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《新型疫苗研发面临的挑战及关键技术》沙龙文集
接种疫苗是20世纪公共卫生领域伟大的科学成就之一。1978年全球消灭了天花，2000年包括我国在内的西太平洋地区实现了无脊髓灰质炎状态，乙肝、麻疹等传染病的感染率和发病率大幅度下降，这些都归功于疫苗预防接种的成就。目前，国内外疫苗应用和研发领域取得了重大的成就，传统的传染病（如结核病和艾滋病）预防性疫苗研究得到长足发展，治疗型疫苗也逐步得到应用，新型疫苗研发呈现出“井喷”式的广阔发展前景。但随着社会经济的不断发展，新型疫苗研发的需求不断在增长，对于疫苗可预防疾病的负担评价，疫苗研发技术，疫苗接种程序，疫苗免疫保护性水平研究，以及相关疫苗管理法规、规范、知识产权保护等诸多领域均面临新的问题和挑战。正确看待和处理好这些问题，尤其是加强宣传、教育，是促进我国免疫规划工作健康发展的重要工作。
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重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用
为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应,本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5,并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用.采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段,将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达,用重组ROP5蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化.以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠,统计小鼠不同时间存活率,评价重组蛋白产生的免疫保护性.结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN-γ、IL-2及IL-10细胞因子.与PBS及佐剂对照组相比,重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长.本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,以及一定的抗弓形虫感染保护作用.
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弓形虫疫苗及其保护性研究现状
本文对近年来研制的弓形虫疫苗的种类、方法及其免疫保护性进行了综述,以期为弓形虫疫苗的进一步研究提供参考.
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疫苗中和抗体体外检测方法的研究进展
中和抗体是抗病毒免疫的主要因素,也是疫苗免疫治疗效果的重要检测指标之一.预防疫苗的免疫保护性主要体现于是否可诱导出高滴度的中和抗体,因此中和抗体活性也是疫苗评估和质控的重要依据.迄今为止,根据已知抗原特性、抗原与抗体反应特点以及结果判定方法的不同,已建立了多种病毒中和抗体活性的体外测定方法.本文就近年来关于中和抗体活性体外测定方法的新研究进展做一综述.
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贝氏柯克斯体30kD外膜蛋白基因表达及免疫保护性的研究
贝氏柯克斯体可引起人类急、慢性Q热.急性Q热临床表现多种多样,主要症状为发热、头痛和肌肉酸痛,并常伴有肺炎、肝炎等.慢性Q热常发展为Q热性心内膜炎、骨髓炎.Q热疫苗是预防Q热流行的有效手段,目前人用Q热疫苗是灭活的柯克斯体.虽然灭活疫苗的免疫保护效果很好,但注射该疫苗接种部位常出现不良反应.研究发现,在贝氏柯克斯体的Ⅰ相和Ⅱ相中含有相对分子质量(Mr)为30×103的外膜蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性[1].我们采用分子生物学技术,研制出贝氏柯克斯体Mr 30×103重组外膜蛋白,用重组蛋白免疫小鼠,对其免疫保护性进行初步评价,探讨该重组蛋白作Q热疫苗的可行性.
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幽门螺杆菌NCTC11639标准株lpp20基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定
Lpp20是Hp一种高度保守的膜蛋白,有研究表明其具有较强的免疫活性和免疫保护性,是一种理想的疫苗侯选抗原.本研究利用基因工程技术构建了含lpp20基因的重组质粒,并进行了表达,为Lpp20疫苗的研究奠定了基础.
