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TORCH是什么检验项目?
我国每年约有60万左右婴儿伴有出生缺陷,出生缺陷发生概率为130.1万.遗传因素和环境因素是出生缺陷的两个主要原因.孕期病原体感染是为重要的环境致畸因素.TORCH是一组病原微生物的英文名称缩写.T代表刚地弓形虫(Toxopasma),O代表其他感染性病原体,R代表风疹病毒(Rubella virus),C代表巨细胞病毒( Cytomegalo virus),H代表单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型( Herpes virus).
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应用ELISA和IHA检测粤东梅州丘陵山区人群血清弓形虫抗体
为了解粤东丘陵山区健康人群弓形虫病的感染情况.方法:用ELISA和IHA两种血清学检测方法进行互补检测.结果:共检1 010人,血清弓形虫抗体阳性157人,阳性率为15.54%.在157例阳性中,除90例双阳性外(ELISA和IHA),还有67例单项阳性(ELISA或IHA),其中ELISA阳性而IHA阴性23例,IHA阳性而ELISA阴性44例.结论:地处粤东丘陵山区的梅州市人群弓形虫病感染率较高,应引起重视.对弓形虫病的实验诊断以选用两种血清学方法同时检测为佳.
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刚地弓形虫培养上清抑制肺癌A549细胞系增殖
目的 研究刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)培养上清对体外培养的肺癌细胞A549增殖及细胞周期的影响.方法 取对数生长期的A549细胞(浓度为5×10~4mL~(-1))分别接种于不同细胞培养板,对照组加入RPMI-1640孵育,试验组加入相同体积不同数量(4×10~7 mL~(-1)、8×10~7mL~(-1)、16×10~7 mL~(-1))弓形虫速殖子培养上清孵育不同时间后,四甲基氮噻唑蓝(MTr)法检测吸光度(A_(490)值);PI染色后检测细胞周期;以Western blot检测细胞周期蛋白cyclinB1、cdc2表达或活性.结果 弓形虫培养上清呈时间剂量依赖性抑制A549细胞系增殖,处理组细胞周期在(G_2/M期产生阻滞;A549细胞系的cyclinB1、cdc2蛋白表达量下降.结论 刚地弓形虫培养上清能够抑制肺癌A549细胞系增殖,并通过调节cyclinB1、cdc2等蛋白表达或活性改变引起肺癌A549细胞系G_2/M期阻滞.
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弓形虫 SAG2和 GRA2基因疫苗的免疫保护研究
DNA疫苗是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组体，直接接种机体，在接种部位摄取表达并达到抗感染目的的一种疫苗。 pCMV-Taq2B载体具有人巨细胞病毒（ Human cytomegalovirus， CMV）高效启动子／增强子序列，可使目的基因在真核细胞中高水平稳定表达成为DNA疫苗载体。构建pCMV-Taq2B-Surface antigen 2（表面膜抗原2）（ pSAG2）、 pCMV-Taq2B-Dense granule protein 2（致密颗粒蛋白2）（pGRA2）及 pCMV-Taq2B-SAG2-GRA2（ pSAG2-GRA2） DNA 疫苗并研究其免疫保护效果。将 pSAG2、pGRA2、 pSAG2-GRA2 DNA疫苗（实验组）、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline， PBS）、 pCMV-Taq2B空质粒（对照组）分别肌肉注射BALB／c小鼠， ELISA法检测血清IgG抗体水平。末次免疫后第28 d，各组每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子1000个，观察小鼠的生存时间。结果显示单基因疫苗pSAG2、 pGRA2和双基因疫苗pSAG2-GRA2免疫组均能诱导产生特异性IgG抗体，且于末次免疫后第28 d达到高值，此时单基因疫苗pGRA2（0.382±0.66）和双基因疫苗pSAG2-GRA2（0.548±0.137）免疫组吸光度值显著高于PBS （0.137±0.016）或pCMV-Taq2B （0.135±0.010）对照组吸光度值。免疫单基因疫苗pSAG2（14.3±1.8）、 pGRA2组（13.5±2.1）小鼠存活时间（d）明显长于PBS （4.3±1.6）及pCMV-Taq2B组（4.1±1.3），且双基因疫苗 pSAG2-GRA2组（19.6±2.4）小鼠存活时间明显长于单基因疫苗 pSAG2组及pGRA2组。弓形虫双基因疫苗pSAG2-GRA2能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，其免疫保护性优于pSAG2、 pGRA2单基因疫苗。
