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五倍子不同组分对口腔致病菌作用的比较实验研究
目的 比较五倍子不同组分单宁酸、没食子酸对口腔常见致病菌的抑制作用.方法 选用与龋病关系较密切的4种细菌:变异链球菌、粘性放线菌、血链球菌、茸毛链球菌,应用液体二倍稀释法、纸片扩散法测定单宁酸、没食子酸对4种细菌的小抑菌浓度和抑菌圈,从而进一步确定单宁酸和没食子酸的抑菌作用,并对2种成分的抑制作用进行对比研究.结果 单宁酸和没食子酸对这4种细菌的生长均有良好的抑制作用,单宁酸对变异链球菌、茸毛链球菌、血链球菌的MIC为1 mg/mL,对粘性放线菌的MIC为0.5 mg/mL,没食子酸对各细菌的MIC均为8 mg/ml,相同浓度的单宁酸对各致病菌形成的抑菌圈明显大于没食子酸,两者的差别具有统计学意义(P＜0.05).结论 中药五倍子中含有的单宁酸、没食子酸对4种口腔细菌均有很好的抑制作用,单宁酸作用强于没食子酸.
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新型复方中草药抑菌漱口液及其抑菌效果研究
目的 研制一种新型复方中草药抑菌漱口液及其抑菌效果.方法 采用纸片扩散法,对该新型复方中草药口服液体外抑菌效果进行了观察.结果 经过筛选确认该复方中草药口服液组方含黄芩1 000 mg/ml与黄柏125 mg/ml或黄芩500 mg/ml与黄柏2 000 mg/ml.纸片扩散法试验证明,所选出的复方中草药口服液对变异链球菌、乳酸杆菌有明显抑菌作用.该新型复方中草药抑菌漱口液对乳酸杆菌和变异链球菌的MIC值黄芩为62.5 mg/ml、黄柏为7.812 mg/ml.结论 含黄芩、黄柏的新型复方中草药抑菌漱口液可以有效抑制变异链球菌和乳酸杆菌.
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变异链球菌腺苷磷酸硫酸酶的原核表达及功能研究
目的 构建变异链球菌aps基因原核表达载体,表达纯化目的蛋白,继而对其生物学功能进行初步鉴定. 方法 以变异链球菌UA159株基因组DNA为模板PCR扩增变异链球菌aps基因编码区,插入原核表达载体pASK-IBA43 plus,转化E.coli Top 10,无水四环素诱导His-APS蛋白表达,经Ni-NTA纯化后,检测His-APS蛋白腺苷磷酸硫酸酶活性及核糖核酸酶活性. 结果 PCR扩增出933 bp的aps基因开放读码框,成功构建aps基因原核表达载体pASK-aps,并在E.coli Top 10中诱导表达,SDS-PAGE检测重组His-APS蛋白分子质量单位为38 ku,该蛋白在Mg2+及Mn2+存在条件下能水解pAp,且呈时间及浓度依赖性,但不能降解Cy5标记的随机6nt寡核苷酸探针. 结论 重组His-APS蛋白具有腺苷磷酸硫酸酶活性,呈时间及浓度依赖性,但不具有核糖核酸酶活性.