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甲型副伤寒沙门菌 h1 a-spaO 融合基因构建及其表达产物免疫保护作用
目的：构建甲型副伤寒沙门菌h1a-spaO融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rH1a-SpaO免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接引物PCR构建并扩增h1a与spaO基因的融合基因h1a-spaO，T-A克隆后测序。采用常规基因工程方法构建h1a-spaO融合基因原核表达系统，SDS-PAGE检测其rH1a-SpaO表达情况。采用Western blot鉴定rH1a-SpaO抗原性和免疫反应性，微量肥达试验确定rH1a-SpaO抗血清凝集甲型副伤寒沙门菌的能力。采用小鼠感染模型了解rH1a-SpaO对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的保护作用并与等量单一重组表达蛋白H1a（ rH1a）及SpaO （rSpaO）比较。结果所构建的h1a-spaO融合基因与单一h1a或spaO基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。 h1a-spaO融合基因原核表达系统能高效表达rH1a-SpaO。 rH1a-SpaO能与rH1a或rSpaO抗血清结合， rH1a-SpaO抗血清也能识别rH1a和rSpaO并经H抗原凝集甲型副伤寒沙门菌。100μg rH1a-SpaO 对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率（93．3％）明显高于等量 rH1a （60．0％）及rSpaO（53．3％）（P＜0．05）。结论重组融合蛋白抗原rH1a-SpaO免疫保护作用较等量单一rH1a或rSpaO更强，可作为甲型副伤寒两价基因工程疫苗或伤寒/副伤寒荚膜多糖-蛋白结合疫苗的有效抗原。
关键词： 甲型副伤寒沙门菌 h1a-spaO融合基因 重组表达 免疫原性 免疫保护性 -
幽门螺杆菌lpp20基因的克隆及序列分析
幽门螺杆菌(Hp) lpp20基因编码Hp外膜上的一种相对分子质量约为18×103的脂蛋白(Lpp20).有研究表明,Lpp20具有良好的免疫原性和免疫保护性,是一种理想的疫苗候选抗原.本研究对Hp郑州分离株MEL-HP27 lpp20基因进行克隆和测序;通过对7株Hp lpp20基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列进行同源性分析,确定Hp lpp20基因的变异性.
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甲型副伤寒杆菌ompA基因分布及重组表达产物的免疫学鉴定
目的 构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpA免疫原性和保护作用,检测甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.方法 采用PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增ompA基因,T-A克隆后测序并构建ompA基因原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量,采用免疫扩散法、微量肥达试验和Western blot鉴定其抗原性和免疫反应性.采用PCR检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.采用小鼠感染模型,了解rOmpA对甲型副伤寒杆菌50001株感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65%.rOmpA能与其兔抗血清和甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生免疫反应(Western blot),并可在家兔中诱导产生抗体.94.9%(93/98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有ompA基因.100 μg和200 μg rOmpA对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和58.3%(7/12).rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5～1:40.结论 ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛.rOmpA有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可考虑为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.
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甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因构建及其表达产物免疫保护作用
目的 构建甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因及其原核表达系统,确定重组表达产物rSpaO-OmpA免疫保护作用.方法 采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因,构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO-OmpA表达情况及其产量.采用免疫扩散法、微量肥达和Western blot法鉴定rSpaO-OmpA 抗原性和免疫反应性.采用小鼠感染模型了解rSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用,实验中采用重组表达的SpaO( rSpaO)及OmpA(rOmpA)作为对照.结果 所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％.所构建的原核表达系统E.coli BL21 DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA.rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号,免疫家兔后可产生特异性抗体.100 μg或200 μgrSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66.7％ (8/12)和83.3％ (10/12),明显高于等量rSpaO及rOmpA( P＜0.05).rSpaO-OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1∶5 ～ 1∶40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO-OmpA免疫双扩散效价为1∶1 ～1∶16.结论 人工融合重组抗原rSpaO-OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强.
关键词： 甲型副伤寒沙门菌 spaO-ompA 融合基因 重组表达 免疫原性 免疫保护性 -
口服鼠疫F1-Ⅴ重组融合蛋白活菌疫苗的构建及免疫效果的初步研究
鼠疫耶尔森菌能产生很多由染色体或质粒编码的毒力因子,包括pgm、pst、Yops、F1抗原、Ⅴ抗原等[1].F1和V抗原已被证实为主要保护性抗原,且存在属间保守性,F1-Ⅴ融合抗原分子在免疫原性和免疫保护性上具有叠加效应,将两者联合接种可保护小鼠抵抗109 LD50强度攻击[2].在鼠疫杆菌基因组、蛋白组和功能基因组研究的基础上,F1和Ⅴ是鼠疫新型疫苗研究首选的保护性抗原分子的靶标.
