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贝氏柯克斯体的分子生物学进展
Q热是由贝氏柯克斯体引起的呈世界性分布的一种人兽共患疾病.目前,世界反恐组织已将该病病原体列为生物战剂之一.早期应用抗生素对Q热有疗效,而慢性Q热治疗周期长、易复发,死亡率高.贝氏柯克斯体能以气溶胶的形式传播,一旦流行将难以控制,因此对人类危害极大.为进一步研究该病的致病机制、及时有效的诊断手段及其疫苗的开发提供参考依据,本文就贝氏柯克斯体的分子生物学研究进展作简要概述.
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首次从额尔古纳口岸草原革蜱中检测到贝氏柯克斯体
目的 了解额尔古纳口岸蜱类自然感染贝氏柯克斯体的状况,为Q热的预防控制提供技术支持.方法 用套式PCR方法检测野外采集的蜱类携带的贝氏柯克斯体.结果 在额尔古纳口岸地区采集的210只蜱中,从3只草原革蜱中检测到贝氏柯克斯体核酸,序列分析结果表明与GenBank中贝氏柯克斯体序列同源性为99％.结论 首次从额尔古纳口岸地区草原革蜱中检测到贝氏柯克斯体.
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中国Q热研究进展
一、概述自1937年在澳大利亚发现一种原因不明的发热性疾病而称之谓Q热("Q"乃Query的第一个字母,即疑问之意),并证明其病原体为贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,俗称Q热立克次体)后,60余年来除个别地区尚未发现Q热病例外,目前已报道的Q热疫区已遍及全球各大洲几乎所有国家,成为当前分布广的人兽共患病之一.
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贝氏柯克斯体血清学反应蛋白芯片的研制
贝氏柯克斯体为Q热的病原菌.本研究对19个贝氏柯克斯体血清学反应阳性蛋白基因进行PCR扩增,将扩得的基因片段与表达载体连接,将重组质粒转化大肠杆菌并表达目的蛋白,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白.将纯化的重组蛋白点在醛基化玻片上制备蛋白芯片.将贝氏柯克斯体新桥株实验感染小鼠血清分别对蛋白芯片进行血清学分析,结果显示能与贝氏柯克斯体感染1、2、3、4周小鼠血清反应的蛋白数分别是0、16、19和18个.结果说明该芯片上的重组蛋白具有贝氏柯克斯体感染血清反应特异性,该芯片分析有望用于Q热的血清学诊断.
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贝氏柯克斯体抑制宿主单核细胞的碳源代谢
贝氏柯克斯体是一种专性细胞内寄生的革兰阴性小球杆菌,为Q热的病原体.本文通过比较贝氏柯克斯体感染单核细胞和非感染单核细胞的蛋白表达谱,研究该病原体感染引发宿主细胞表达差异的蛋白.用贝氏柯克斯体I相毒株感染人单核细胞(THP-1),采用等电聚焦和SDS-PAGE双向电泳对感染单核细胞和非感染单核细胞进行比较蛋白质组学研究,用电泳图谱分析软件发现它们之间的差异表达蛋白,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪鉴定差异表达蛋白.结果发现,电泳图谱分析发现137个差异蛋白,质谱分析鉴定到15种差异蛋白与细胞生理代谢有关.这些蛋白的表达变化说明贝氏柯克斯体感染单核细胞使宿主细胞碳源代谢受到抑制,由此可能影响单核细胞正常杀菌功能,而有利于贝氏柯克斯体在细胞内的生存.
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我国西北部分地区Q热分子流行病学调查
目的:了解西北部分地区人群及媒介蜱Q热感染情况.方法:采用布旗法采集游离蜱,应用巢式PCR扩增蜱Q热贝氏柯克斯体;采用间接免疫荧光法对当地居民进行血清Q热抗体检测.结果:共检测11个蜱种2460只蜱标本,有8个蜱种239只贝氏柯克斯体DNA阳性,总阳性率为9.72%.不同蜱种间阳性率差异有统计学意义(X2=16.69,P<0.01),其中以青海血蜱阳性率高,为59.38%;四省区阳性率差异有统计学意义(x2=13.28.P<0.01),以宁夏阳性率高,为17.96%.共采集当地居民血清725份,抗体检测阳性51份,不同职业人群抗体阳性率差异有统计学意义(X2=4.03,P<0.05),以牧民阳性率为高.相关危险因素调查显示,饲养牛羊、饲养的牛羊有不明原因流产、给牛羊接生时未采取保护措施等因素与血清学阳性率有关,其中前两个因素为危险因素,而接生时采取保护措施为保护因素.结论:我国西北地区蜱及当地居民存在Q热感染现象.