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clpC 基因对变异链球菌感受态形成的影响
目的：构建变异链球菌clpC缺陷突变株，检测该基因对变异链球菌感受态形成的影响。方法分别以变异链球菌UA159基因组和pIB107质粒为模板，PCR扩增clpC基因片段和卡那霉素基因盒（lox71-KMR-lox66）；将clpC基因片段插入pMD-19T simple载体，经ClaⅠ／EcoRⅠ酶切、补平后连入卡那霉素基因盒，构建clpC缺陷突变同源重组载体pCKX2；SalⅠ线性化pCKX2并转化变异链球菌，卡那霉素筛选阳性菌落；质粒pCrePA转化阳性菌株，30℃培养剔除卡那霉素基因盒；37℃培养去除pCrePA，获得clpC缺陷突变株，PCR和测序鉴定；提取细菌总RNA并逆转录成cDNA，用RT-PCR法扩增clpC缺失序列的核苷酸片段并进行产物的电泳分析；pDL276分别转化变异链球菌和clpC缺陷突变株，观察感受态细胞形成变化。结果 PCR和测序结果证实成功构建同源重组载体pCKX2及变异链球菌clpC缺陷突变株；RT-PCR结果显示，△clpC缺失的核苷酸片段PCR产物电泳结果并无相应的条带出现；clpC缺陷突变株的感受态形成期延迟并延长维持期。结论 clpC基因具有负调控变异链球菌晚期感受态细胞形成的作用。
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变异链球菌生物膜结构观察
目的建立变异链球菌生物膜模型,用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察变异链球菌生物膜结构. 方法在盖玻片上分别形成6、12、18、24、48、72 h变异链球菌生物膜,将得到的各时段生物膜荧光染色后,用CLSM观察生物膜的断层扫描图像、生物膜厚度、每层红光绿光的面积,计算生物膜中细菌密度和活菌百分比,用软件处理扫描数据,得到生物膜的三维重建图像. 结果变异链球菌生物膜具有空间立体结构,形态多样,其中细菌密集,由死细菌和活细菌组成,还有丰富的基质和管道系统.24 h生物膜平均厚度大,生物膜内层、中间层的细菌密度相对较大,而外层较低,72 h内各时间段生物膜中活菌百分比由内往外逐渐增加. 结论变异链球菌生物膜有一定的厚度,具有三维立体空间结构,结构形态具有多样、不均质、开放的特点.
关键词： 变异链球菌 生物膜 激光共聚焦扫描显微镜 -
变异链球菌临床株乳酸脱氢酶mRNA水平的表达研究
目的分析来自不同龋敏感人群变异链球菌不同基因型乳酸脱氢酶(LDH)的基因表达差异,探讨mRNA水平上基因表达与蛋白生物学功能及细菌致龋性的关系.方法应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件分析,分别对20株来自不同基因型的LDH进行基因表达水平差异的评价和比较.结果两种不同基因型LDH的mRNA表达水平不同(P＜0.05),表现为低酶活性的B基因型ldh表达高;高龋和无龋菌株ldh表达的差异无统计学意义(P＞0.05).结论变异链球菌乳酸脱氢酶基因表达水平具有遗传异质性,产酸因子ldh基因表达高低与龋病活跃性不呈正相关关系.
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同时失活HtrA和ClpP对变异链球菌适应性耐酸能力的影响
变异链球菌的适应耐酸能力是它适应牙菌斑中动态变化酸性环境的关键致龋机制.本实验前期构建变异链球菌htrA-clpP双基因缺陷株(简称htrA-clpP 缺陷株),来探究HtrA和ClpP两种蛋白在变异链球菌耐酸性过程中相互作用机制.将标准株和htrA -clpP缺陷株常规复苏,收集细菌沉淀物用生理盐水适当稀释成菌液备用,用TPY液体培养液分别对两种菌液进行稀释,培养至对数中期后得到细菌沉淀物分成两份,分别加入与上清液等体积的pH5.5(预酸化处理)或7.0 TPY液体培养基中培养5h后收集4种细菌沉淀物,将其加入等体积pH3.0 TPY液体培养液中,在0、1.0、2.0、3.0h取菌液进行逐步稀释,在TPY固体培养基计数,计算生存率,实验步骤重复3次.
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变异链球菌LuxS基因缺陷株的建立及其耐酸能力的研究
目的 建立LuxS基因缺失的变异链球菌突变菌株,并对突变株的耐酸能力进行研究.方法 以变异链球菌UA159为材料,运用基因重组方法将红霉素抗性基因(Eymr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到质粒载体PUC19的多克隆位点中,获得了具有红霉素抗性的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用红霉素抗性筛选出LuxS基因缺失的突变株.检测变异链球菌LuxS基因突变菌株在不同pH环境下生长情况,并以正常菌株为对照.结果 PCR基因扩增结果显示,突变株LuxS基因已被Eymr基因完全替换,不能再编码合成AI-2(autoinducer 2)信号分子,扩增产物经DNA测序证实筛选得到了LuxS基因缺失的突变株,并且突变株不能诱导V.harveyi BB170的生物发光.与变异链球菌标准菌株相比,LuxS基因突变株的生长情况随着pH的降低受到明显抑制.结论 本研究成功构建LuxS基因缺失的变异链球菌突变株,LuxS感应信号系统参与变异链球菌耐酸能力的调控,LuxS基因缺失菌株耐酸能力降低.