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不可分型流感嗜血杆菌 LPD 基因分布及其重组表达产物免疫保护作用
目的：了解无荚膜型流感嗜血杆菌（NTHi）临床菌株中外膜脂蛋白 D（LPD）基因分布及其序列保守性，确定重组表达的 LPD（rLPD）免疫原性和免疫保护性。方法采用 PCR 检测 NTHi临床菌株中 LPD 基因，T-A 克隆后测序。构建 LPD 基因原核表达系统，采用 Ni-NTA 亲和层析法提纯表达的 rLPD。采用 SDS-PAGE 和 Bio-Rad 凝胶图像分析系统检测 rLPD 表达情况及其产量。采用ELISA 和 Western blot 检测 rLPD 的抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解 rLPD 对 NTHi 致死性感染的免疫保护效果。结果所有 NTHi 菌株均检出 LPD 基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达98.0％~99.4％和98.5％~100％。所构建的原核表达系统能高效表达 rLPD。rLPD 免疫家兔可产生高效价抗体，NTHi 全菌兔抗血清及 NTHi 感染患儿血清能识别 rLPD 并与之结合。ELISA 结果显示，93.6％（58/62）和53.2％（32/62）NTHi 感染患儿血清分别 rLPD-IgM 和 rLPD-IgG 阳性。100μg或200μg rLPD 对 NTHi 致死性感染小鼠的免疫保护率分别为60.0％或73.3％。结论 LPD基因在 NTHi 菌株中广泛分布且序列保守，其重组表达产物 rLPD 具有良好的免疫原性及一定的免疫保护作用，可作为 NTHi 基因工程疫苗候选抗原之一。
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 LPD 基因/ 脂蛋白 D 重组表达 免疫原性 免疫保护性 -
问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定
目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.
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幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20的研究进展
Lpp20是一种保守的幽门螺杆菌膜相关脂蛋白,他含有细菌脂蛋白的典型信号肽.近几年研究显示,Lpp20具有良好的免疫原性和免疫保护性.本文即对Lpp20的结构及其免疫原性和免疫保护性的研究进展作一综述.
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贝氏柯克斯体34×103重组外膜蛋白的免疫保护性
目的:原核细胞表达贝氏柯克斯体34×103外膜蛋白基因,评价34×103重组外膜蛋白的免疫保护性.方法:用PCR从我国贝氏柯克斯体分离株的基因组中扩增34×103外膜蛋白基因,用该基因与原核表达质粒重组,构建重组表达质粒;用IPTG诱导重组质粒在大肠杆菌细胞内表达重组蛋白.用重组蛋白皮下接种免疫BALB/c小鼠2次,在加强免疫后的第28天,用ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平以及作体外脾淋巴细胞增殖试验检查小鼠的特异性细胞免疫水平;用10 ID50贝氏柯克斯体腹腔注射攻击免疫小鼠,攻击后第7天病理学检查小鼠脏器的组织病变和染色镜检脾脏的贝氏柯克斯体.结果:SDS-PAGE和免疫印迹分析证明重组质粒转化的大肠杆菌产生了34×103重组蛋白,重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清发生特异性反应.ELISA法检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组蛋白抗体,免疫小鼠的体外淋巴细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.组织病理学检查发现免疫小鼠的肺、肝、脾无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏肿大并含有大量的柯克斯体.结论:重组34×103外膜蛋白具有的免疫保护性,能够诱导机体产生有效的抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答.
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重组轮状病毒抗原表位亚单位疫苗的小鼠保护性
目的评价重组表达的轮状病毒(RV)抗原表位疫苗的小鼠体内保护效果及安全性.方法在以FlockHouse virus病毒外壳蛋白为载体的外源抗原表位呈递系统(FHV-RNA2系统)中构建和重组表达RV Vp4蛋白上第223～262位抗原表位(REABC);在原核系统[质粒pET,大肠杆菌BL21(DE3)]中表达的REABC免疫小鼠用细胞培养适应的参照RV Wa(G1PA型)和SA11(G3P2型)经口腔灌胃攻击,对RV攻击后的免疫小鼠和对照小鼠的感染症状、排毒情况、血清抗体中和病毒感染性效价进行测定和分析.结果REABC可诱导免疫小鼠产生较强的抗-Wa和抗-SA11株血清中和抗体和特异的免疫记忆反应,有效保护免疫小鼠对Wa和SA11的攻击(不腹泻),减少病毒在体内复制水平和排毒时间,与对照组相比差异具有显著性(P＜0.001).结论重组表达RV抗原表位REABC对小鼠具有较好的免疫保护效果和安全性.