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弓形虫gra14基因真核表达载体的构建及其免疫保护性研究
构建弓形虫致密颗粒蛋白14 (GRA14)的真核表达质粒,研究其对小鼠的免疫保护力.扩增弓形虫RH强毒株gra14基因并构建pVAX1-gra 14真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠.60只小鼠随机分成4组,实验组小鼠肌肉注射100 μg pVAX1-gra14质粒,对照组分别注射PBS(100 μL/只)和pVAX1空质粒(100μg/只),空白对照不作处理.共免疫3次,每次间隔14d.ELISA法检测免疫后IgG、亚型抗体和细胞因子水平.攻击实验后比较小鼠生存率,分析pVAX1-gra 14的免疫保护作用.结果显示成功扩增gra14基因并构建真核表达载体,Western blot结果显示目的基因成功表达并具有反应原性,pVAX1-gra14免疫后小鼠的IgG抗体水平显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达量分别为652.47±14.55、455.53±7.88、228.13±14.51和252.13±14.20 pg/mL,同时免疫后实验组小鼠的生存时间相比对照组显著延长,平均生存时间为14.1 ±1.3 d.以上结果表明,pVAX1-gra14能够诱导特异细胞免疫和体液免疫反应,产生一定的免疫保护作用.
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深圳人群弓形虫感染的血清流行病学调查研究
为了调查目前深圳地区人群弓形虫感染情况,本文自1997年至1999年采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对深圳地区不同人群1 220份血清进行检查,结果总人群IgG阳性率为11.15%,IgM阳性率为0.25%.其中,幼儿组、青少年组、成年组、老年组IgG阳性率分别为2.33%、5.68%、8.90%、10.23%;动物饲养员、屠宰工人的阳性率为23.57%、25.00%,与阳性率分别为14.66%、7.14%、6.32%、5.68%的饮食业人员、目前没有与动物接触职业者、医务工作者、中学生之间有显著性差异(P<0.005);男性IgG阳性率为11.73%,与IgG阳性率为10.66%的女性比较无差异(P>0.5).结果显示深圳地区人群感染率有随年龄递增而升高趋势,且不同职业之间亦有显著差异性,但性别差异无显著性.
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重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2联合IL-2、IFN-γ佐剂鼻内免疫小鼠诱导的小肠黏膜免疫应答
为探讨IL-2和IFN-γ的佐剂效应,本研究观察了重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2(rTgPGAM2)联合IL-2或IFN-γ滴鼻免疫小鼠诱导小肠黏膜IgA抗体分泌细胞(IgA-ASCs)和小肠冲洗液sIgA的免疫应答.将48只6周龄雌性BALB/c小鼠随机均分为6组,免疫组分别用500 IU IL-2、1000 U IFN-γ、30 μg rTgPGAM2、30 μg rTgPGAM2+500 IU IL-2或30 μg rTgPGAM2+1000 U IFN-γ滴鼻免疫小鼠,抗原和佐剂溶于20 μL PBS中,对照组用20 μL PBS滴鼻.免疫3次,一免和二免间隔2周,二免后1周三免.三免后第14天,颈椎脱臼处死小鼠,免疫组化检测小鼠十二指肠、空肠和回肠黏膜中IgA-ASCs,计算阳性率,ELISA测定小肠冲洗液sIgA水平.结果表明,免疫组十二指肠、空肠和回肠黏膜中IgA-ASCs 阳性率高于PBS组,其中rTgPGAM2、rTgPGAM2联合IL-2或IFN-γ佐剂组差异显著(P<0.05或P<0.01).rTgPGAM2联合IL-2或IFN-γ佐剂组小肠冲洗液sIgA水平显著高于PBS组(P<0.01).rTgPGAM2、TgPGAM2+IL-2和TgPGAM2+IFN-γ滴鼻免疫小鼠均可有效诱导肠黏膜免疫应答,IL-2和IFN-γ可显著增强抗原的免疫效应,IL-2的佐剂效应优于IFN-γ.
