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酵母UDP-葡萄糖合成途径的优化及黄酮葡萄糖苷的合成
目的：研究在酿酒酵母细胞内高表达大肠杆菌 UDP-葡萄糖合成途径的2个关键酶对工程酵母细胞的葡萄糖苷化反应活性的影响。方法利用 PCR方法获得大肠杆菌磷酸葡萄糖变位酶（PGM）和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（GalU）基因，构建整合型表达载体，转化酵母；同时共表达具有催化黄酮葡萄糖苷化的 UDP-葡萄糖转移酶，研究摇瓶培养条件下PGM和 GalU 基因的表达对工程细胞生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的影响。结果在酵母细胞内表达大肠杆菌 UDP-葡萄糖合成途径的2个关键酶 PGM和 GalU，提高了组合表达 UDP-葡萄糖转移酶的工程菌生物催化合成野黄芩素-7-O-葡萄糖苷的效率，表明PGM和GalU基因的高表达能促进 UDP-葡萄糖的合成；所构建的工程菌也能催化木犀草素、柚皮素、白杨素、汉黄芩素、木蝴蝶素 A、黄芩素、槲皮素以及大豆黄酮等黄酮类化合物的葡萄糖苷化。结论组合表达大肠杆菌 PGM 和 GalU 基因能促进酵母细胞内 UDP-葡萄糖的合成，进而提高了工程细胞催化合成黄酮葡萄糖苷的效率。
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中药对口腔细菌生物膜作用的实验研究
目的 用五倍子和蜂房的有效成分作为实验药物研究中药对口腔细菌生物膜结构、活性的影响及对生物膜中葡萄糖转移酶(GTF)活性的影响,探讨中药防龋的可能性.方法 用荧光显微镜结合特异荧光染料标记口腔细菌生物膜中死菌和活菌的方法,研究实验药物对口腔细菌生物膜结构和活性的影响.硫酸铵沉淀法提取粗酶,Neson-Somogyi法测定还原糖,G250微量蛋白定量GTF还原糖计算GTF活性单位,评价实验药物对口腔细菌生物膜中GTF活性的影响.结果 早期细菌定植黏附到形成成熟生物膜结构的过程中都存在一定数量的死菌.24 h常态生物膜结构中活菌面积占主导地位,有少量死菌存在,细菌互相紧密黏附在一起,生物膜结构清晰.0.05%氯己定对24 h细菌生物膜作用后,细菌总量明显下降,残存滞留的细菌基本为死菌.0.023%的NaF作用于细菌生物膜后,生物膜结构发生明显变化,细菌总量明显减少,存在的细菌以活菌为主.经4 g/L五倍子多酚性化合物(GCE)、五倍子化学组分B(GCE-B)及32 g/L蜂房化学组分1(NVE1)作用后,生物膜结构模糊不清,细菌散开,生物膜结构密度下降,其中死菌和活菌量基本相同.生物膜细菌总量减少,与24 h常态生物膜相比,差异有统计学意义(P＜0.05).各实验组活菌百分比与阴性对照组活菌百分比相比差异有统计学意义(P＜0.05).24 h口腔细菌生物膜经4 g/L GCE以及32 g/L NVE1作用后,GTF的活性受到明显抑制,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).GCE-B在实验浓度下对GTF的活性未产生明显的抑制作用.结论 五倍子和蜂房有效成分组成的实验药物对口腔细菌生物膜的抑制作用不单纯是对口腔生物膜细菌有杀灭作用,还可能通过对口腔细菌生物膜结构的改变调整其内部的细菌组成及抑制细菌生物膜中GTF活性而发挥作用.