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贝氏柯克斯体重组抗原P1表达纯化及胶体金免疫层析方法的建立
目的 制备贝氏柯克斯体的重组外膜蛋白P1,并建立一种快速检测贝氏柯克斯体抗体的胶体金免疫层析方法.方法 利用贝氏柯克斯体主要的表面蛋白P1的良好免疫原性和免疫反应性,对已构建的表达P1抗原的重组工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达P1重组蛋白,通过蛋白纯化、复性、浓缩等过程获得目的蛋白.纯化的P1重组抗原包被硝酸纤维素膜,胶体金标记SPA,建立检测贝氏柯克斯体抗体的免疫层析方法,评价该方法的特异性、灵敏性、稳定性及应用性.结果 纯化后获得分子质量(Mr)为52000的目的蛋白,纯度为94％.建立了快速检测贝氏柯克斯体特异性抗体的方法,对阳性参照样本检测,目测灵敏度可达1∶105,采用金标仪半定量检测灵敏度可达116 ng/ml;对94份鼠血清和90份健康人血清检测,无阳性检出；对布鲁氏菌、普氏立克次体、军团菌、土拉弗朗西斯菌等传播途径和临床特征相似的病原抗体进行检测,未发生交叉反应.结论 利用重组抗原建立的贝氏柯克斯体抗体胶体金免疫层析方法具有较好的敏感性和特异性,可用于传染病快速筛查.
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内蒙古乌拉特口岸地区2015年鼠类携带病原体情况调查
目的 了解2015年内蒙古乌拉特口岸地区鼠类携带病原体情况.方法 采用夹夜法捕获鼠类,解剖取其内脏组织,利用PCR法检测14种病原体核酸.结果 2015年4-6月在乌拉特口岸地区共捕获鼠类44只,其中五趾跳鼠42只,小家鼠和毛足鼠各1只.从五趾跳鼠中检测到巴尔通体核酸阳性17份和贝氏柯克斯体核酸阳性2份,其他病原体核酸检测结果均为阴性.结论 乌拉特口岸地区鼠类以五趾跳鼠为主,其携带巴尔通体和贝氏柯克斯体,今后应加强人群感染和相关疾病的监测.
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贝氏柯克斯体30kD外膜蛋白基因表达及免疫保护性的研究
贝氏柯克斯体可引起人类急、慢性Q热.急性Q热临床表现多种多样,主要症状为发热、头痛和肌肉酸痛,并常伴有肺炎、肝炎等.慢性Q热常发展为Q热性心内膜炎、骨髓炎.Q热疫苗是预防Q热流行的有效手段,目前人用Q热疫苗是灭活的柯克斯体.虽然灭活疫苗的免疫保护效果很好,但注射该疫苗接种部位常出现不良反应.研究发现,在贝氏柯克斯体的Ⅰ相和Ⅱ相中含有相对分子质量(Mr)为30×103的外膜蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性[1].我们采用分子生物学技术,研制出贝氏柯克斯体Mr 30×103重组外膜蛋白,用重组蛋白免疫小鼠,对其免疫保护性进行初步评价,探讨该重组蛋白作Q热疫苗的可行性.
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表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27 000外膜蛋白的重组卡介苗构建
目的:构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27 000外膜蛋白的重组卡介苗.方法:用PCR技术从卡介苗基因组扩增分枝杆菌19 000抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增27 000外膜蛋白基因,将它们分别插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒(pSMT3)的XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/HindⅢ位点.将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌并从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗. 结果:从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性的重组卡介苗菌落,用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗,发现一约27 000的蛋白带与贝氏柯克斯体27 000重组蛋白免疫兔血清发生特异性反应;27 000重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗,结果为阳性.结论:重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体27 000外膜蛋白,表达的27 000外膜蛋白存在于卡介苗菌体表面,卡介苗菌体表面的27 000抗原可能诱导抗Q热免疫应答.
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贝氏柯克斯体34×103重组外膜蛋白的免疫保护性
目的:原核细胞表达贝氏柯克斯体34×103外膜蛋白基因,评价34×103重组外膜蛋白的免疫保护性.方法:用PCR从我国贝氏柯克斯体分离株的基因组中扩增34×103外膜蛋白基因,用该基因与原核表达质粒重组,构建重组表达质粒;用IPTG诱导重组质粒在大肠杆菌细胞内表达重组蛋白.用重组蛋白皮下接种免疫BALB/c小鼠2次,在加强免疫后的第28天,用ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平以及作体外脾淋巴细胞增殖试验检查小鼠的特异性细胞免疫水平;用10 ID50贝氏柯克斯体腹腔注射攻击免疫小鼠,攻击后第7天病理学检查小鼠脏器的组织病变和染色镜检脾脏的贝氏柯克斯体.结果:SDS-PAGE和免疫印迹分析证明重组质粒转化的大肠杆菌产生了34×103重组蛋白,重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清发生特异性反应.ELISA法检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组蛋白抗体,免疫小鼠的体外淋巴细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.组织病理学检查发现免疫小鼠的肺、肝、脾无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏肿大并含有大量的柯克斯体.结论:重组34×103外膜蛋白具有的免疫保护性,能够诱导机体产生有效的抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答.
