgA、IgG抗体效价水平.结果 转基因番茄中PAcP/CTB嵌合蛋白的浓度为9.37 μg/mL.疫苗免疫动物后实验组与阳性对照组大白兔唾液和血液中的特异性抗PAc抗体升高,抗体水平可维持数周,而阴性对照组抗体水平变化不明显.结论 表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄免疫新西兰大白兔后,能有效的诱导唾液和血液中特异性抗体的产生,其具有较好的免疫原性.
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脂质体及生物降解性微颗粒防龋疫苗的研究进展
龋病是细菌性疾病,采用疫苗防龋应成为预防龋病的重要手段.防龋疫苗的剂型、免疫途径、佐剂和配体是近年来学者们研究的重点之一.脂质体及生物降解性微颗粒防龋疫苗安全、高效、靶向性好,具有缓释效应.本文将对这两者的研究现状进行综述.