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重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用
为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应,本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5,并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用.采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段,将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达,用重组ROP5蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化.以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠,统计小鼠不同时间存活率,评价重组蛋白产生的免疫保护性.结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN-γ、IL-2及IL-10细胞因子.与PBS及佐剂对照组相比,重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长.本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,以及一定的抗弓形虫感染保护作用.
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不同毒力株弓形虫速殖子排泄分泌抗原(ESA)对小鼠自然杀伤细胞(NK)作用的比较
为观察不同毒力株弓形虫排泄分泌抗原(Excretory-Secretory antigen,ESA)对小鼠NK细胞的作用,将18只雌性C57BL/6J小鼠随机分为3组,各组每鼠分别腹腔注射刚地弓形虫RH株ESA 200 μL(含ESA 0.002 mg),PRU株ESA 200 μL(含ESA 0.002 mg)和PBS 200 μL.于注射后6天取脾,流式细胞仪检测脾脏NK细胞的比例,并用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH )法检测各组NK细胞的杀伤活性,ELISA检测血清IFN-γ水平.结果显示,RH株ESA处理组NK细胞比例(5.97±0.26)%,PRU株ESA处理组NK细胞比例(3.32±0.29)%,两组均明显高于PBS对照组(3.08±0.39)%(P<0.001),其中RH株ESA处理组明显高于PRU株ESA处理组,差异有统计学意义(P<0.001);不同毒力株ESA处理的小鼠NK细胞杀伤能力较对照组有明显的升高,3组间差异有统计学意义(P<0.01);不同毒力株ESA处理后小鼠血清的IFN-γ水平升高,与PBS组相比差异有统计学意义(P<0.01),其中RH组小鼠血清中IFN-γ浓度较PRU组升高更为明显,差异存在统计学意义(P<0.05).结果表明,弓形虫ESA有活化小鼠NK细胞的作用,且RH株ESA的作用强于PRU株ESA.
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弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
目的:构建弓形虫棒状体蛋白(ROP2)基因重组质粒并在大肠杆菌中表达,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子.方法:根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段,再克隆到pGEX-4T-1质粒,重组质粒经酶切及PCR鉴定,而后进行测序;重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行ITPG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析.结果:ROP2基因PCR产物大小与预期相符,约1 043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与已知序列基本吻合;SDS-PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为55kDa,表达产物约占菌体总蛋白17%,具有一定的免疫反应性.结论:克隆并表达了弓形虫ROP2基因,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础.
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弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析
本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)基因原核表达重组质粒,进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性.设计合成引物,从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析.目的片段用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7,而后转入大肠埃希菌BL21 (DE3)中诱导表达,Western blotting分析表达蛋白.结果显示,从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710 bp的GRA7基因片段,构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序,目的基因片段与预期相符.重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后,可高效表达重组蛋白,Western blotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别,而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白.原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性,为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础.
关键词： 刚地弓形虫 致密颗粒蛋白7 (GRA7) 基因克隆 原核表达 免疫反应性 -
弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定
本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2 (ROP2),并初步评价其免疫反应性.主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His-ROP2,后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性.本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础.