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柠檬精油对表兄链球菌致龋毒力因子的影响
目的 探讨柠檬精油降低表兄链球菌(Streptococcus sobrinus,Ss)致龋力的相关机制.方法 自行提取柠檬精油,纸片扩散法测定柠檬精油对Ss的小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),将柠檬精油倍比稀释为小于MIC的4个质量浓度组(分别为0.281、0.563、1.125、2.250 g/L实验组),以胰蛋白胨酵母液体培养基作为对照组.加入108 CFU/ml的Ss菌悬液,厌氧培养6、18、24、48 h.Neson-Somogyi法测定各时间点的还原糖量,计算葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)活性；乳酸-丙酮酸连续检测法测定各时间点乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性；蒽酮法测定各时间点水不溶性多糖(water insoluble glucan,WIG)的含量；pH计测定培养液各时间点pH值,计算实验前和各时点的pH差值(△pH).结果 在同一时点随着柠檬精油质量浓度的升高,GTF、LDH活性、WIG含量及△pH值均逐渐降低,各实验组与对照组间差异均有统计学意义(P＜0.01),GTF、LDH、WIG及△pH的高值均出现在对照组,分别为(6.71±0.61) mIU、(135.8±1.7) U/L、(47.15±5.12) mg/L及(2.67±0.01)；低值均出现在高质量浓度(2.250 g/L)实验组,分别为(0.39±0.07) mIU、(95.0±5.4) U/L、(2.44±0.38) mg/L及(0.61±0.01).结论 低于MIC的柠檬精油仍具有抑制Ss GTF、LDH活性的作用,导致WIG合成减少,细菌产酸量降低.
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融合防龋DNA疫苗pGLUA-P的构建及其细胞表达研究
目的将变形链球菌(Streptococcus mutans)表面蛋白PAc编码A区和P区(A-P)的序列克隆到真核载体pGLU中,构建出GTF-PAc融合防龋DNA疫苗,并检测其在原核细胞和真核细胞中的表达.方法将pCIA-P质粒中A-P片段序列与pGLU质粒连接,构建出GTF-PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P.将pGLUA-P转化大肠杆菌BL21(DE3),以SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白GLUA-P的表达.通过脂质体将pGLUA-P转染大鼠原代肌母细胞,以免疫组织化学检测GLUA-P的表达.结果 GTF-PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P经酶切分析证实携带GLU和A-P片段.pGLUA-P转化的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白.pGLUA-P转染的大鼠原代肌母细胞中可检测到融合蛋白的表达.结论成功地构建了融合防龋DNA疫苗pGLUA-P,所携带的基因序列正确,能够在原核和真核细胞中表达正确的融合蛋白.
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葡糖基转移酶合成肽疫苗的免疫原性研究
目的检测合成的葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)多肽疫苗的免疫原性,有助于研制以合成多肽为基础的防龋疫苗.方法合成融有GTF催化和葡聚糖结合区的27个氨基酸残基肽段,利用ELISA法检测免疫小鼠抗体的产生,通过GTF酶活性与变形链球菌粘附实验测定其抗血清的作用.结果融合多肽疫苗的序列为ANDVDNSNPVVQAEQLYFRANGVQVKG,免疫小鼠脾脏重量显著增加,可有效诱导机体抗体的产生.其免疫血清不仅拮抗GTF的酶活性,而且明显抑制变形链球菌的粘附.结论 GTF多肽疫苗可产生抗体介导的抑制GTF酶活性和抑制葡聚糖结合作用,对龋病的防治十分有价值.
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葡萄糖糖基神经酰胺合成酶特异性小干扰RNA表达载体的构建及其逆转乳腺癌细胞耐药的研究
目的构建葡萄糖糖基神经酰胺合成酶 (GCS) 小干扰RNA表达载体,观察其对乳腺癌耐药细胞(MCF-7/ADR)GCS基因表达和耐药性的影响.方法设计合成2对GCS基因的特异性siRNA,分别定向克隆入真核表达载体pSUPER,构建pSUPER-GCS1和pSUPER-GCS2重组质粒,脂质体Lipofect AMINE 2000介导转染MCF-7/ADR细胞,空载体pSUPER转染作为对照,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析GCS mRNA的表达,流式细胞仪观察GCS蛋白的表达,四氮唑盐法检测阿霉素对MCF-7/ADR细胞的半数抑制浓度(IC50),流式细胞技术检测细胞凋亡率的改变.结果酶切分析和测序证实成功构建了针对GCS的siRNA表达载体pSUPER-GCS1和pSUPER-GCS2.两对重组质粒均可特异性抑制GCS基因表达,转染后48 h GCS mRNA抑制率分别为89.4%、88.5%,GCS蛋白含量分别下降为8.3%±1.0%,9.2%±0.8%,四氮唑盐法显示重组质粒对阿霉素耐药性相对逆转率分别为93.7%、91.6%,明显提高了乳腺癌细胞对于阿霉素的药物敏感性,流式细胞仪结果表明细胞凋亡率增加为15.38±1.16,13.92±1.73,而空载体对照组无以上作用.结论 GCS特异性siRNA表达载体构建成功,且有效抑制了GCS基因表达,并通过诱导耐药细胞凋亡率增加,逆转乳腺癌细胞多药耐药.
