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结核分支杆菌含信号肽的mtb8.4基因的克隆及真核表达质粒的构建
目的:对结核杆菌新抗原-带信号肽的mtb8.4(MS)进行基因克隆,构建其真核表达质粒并加以鉴定.
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结核分支杆菌抗原ESAT-6基因真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定
目的:用结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6基因构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-ESAT-6,并鉴定其在真核细胞(COS-7)中表达的蛋白.
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白实验性核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究
扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)长春分离株ORF5基因,并将其克隆至真核表达载体pVAX1、pVIR-IL-18的CMV启动子下游,构建成真核表达质粒.通过Western blot以及IFA检测方法确认,所构建的2个重组DNA疫苗质粒在真核细胞能进行有效的转录,并表达了目的蛋白(GP5).同时辅以不同佐剂进行了BALB/c小鼠免疫试验,检测了免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量.结果表明:共表达猪IL-18基因的核酸疫苗pVIR-IL-18-ORF5免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量均优于pVAX1-ORF5,而且加佐剂实验组优于未加佐剂的实验组.
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口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装
PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1(+);另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGETTM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D.将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳.结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白.其中重组质粒pTARGET/P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳.
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刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建
目的 构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白11(ROP11)的真核表达重组质粒并在真核细胞中表达目的蛋白. 方法 设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RT-PCR方法扩增ROP11基因并克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1 ROP11.将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达. 结果 RT-PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1 548 bp,与预期大小相符.构建的重组质粒pcDNA3.1-ROP11经PCR及EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切鉴定正确.重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99%.免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光. 结论 成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础.
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弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建
目的 构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4. 方法 根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamH Ⅰ和BamH Ⅰ/Xba Ⅰ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamH Ⅰ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定. 结果 PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100%.构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722 bp的SAG1基因片段和511 bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中. 结论 成功克隆了pVAX1 SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础.
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刚地弓形虫ROP18基因的克隆及生物信息学分析
目的 对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18 (TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列. 方法 提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR (RT-PCR)扩增ROP18基因,并对其产物进行测序;采用在线生物软件预测TgROP18蛋白的结构与功能. 结果 TgROP18基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小为1 665 bp;测序分析显示,ROP18基因序列与GenBank上已发表的序列完全一致.TgROP18蛋白含有554个氨基酸,分子式为C2753H4405N801O811S20,分子质量单位为62.34 ku,理论等电点为9.34;在TgROP18蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为41.52%、19.13%、7.76%和31.59%;TgROP18蛋白含有10个亲水性较高的区域(临界值为2.0),28个表面可及性较高的区域(临界值为1.9),10个保守结构区域,7个翻译后修饰位点,21个B细胞抗原表位,21个CTL抗原表位及26个Th抗原表位有. 结论 生物信息学分析表明,TgROP18蛋白具有良好的免疫原性,这将为弓形虫疫苗的研究提供基础资料.
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小鼠Qa-1基因有效shRNA干扰质粒的构建与筛选
本研究构建3个针对小鼠Qa-1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,观察其对Qa-1基因的沉默作用,筛选出有效靶位.通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具,选择3段针对Qa-1的siRNA,交由晶赛公司合成3个小发夹表达质粒,采用脂质体转染法转染NIH3T3细胞,第1、2、3组细胞分别转染3个小发夹表达质粒,第4组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照,收集转染后24、48、72小时的细胞,用RT-PCR技术及流式细胞术对Qa-1在RNA水平的变化和细胞表面表达进行分析,筛选有效的干扰片段.结果表明:成功构建了3个针对小鼠Qa-1的小发夹表达质粒.RT-PCR及流式细胞术检测证实,转染后3个组shRNA我体均可抑制Qa-1基因的表达,但抑制程度不一:24、48、72小时3个组细胞表面Qa-1表达减低率分别为H2-T231:60.9%,81.9%,43.6%;H2-T232为:64.5%,73.9%,61.1%;H2-T233为:61.9%,71.2%,47.5%.其中H2-T232组在3个时间点抑制作用均明显.结论:构建的3个针对Qa-1的小发夹表达质粒均能抑制Qa-1的表达,其中H2-T232具有有效抑制作用.