关键词： 轮状病毒 重组抗原表位亚单位疫苗 免疫保护性 -
孩子生病有时也是件好事情
说起孩子的生病,估计不少家长的脑海中会涌出不少负面词汇:紧张、担心、烦恼、焦虑、烦躁等等.孩子生病如同一个梦魇,让家长们恐慌.我想对有孩子的家长说,你们尝试过用快乐的心情面对疾病吗?你们知道疾病的发生有时候对孩子也有好处吗?你们知道好心情能帮助孩子更快地恢复吗?生病对人类来说首先是件好事情.生病时,例如发热,是机体免疫系统为了抵御感染而产生的一种免疫保护性反应.发烧时机体内的各种免疫功能都优于体温正常时,包括新陈代谢增快、抗体合成增加和吞噬细胞活性增强.这些免疫功能能够抑制病原体的生长、繁殖,有利于病人恢复.通俗地讲,发烧是人体面对病菌使出的一招“杀手锏”,发烧是为了“烧死”体内的病菌.
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甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白的原核表达、纯化及其免疫保护性
目的 原核表达、纯化甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白,并检测其免疫原性和免疫保护性.方法 采用PCR从甲型副伤寒沙门菌( CMCC 50973)基因组DNA中扩增btuB基因,插入原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经分子筛和亲和层析纯化后,免疫BALB／c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中抗BtuB IgG抗体效价,并用小绝对致死剂量活菌攻毒,计算小鼠的保护率.结果 重组原核表达质粒pET-30a-btuB经双酶切和测序证实构建正确;重组蛋白的相对分子质量约为67 000,表达量约为菌体总蛋白的25％,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度大于90％,可与鼠抗His-Tag单抗特异性结合;纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠可获得高效价的抗BtuB IgG抗体,且可获得60％的保护率.结论 成功原核表达并纯化了甲型副伤寒沙门菌外膜BtuB蛋白,重组蛋白免疫原性良好,并能够为小鼠提供一定的保护作用.
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幽门螺杆菌多亚单位融合蛋白疫苗的构建及免疫特性
目的 构建幽门螺杆菌HspA、HpaA、UreB多亚单位融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性及免疫保护性.方法 用PCR从Hp基因组中分别扩增HspA、HpaA、UreB 3个基因片段,重叠延伸PCR将其构建成融合基因hhu,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切、测序验证后,转化E coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,AKATA纯化仪纯化.纯化后蛋白口服免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体,末次免疫后进行攻毒试验,检测其免疫保护性.结果 酶切及测序证实已成功构建HspA、HpaA、UreB融合基因的表达载体phhu,SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的表达,表达率为26.8%,纯化的融合蛋白纯度大于90%,口服免疫小鼠可产生特异性抗体,保护率达89.6%.结论 所获得的融合蛋白保持了亚组分蛋白各自的免疫原性和免疫保护性,为幽门螺杆菌多亚单位疫苗的深入研究奠定了基础.
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喷鼻三价流感裂解疫苗在小鼠体内的免疫原性及免疫保护性
目的 评价喷鼻三价流感裂解疫苗在小鼠体内产生的免疫原性及免疫保护性.方法 选用H1N1、H3N2、B型3种裂解抗原联合后,与佐剂壳聚糖季铵盐(HTCC)水凝胶等体积混合,制备三价流感裂解疫苗.经喷鼻免疫BALB/c小鼠,免疫剂量为每种单价抗原2μg/只,第0及14天各免疫1次,于末次免疫后第14天制备小鼠血清及鼻、肺、阴道灌洗液.血凝抑制法检测小鼠血清的血凝抑制抗体(HI)效价;ELISA法检测小鼠血清中IgG及其亚型抗体效价和小鼠鼻、肺、阴道灌洗液中sIgA效价;末次免疫14d,用H1N1流感病毒进行攻毒,观察小鼠体重变化及死亡率.结果 经喷鼻免疫三价流感裂解疫苗的小鼠血清可产生较高效价的HI抗体,IgG抗体亚型以IgG1与IgG2a为主,小鼠鼻、肺、阴道灌洗液中均可检测到特异性sIgA.攻毒后小鼠体重变化较小,14d后全部存活.结论 经喷鼻免疫三价流感裂解疫苗可激发小鼠产生体液、细胞及黏膜免疫反应,具有良好的免疫保护性.