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luxS基因缺失对变异链球菌氧化应激的影响及机制初探
目的 探讨luxS基因缺失对变异链球菌氧化应激的影响及可能机制.方法 变异链球菌标准株和luxS基因缺陷株培养至对数中期分成3组,一组作为对照组在普通乳酪消化胨酵母(TPY)培养液中生长,另两组作为实验组,其中一组加入过氧化氢终浓度58.8 mmol/L的TPY培养液中,另一组加入含有铁螯合剂2,2'-联吡啶的过氧化氢终浓度为58.8 mmol/L的TPY培养液中.分别在厌氧培养的0.5、1、2h取菌液采用平板活菌计数法测定活菌数,计算生存率,统计学分析.结果 和对照组相比,实验组中luxS基因缺陷株的生存率在所测定的时间点均高于标准株(P＜0.05)；与不含铁螯合剂的实验组相比,铁螯合剂的加入并未提高菌株的过氧化氢耐受力(P＞0.05).结论 luxS基因参与变异链球菌氧化应激耐受的调节；该氧化应激耐受并不是通过避免芬顿反应(Fenton reaction)毒性作用实现的.
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变异链球菌luxS基因缺陷突变株生物学性状的初步观察
目的 为研究口腔主要致龋菌变异链球菌的种属间密度感应(quorum sensing)相关基因luxS对口腔生态的影响,构建此菌的luxS基因缺失突变株.方法 采用同源重组的方法,利用红霉素耐药基因erm置换变异链球菌基因组中的luxS基因,并在含抗性标记的选择性培养基上筛选出阳性克隆.初步研究该基因的缺失突变对变异链球菌在生长与生物被膜成熟分化中的作用.结果经PCR鉴定,luxS基因的置换突变位置正确,并能在体外稳定传代,突变株与野生株相比在达静止期后总菌数量上有明显差别,但在生物被膜的形成与分化上并未发现显著差异.结论 通过此研究建立了可稳定传代的变异链球菌luxS基因的缺失突变株,生长表型和生物被膜的形成与野生株无显著差异,为进一步研究此基因功能与调控机制提供了技术平台.
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靶向融合防龋重组质粒pGJA-P免疫定菌鼠的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans,S. mutans)是公认的主要致龋菌,细胞表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶(glucosyltransferases,GTFs)是S.mutans的重要致龋毒力因子.我们构建了同时针对PAc和GTF的融合防龋重组质粒pGLUA-P,经动物实验证实确有防龋作用.Boyle等提出同时表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)和目的抗原融合蛋白的DNA疫苗能加快和增强免疫反应,原因是通过CTLA4与APC表面的B7结合,目的抗原被靶向引导至APC,从而加强了APC对目的抗原的提呈作用.据此我们在pGLUA-P中引入编码人CTLA4胞外区和Igγ1恒定区的基因,构建出靶向融合防龋重组质粒pGJA-P.本实验用pGLUA-P和pGJA-P重组质粒免疫定菌鼠,观察CTLA4的靶向作用对免疫效果的影响.
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变异链球菌F-ATPase亚基β基因多态性及表达研究
目的 研究变异链球菌(Streptococcus mutans,简称变链菌)临床分离株耐酸因子F-AT-Pase亚基β结构基因uncD的遗传多态性和mRNA表达水平差异,探讨其与细菌耐酸力的关系.方法 实验株包括18株高耐酸和20株低耐酸变链菌临床株,以特异引物从细菌组DNA扩增uncD,行限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)和测序比较;应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件,对20株不同基因型和不同耐酸力变链菌uncD基因的mRNA表达水平进行评价和比较.结果 AluⅠ-RFLP产生A、B基因型,测序证实导致多态出现的基因变异不在uncD的功能区和催化结构域;这两种基因型在不同耐酸力菌株的分布不同(P＜0.05),高耐酸性菌株中A型基因uncD的检出高于低耐酸力菌株.不同耐酸力菌株uncD的mRNA表达水平不同(P＜0.05),但A、B两基因型菌株uncD的mRNA表达差异没有统计学意义(P＞0.05).结论 F-ATPase的β亚基基因具有明显的遗传多态性,基因型和mRNA表达水平的多态性与菌株的耐酸力有一定的关系,虽然β亚基基因功能区高度保守,但在酸耐受适应中,仍表现为F-ATPase较活跃上调的亚基基因.