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小鼠pcDNA3.1(+)-烯酰水合酶辅酶1真核表达质粒的构建及鉴定
淋巴道转移是影响上皮来源恶性肿瘤患者预后的重要因素[1],澄清其转移机制意义重大.烯酰水合酶辅酶1(enoyl coenzyme A hydratase 1,ECH1)是一种具有烯酰辅酶水合酶活性的酶,该基因表达于细胞的过氧化物酶体,与多种肿瘤相关.
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人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因对人喉鳞癌细胞系表皮生长因子受体和基质金属蛋白酶9表达的影响
表皮生长因子受体(EGFR)和基质金属蛋白酶(MMP)9在肿瘤的侵袭和转移发生过程中发挥着重要作用,其表达上调能导致肿瘤的侵袭和转移潜能增强.人乳头状瘤病毒16(HPV16)为喉鳞癌的主要致病因素,其主要转化活性部位在E6和E7开放读码框架.我们采用脂质体转染技术将携带有HPV16-E6/E7 DNA的真核表达质粒导入HPV阴性的Lscc-02喉鳞癌细胞系,使其在细胞中表达,研究其对Lscc-02喉鳞癌细胞系EGFR和MMP-9 mRNA及蛋白表达的影响,探讨HPV16-E6/E7基因与喉鳞癌演进及预后的关系.
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CVB3病毒VP1基因及其真核表达质粒的原子力显微镜图象
原子力显微镜(AFM)是一种具有原子级分辨率的超微结构研究工具.与传统的X射线衍射、电镜等方法相比,它具有分辨率高、制样简单、可在接近生理条件下成像等优点.本研究拟用AFM观察柯萨奇B3病毒(CVB3)VP1基因及其真核表达质粒,探讨AFM在观察线性和质粒DNA中的应用.
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CpG寡核苷酸增强UPEC FimH疫苗黏膜免疫的实验研究
尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是引起尿路感染(UTI)的主要病原菌.FimH蛋白是UPEC I型菌毛的黏附成分,介导UPEC侵入膀胱上皮细胞.本实验用FimH的真核表达质粒和蛋白免疫小鼠可产生较高浓度的IgG抗体.为提高尿路黏膜中保护性ISA的水平.以CpG质粒为佐剂,与FimH的真核表达质粒和原核表达蛋白进行不同组合免疫小鼠,观察不同组的小鼠产生的免疫反应.
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幽门螺杆菌BabA2/UreI融合基因表达质粒的构建
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)疫苗被认为是控制Hp感染有效的方法之一.本研究联合应用Hp BabA2和UreI基因作为构建HpDNA疫苗的目的基因,成功构建了pcDNA3.1/BabA2/UreI真核表达质粒.
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小鼠psIL-12质粒抗结核分枝杆菌感染的研究
目的观察、评价小鼠白细胞介素12真核表达质粒psIL-12对结核分枝杆菌感染小鼠细胞因子水平的影响及疗效.方法结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠随机分成生理盐水、pcDNA3.1对照组,psIL-12治疗组,每组各6只.感染4周后分别予以生理盐水、pcDNA3.1、psIL-12,第1次治疗后8周处死检测器官活菌数,脏器重量指数(WI),脾淋巴细胞特异性IFN-γ、IL-4细胞因子分泌水平,并观察肺、脾组织病理改变情况.结果 psIL-12治疗组肺组织活菌数(每mg log10CFU/ml)为7.41±0.50,与对照组(8.15±0.37、8.19±0.29)比较显著降低(P<0.05);脾组织荷菌量(每mg log10 CFU/ml)为5.31±0.21,与对照组(5.76±016、5.88±0.21)比较显著降低(P<0.05).psIL-12治疗组脾脏重量指数为0.58±0.05,与对照组(1.02±0.08、1.10±0.02)比较显著降低(P<0.05).脾淋巴细胞IFN-γ(pg/ml)为478.0±10.1,与对照组(134.5±15.7、125.1±8.2)比较显著升高(P<0.05).各组间IL-4水平差异无显著性.对照组肺组织病理改变以变质、渗出为主,而psIL-12治疗组以增生改变为主.对照组与治疗组间比较脾脏病理改变不明显.结论 psIL-12真核表达质粒对小鼠结核分枝杆菌感染有一定的治疗作用,可能通过诱导促进IFN-γ产生,调节TH1/TH2应答类型,起到抗结核分枝杆菌感染的作用.