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弓形虫P30与佐剂CTA2/B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析
目的构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组P30-CTX 蛋白奠定基础. 方法 PCR 扩增P30-CTX 复合基因,产物回收后与pMD-18T 载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,经氨苄抗性筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-P30-CTX;克隆载体与表达载体双酶切后,回收1 313 bp 的P30-CTX 基因,亚克隆入酵母表达载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZαA-P30-CTX.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.使用生物信息软件分析P30-CTX 复合基因,预测编码蛋白结构.结果重组质粒经PCR 可得1 313 bp 的特异条带,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切获得1 313 bp和3 085 bp的条带,与预期大小一致,测序结果证实为pGAP-P30-CTX 基因,序列分析同源性为99.82%,P30-CTX蛋白结构折叠无明显改变. 结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,预测毕赤酵母表达系统对P30-CTX 的抗原性不会产生影响.
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重组刚地弓形虫微线料体蛋白MIC1O的制备与特性分析
目的 制备重组刚地弓形虫微线体蛋白10(MIC10),并对其免疫学特性进行分析. 方法 利用逆转录PCR(RT-PCR)技术从弓形虫总RNA中反转录制备第一链cDNA,再利用特异性引物从cDNA中扩增出编码MIC10的基因片段,构建重组表达质粒pET28a-MIC10,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,通过镍螯合亲和层析法纯化重组MIC10蛋白.用纯化的重组蛋白免疫家兔,制备抗MIC10多克隆抗体,采用Western blot分析重组MIC10蛋白的免疫学特性. 结果 采用RT-PCR法从弓形虫cDNA中反转录扩增到长度约为416bp的特异性DNA,基因序列分析证实为编码MIC10的基因片段;制备的重组表达质粒pET28a-MIC10转化大肠埃希菌BL21(DE3)后经IPTG诱导,能表达重组MIC10蛋白;用纯化的重组MIC10蛋白免疫家兔,血清抗体效价达到1∶200 000以上.Western blot分析显示该抗体能识别弓形虫排泄分泌抗原中的天然MIC10分子而不识别弓形虫成虫抗原,证明MIC10为外分泌蛋白. 结论 制备了具有天然免疫原性的重组弓形虫MIC10蛋白,并证明该蛋白为外分泌蛋白.
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弓形虫ROP11核酸疫苗免疫保护作用的研究
目的 观察ROP11核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用. 方法 40只BALB/c小鼠随机分为实验组、空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组,每组10只,均通过股四头肌注射免疫小鼠.其中实验组每鼠注射pcDNA3.1(+) ROP11重组质粒100 μg(1 μg/μl),空质粒对照组注射pcDNA3.1(+)质粒100 μg(1μg/μ1),PBS对照组注射无菌PBS缓冲液100μl,空白对照组不注射.共免疫3次,每次间隔2周,末次接种量均加倍.分别于每次注射前和末次注射后第2周检测小鼠血清特异性IgG和细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10.末次注射后2周各组小鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子1×10 3个/只,观察其存活时间,评价免疫效果. 结果 ROP11核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,实验组小鼠血清特异IgG随着免疫次数的增加而显著增高(P＜0.05).血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10均不同程度升高(P＜0.05).重组质粒免疫组、空质粒免疫组、PBS和空白对照组小鼠经RH株弓形虫攻击感染后的平均存活时间为236.3、97.8、96.3和96.2h,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 ROP11核酸疫苗对BALB/c小鼠弓形虫感染有一定的免疫保护性,为进一步研究ROP11核酸疫苗的生物学功能提供了实验基础.
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弓形虫GRA1基因核酸疫苗的实验研究
目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用. 方法 以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA1重组真核表达质粒,并将其转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达；用pVAX1-GRA1真核表达质粒注射免疫小鼠,通过检测血清特异IgG水平及血CD4+、CD8+细胞百分率并观察弓形虫感染小鼠的存活时间,评价其免疫保护力. 结果 PCR扩增出573 bp的GRA1开放阅读框,成功构建重组表达质粒pVAX1-GRA1.用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,Western blot证实该蛋白具有反应原性,SDS-PAGE检测该蛋白分子质量单位为24 ku.用构建的核酸疫苗免疫小鼠,随着免疫次数的增加血清特异性IgG抗体滴度逐渐增加,CD4+与CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).弓形虫RH速殖子攻击感染疫苗免疫组小鼠存活时间为(165±23.1)d,PBS对照组、pVAX1对照组分别为(144±16.3)d和(148±16.3)d,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 构建的真核表达质粒pVAX1-GRA1有一定的免疫保护性,为弓形虫基因疫苗的进一步研究奠定了基础.