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尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A9 I399C＞T单核苷酸多态性对乳腺手术患者异丙酚镇静效应的影响
目的 探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A9 I399C＞T(UGT1A9 I399C＞T)单核苷酸多态性对乳腺手术患者异丙酚镇静效应的影响.方法 择期全麻下行良性乳腺肿块切除术的女性患者152例,年龄20 ～ 50岁,体重50 ～ 70 kg,ASA分级Ⅰ级或Ⅱ级.术前采用基因测序技术进行UGT1 A9 I399单核苷酸多态性位点的检测,根据基因型将患者分为野生纯合子(C/C)组、突变杂合子(C/T)组和突变纯合子(T/T)组.麻醉诱导和维持时均靶控输注异丙酚,Cp 3 μg/ml,输注60 min时采集血样,采用高效液相色谱法测定血浆异丙酚浓度.记录停止输注异丙酚至警觉-镇静(OAAS)评分达4分的时间,此时的BIS值和异丙酚效应室浓度；BIS值升至80的时间及此时异丙酚效应室浓度.结果 野生纯合组24例,突变杂合组96例和突变纯合组32例.等位基因频率T为53％,C为47％.三组患者血浆异丙酚浓度、OAAS评分降至4分时的时间、BIS值、异丙酚效应室浓度和BIS值升至80时的时间、异丙酚效应室浓度比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 UGT1A9 I399C＞T单核苷酸多态性不是引起异丙酚镇静效应个体差异的遗传因素.
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变异链球菌葡糖基转移酶植物表达质粒p2355-gtfB的构建
目的 构建含变异链球菌葡糖基转移酶多个免疫显性抗原表位的植物表达质粒p2355-gtfB,为其转化植物研究奠定物质基础,为可食防龋疫苗研究提供条件.方法 以真核表达质粒pcDNA3-gtfB为模板,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增含编码变异链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB.将回收纯化的PCR产物经T-A克隆技术克隆于中间载体pMD18-T,双酶切鉴定插入方向后,将目的基因从中间载体释放,再克隆至高效的植物表达载体p2355,用电转化法转化根癌农杆菌EHA105,对重组质粒阳性克隆株进行筛选与鉴定.结果 通过对重组质粒T-gtfB进行酶切图谱分析,获得2.9kb和3.7 kb的2个片断,将重组质粒p2355-gtfB进行酶切、PCR及测序分析,显示p2355-gtfB中插入基因长度为3 675 bp,基因序列与双脱氧链终止法的测定结果相同,证明植物表达质粒p2355-gtfB构建成功,开放阅读框架正确.结论 本研究成功构建了含变异链球菌多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因的植物表达质粒p2355-gtfB,为可食性防龋疫苗的研究奠定了基础.
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远缘链球菌中葡萄糖基转移酶催化活性区基因的克隆和初步表达
目的:构建一株高效表达Streptococcus sobrinus 6715 中GTF-Ⅰ催化活性区(含有B细胞表位)多肽的菌株,为抗GTF-Ⅰ的单克隆抗体的检测和防治龋病亚单位疫苗的研究奠定基础.方法:提取基因组DNA,然后用PCR技术扩增出中目的肽段的约1.1 kb编码基因,并将其克隆至表达载体pGEX-4T-1中构建pGEX-gtf表达质粒.该质粒转化大肠杆菌JMl09后获得重组表达菌株.PCR筛选阳性克隆子.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,确定含有pGEX-gtf的大肠杆菌JMl09的表达情况.结果:含有质粒pGEX-gtf的大肠杆菌JM109能够表达GST-GTF融合蛋白.结论:成功扩增目的基因,并且把它定向克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建表达质粒,并且该表达质粒能在大肠杆菌中进行表达.