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人乳头瘤病毒11型L1/CD80嵌合真核表达质粒的构建和鉴定
生殖道尖锐湿疣主要是由人乳头瘤病毒6型(HPV6)和11型(HPV11)感染引起.HPV病毒仅存在终末分化的复层鳞状上皮组织中,含量很少.HPV病毒的晚期表达基因L1所表达的外壳蛋白不仅是主要的外壳蛋白,还是主要的病毒抗原蛋白,在宿主细胞表面有其蛋白受体,可成为预防性疫苗理想的靶抗原.
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CD80作为分子佐剂增强HPV11 E7免疫效果的观察
构建的人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)11型E7基因DNA真核表达质粒,在真核细胞获得有效表达.为增强其作为尖锐湿疣治疗性疫苗的免疫效果,现将E7基因与协同刺激分子CD80(所-1)进行连接重组,构建HPV11E7-CD80嵌合DNA真核表达质粒,并将其免疫小鼠,研究其诱导的免疫效应.
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结核杆菌Ag85B DNA疫苗的制备及其免疫效应初探
将结核杆菌抗原Ag85B基因克隆到真核表达质粒pcDNA3中,构建成重组pcDNA3-Ag85B,作为抗结核的DNA疫苗,观察其对小鼠免疫应答的能力,为进一步研制抗结核疫苗提供依据.
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弓形虫DNA疫苗联合诱导BALB/c小鼠保护性免疫力的研究
弓形虫表面抗原P30和P22是弓形虫疫苗的候选抗原.本研究将构建的真核表达质粒pBK-P30和pBK-P22联合免疫小鼠,初步观察其免疫保护效果.
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变异链球菌表面蛋白质抗原真核表达质粒的构建及免疫动物的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans, S.mutans)是龋病主要致病菌,S.mutans的表面蛋白质抗原PAc是其主要毒力因子之一,参与了唾液介导的S.mutans在牙面的粘附。S.mutans PAc分子的氨基端不仅富集免疫显性T、B细胞表位,而且含有唾液糖蛋白结合区,因此氨基端是理想的表位多肽防龋疫苗选择区。此外,Streptococcus sobrinus(S.sobrinus)的PAg分子与S.mutans PAc分子的氨基端具有保守的B细胞表位,以PAc分子该区段制备的多肽疫苗可激发宿主对S.sobrinus的交叉保护性反应。因而,初次以变异链球菌表面蛋白质抗原PAc氨基端的编码基因构建真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察所诱导的体液免疫应答,为基因疫苗防龋的动物实验提供资料。
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大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中的表达
目的:构建并鉴定大鼠Smad7真核表达质粒,观察外源Smad7对肝星状细胞HSC-T6的转染.并进一步研究其对TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA达水平的影响.方法:采用基因重组技术将Smad7 cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染HSC-T6细胞,分为正常对照组、空质粒组及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞,运用Western blot检测Smad7蛋白表达情况,RT-PCR检测Smad7、TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照、空质粒组比较,Smad7 mRNA表达显著增加(1.053±0.009 VS 0.984±0.054,0.986±0.044,P<0.01或0.05),蛋白水平显著上调(0.083±0.02 VS0.058±0.050,0.056±0.064,均p<0.05:Smad7转染组TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA表达降低(0.961±0.013 VS 1.039±0.013,1.032±0.037;0.592±0.096 VS 0.767±0.085.0.770±0.090,均P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义.正常对照、空质粒组Smad7 mRNA和蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNAA达差异无统计学意义.结论:smad7可能参与TGF-β/smad信号转导,在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性.