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重组刚地弓形虫MIC8CTD蛋白及其多克隆抗体的制备
目的 制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾( MIC8 CTD)重组蛋白及其多克隆抗体.方法 以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8 CTD基因片段,构建MIC8 CTD/pGEX-4T-1原核表达系统；IPTG诱导表达GST-MIC8CTD融合蛋白；用纯化的融合蛋白加免疫佐剂免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的特异性及效价.结果 构建了 MIC8 CTD原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8 CTD融合蛋白；获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体能特异识别MIC8 CTD,ELISA测定抗体效价为1∶8 000.结论 制备的GST-MIC8 CTD融合蛋白具有免疫原性,用该抗原免疫动物可获得高效价的多克降抗体.
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刚地弓形虫ROP10-ROP18真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建刚地弓形虫棒状体蛋白10 (ROP10)、棒状体蛋白18(ROP18)复合基因真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18,并在HeLa细胞内表达目的蛋白. 方法 设计ROP10、ROP18基因特异引物,采用RT-PCR扩增ROP10、ROP18基因并测序,将ROP10和ROP18基因分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点中,构建单价质粒pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18,然后将ROP18基因插入pVAXD-ROP10中构建双启动子真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18.经PCR和双酶切验证后将pVAXD-ROP10-ROP18转染至HeLa细胞内,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板分别进行ROP10基因和ROP 18基因的RT-PCR鉴定;采用间接免疫荧光试验(IFA)检验ROP10和ROP18蛋白表达情况. 结果 成功克隆ROP10、ROP18基因片段并构建了重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18,测序、双酶切和PCR验证重组质粒构建正确.分别将3种重组质粒转染至HeLa细胞后经RT-PCR鉴定,pVAXD-ROP10-R()P18组可同时扩增出1 761 bp(ROP10基因)和1 665 bp(ROP18基因)2个片段,而pVAXD-ROP10组和pVAXD-ROP18组分别扩增出1 761 bp和1 665 bp的目的片段;IFA显示pVAXD-ROP10组和pVAXD-ROP18组均有绿色荧光,即分别表达ROP10和ROP18蛋白. 结论 成功构建重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18、pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18质粒可在真核细胞中分别表达ROP10和ROP18两种蛋白.
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云南大理HIV阳性者人源弓形虫c22-8基因分析
目的 对云南大理HIV阳性者人源弓形虫c22-8基因进行分析.方法 运用巢式PCR技术对HIV阳性者全血标本进行弓形虫c22-8基因的扩增,扩增产物用限制性内切酶BsmA Ⅰ和MboⅡ酶切鉴定,并对基大序列进行测定与分析.结果 291份HIV阳性者血样中,32份成功扩增出弓形虫c22-8基因,扩增产物酶切后获得约200 bp(＜200bp)、约100 bp和＜100 bp等3条片段.对扩增产物进行测序分析,云南大理人源弓形虫c22-8基因与基因Ⅰ型标准株(RH株)c22-8基因序列一致.结论 初步分析云南大理人源弓形虫与弓形虫基因Ⅰ型标准株一致.
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弓形虫酵母表达质粒pPIC9K-GRA1的构建及鉴定
目的 构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)的酵母表达质粒,为进一步研究GRA1蛋白功能奠定基础.方法 PCR扩增编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将GRA1定向克隆到pPIC9K 的EcoRⅠ/NotⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定.结果 特异扩增出预期的GRA1片段,大小为573 bp,扩增产物经双酶切后成功连接到pPIC9K中,经PCR,双酶切及序列测定证明重组质粒中含有GRA1读框.结论成功构建弓形虫GRA1酵母真核表达质粒.