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变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因失活菌株的构建和鉴定
目的利用基因打靶技术构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因(gbpD)失活株,用于葡聚糖结合蛋白D基因功能的研究.方法体外培养变异链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因内部序列进行PCR扩增,连接自杀载体pVA8912,分别用酶切及PCR鉴定;转化变异链球菌UA159株,用PCR及Western blot鉴定.结果经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符,且为所需目的基因片段,成功构建了自杀质粒pVA8912-gbpD;经PCR鉴定及Western blot鉴定,gbpD基因失活株基因组中gbpD基因内部成功插入目的片段,且该菌株不表达GbpD蛋白.结论成功构建了用于变异链球菌gbpD基因打靶的自杀质粒和gbpD基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础.
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变异链球菌的传播、定植及其与唾液sIgA的关系
目的 利用夫妻配对模式,纵向监测变异链球菌的基因型,探讨其传播和定植的特点,以及唾液sIgA与不同基因型菌株的免疫印迹的差异.方法 选择9对夫妻,取口腔唾液和牙菌斑的样本,计数唾液中变链菌数,牙菌斑中变链菌分离株采用PCR技术鉴定菌种,限制性核酸内切酶分析REA基因型.每隔2个月取样1次,经过3次跟踪鉴定分离菌株的基因型.Westem blot分析个体唾液sIgA与自身变链菌株、配偶菌株、2株参考菌株GS-5、Ingbritt C的免疫印迹反应.结果 (1)变链菌菌株的定植是稳定的,一般只有1～2种基因型.在正常成年人群,变链菌可以出现短暂的一过性传播,但外源性变链菌株难以长期定植.(2)个体sIgA对自身菌株的免疫印迹可以不同于对配偶的反应.(3)不同唾液sIgA对参考菌株的免疫印迹存在个体差异.结论 个体变异链球菌在口腔中的定植是稳定的,该菌株的定植和对外源性菌株的排斥不是由sIgA单因素决定的.
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差异显示技术对变异链球菌生物膜基因表达差异的分析
目的对生物膜和浮游状态下的变异链球菌细胞进行比较研究,采用限制性酶切差异显示技术比较分析两者的基因表达谱.方法分别收集变异链球菌浮游菌细胞与贴壁的生物膜细胞,分离纯化总RNA,对于逆转录获得的cDNA进行限制性酶切差异显示PCR技术(RFDD-PCR)比较分析两者的表达谱,对于获得的差异表达片段通过克隆测序并于BLAST比对获得这些片段的基因信息,进而推断其功能.结果通过对差异片段的分析,确证其中4条片段分属结构基.fruA、SMU.438c、SMU.751与adhB/C.结论限制性酶切差异显示技术可用于分析生物膜形成过程中基因表达的差异.
关键词： 变异链球菌 限制性酶切差异显示技术 生物膜基因表达差异 -
变异链球菌表面蛋白质抗原真核表达质粒的构建及免疫动物的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans, S.mutans)是龋病主要致病菌，S.mutans的表面蛋白质抗原PAc是其主要毒力因子之一，参与了唾液介导的S.mutans在牙面的粘附。S.mutans PAc分子的氨基端不仅富集免疫显性T、B细胞表位，而且含有唾液糖蛋白结合区，因此氨基端是理想的表位多肽防龋疫苗选择区。此外，Streptococcus sobrinus（S.sobrinus）的PAg分子与S.mutans PAc分子的氨基端具有保守的B细胞表位，以PAc分子该区段制备的多肽疫苗可激发宿主对S.sobrinus的交叉保护性反应。因而，初次以变异链球菌表面蛋白质抗原PAc氨基端的编码基因构建真核表达质粒，免疫BALB/c小鼠，观察所诱导的体液免疫应答，为基因疫苗防龋的动物实验提供资料。
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不同功率密度光动力对浮游态和生物膜态变异链球菌的杀伤作用
目的 探讨以血卟啉单甲醚(Hematoporyrin monomethyl ether,HMME)为光敏剂,不同功率密度的光动力疗法(Photondynamic Therapy,PDT)对浮游态和生物膜态两种状态下的变异链球菌的杀伤作用.方法 将变异链球菌制备成菌悬液和釉质生物膜模型80块,分为PDT组和对照组;其中PDT组按照不同处理方式又分为35mW/cm2组(A组)、70 mW/cm2组(B组)、140 mW/cm2组(C组)、280 mW/cm2组(D组)、单纯光敏剂(E组),单纯激光照射(F组)6个小组;0.05％洗必泰(G组)、0.9％生理盐水组(H组)为阳性、阴性对照组.实验采用波长532 nm的半导体激光为光源,HMME光敏剂浓度为40 μg/ml,比较在相同能量密度不同功率密度下光动力对变异链球菌的杀伤作用.结果 相同功率密度的PDT处理组、洗必泰组对定植在生物膜中的变异链球菌的杀伤作用均低于浮游态.PDT组中的A、B、C和D组与洗必泰组(G组)的杀菌率从51.29％、67.07％、94.95％、96.25％、57.29％降到了30.92％、44.01％、75.44％、85.10％、41.75％.PDT对同种状态下变异链球菌的杀菌率随功率密度的增加逐渐增大.结论 生物膜态的变链对PDT和抗菌剂有较强的抵抗性,在今后的实验中需设法降低生物膜的抵抗性并寻找合适的光强度来增强PDT的杀伤作用.
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变异链球菌心脏瓣膜感染及败血症1例报道
1 病例患者,女,9岁,学生.于2000年4月25日因心脏杂音入院,临床诊断为先天性心脏病,动脉导管未闭,肺动脉高压(重),二尖瓣赘生物、关闭不全,心功能Ⅱ级,心内膜炎.入院后高热不退,2000年5月1日血液培养出草绿色链球菌,进一步鉴定为变异链球菌群,2000年5月9日行动脉导管修补术、二尖瓣置换术,瓣膜组织又一次培养出草绿色链球菌,进一步鉴定仍为变异链球菌群.
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支架用钴铬合金表面镀金对变异链球菌粘附的影响
目的：研究支架用钴铬合金表面镀金对变异链球菌粘附能力的影响。方法将义齿支架用钴铬合金制作成试件，随机分为实验组和对照组，每组30块。实验组表面镀金处理，对照组表面不做任何处理。用SJ-201便携式表面粗糙度仪检测两组粗糙度差异。通过细菌体外粘附实验分析4h、8h、12h时每组试件表面变异链球菌的粘附量。通过测定粘附于试件表面的变异链球菌表达CAT(报告基因产物)的活性，确定镀金处理对变异链球菌合成细胞外多糖能力的影响。结果实验组试件表面变异链球菌的粘附量均少于对照组(P<0.05)；其表达CAT的能力明显低于对照组(P<0.05)。结论钴铬合金表面镀金可有效抑制变异链球菌的粘附，作用机制可能与其抑制gtfB基因表达有关。
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模拟微重力对变异链球菌gtfs mRNA表达的影响
目的：观察变异链球菌在模拟微重力环境下形态学的变化，及对其葡糖基转移酶基因(gtfs)mRNA表达的影响。方法：采用旋转培养系统(rotary cell culture system，RCCS)建立模拟微重力细菌培养模型，将变异链球菌分为模拟微重力组和对照组。在37℃厌氧环境(80％N2，20％CO2)下培养24h，收集模拟微重力组及对照组菌体，通过扫描电镜、透射电镜观察细菌的形态学变化；并通过Q-PCR方法检测模拟微重力对变异链球菌gtfB，gtfC，gtfD mRNA表达的影响。结果：扫描电镜图片显示，模拟微重力组细菌之间的不定形胶冻样物质明显少于对照组；透射电镜观察显示模拟微重力组细菌的荚膜部分减少，分裂状态下的细菌两极不对称。模拟微重力条件下变异链球菌gtfB、gtfC、gtfD mRNA表达水平呈下降趋势，与对照组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论：模拟微重力环境下变异链球菌的超微结构有显著改变，对其gtfB、gtfC、gtfD mRNA表达有明显的抑制作用。