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Q热性心内膜炎1例抗Ⅰ相和Ⅱ相抗原IgG抗体的跟踪监测报道
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贝氏柯克斯体感染对宿主细胞免疫调控的研究进展
Q热的病原体贝氏柯克斯体是专性细胞内寄生菌,该菌的高致病性和对环境、理化因素的高抵抗力使其成为重要的生物战剂/生物恐怖剂.进入宿主细胞后,Cb能在巨噬细胞内生长繁殖,导致单核细胞朝向非典型M2分化;它通过抑制树突细胞的成熟,干扰细胞因子的正常分泌等多种方式调控宿主细胞的免疫机制,从而逃避机体对其的免疫攻击.
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灭活贝氏柯克斯体免疫小鼠抗登革病毒感染的实验研究
目的 研究灭活贝氏柯克斯体增强小鼠非特异性抗登革病毒感染的免疫效能.方法 用灭活贝氏柯克斯体全细胞疫苗(WCV)免疫BALB/c小鼠,每只小鼠皮下注射50ugWCV,初次免疫后第5周及第7周分别腹腔注射20ugWCV加强免疫.1周后,用105 TCID50剂量的登革病毒2型经尾静脉注入感染小鼠,于感染后47、72 h分别解剖小鼠,自血和脑组织提取RNA样本,用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测样本.结果 用登革病毒特异的定量PCR检测感染小鼠血RNA样本,结果显示感染72 h血样本中病毒含量显著低于48 h样本,但免疫小鼠与未免疫小鼠之间无显著差异.检测脑组织RNA样本,未免疫小鼠和免疫小鼠的感染48 h样本检出病毒均为少量;但未免疫小鼠感染96 h样本检出病毒量明显增加,显著高于免疫小鼠.结论 灭活贝氏柯克斯体可诱导机体产生非特异的免疫应答,具有一定增强小鼠抗登革病毒感染的能力,但具体机制有待进一步研究.
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宁夏回族自治区奶牛感染贝氏柯克斯体的血清流行病学调查
目的 调查宁夏回族自治区奶牛感染贝氏柯克斯体状况.方法 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检出奶牛血清贝氏柯克斯体抗体,总体阳性率为11.37％(103/906).结果 吴忠市和青铜峡市奶牛贝氏柯克斯体抗体阳性率分别为12.28％和10.44％;不同年龄组的抗体阳性率为9.86％至13.21％;未生育过的奶牛抗体阳性率高为11.99％.结果显示地区、年龄和胎次均与贝氏柯克斯体感染无统计学差异(P＞0.05).结论 揭示了宁夏地奶牛贝氏柯克斯体感染普遍存在,对该地区人群健康构成潜在威胁.
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贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析
目的 使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析.方法 本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体.结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性;11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外,其它血清反应均为阳性.将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应,除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外,其它血清反应均为阴性.另外,Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2％,GroEL为25.0％,Mip为25.0％,OmpH为25.0％,RplL为13.9％.结论 这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别.所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性,可用作Q热血清学诊断.
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贝氏柯克斯体重组膜蛋白抗原激活树突状细胞诱导特异性免疫应答
目的 分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)膜蛋白抗原对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的激活作用,筛选能有效激活DCs的蛋白抗原,探讨该蛋白抗原间接激活T细胞的作用.方法 从健康成年人外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF和IL-4体外培养单核细胞成未成熟DCs;分别用Cb的5种重组膜蛋白IcmO、EnhA、SecB、Lo1A、HspB刺激DCs;用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测刺激后DCs表面分子表达.结果 SecB刺激的DCs 表达CD83, CD86, CD80, CD54, CD58, 和 CD40水平显著高于其它4种蛋白;将SecB激活DCs或SecB激活DCs培养上清刺激T淋巴细胞,FACS检测显示刺激后CD4+ 和CD8+ 细胞高水平表达的T淋巴细胞活化标志CD69以及细胞因子IFN-γ和TNF-α.结论 SecB膜蛋白抗原能有效激活DCs和它所激活DCs能够诱导特异性细胞免疫应答,为贝氏柯克斯体潜在保护性抗原.
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贝氏柯克斯体抑制单核细胞的杀菌活性
目的 比较贝氏柯克斯体感染单核细胞和非感染单核细胞的蛋白谱,发现该柯克斯体感染诱导单核细胞表达蛋白.方法 用贝氏柯克斯体I相毒株感染人单核细胞(THP-1),采用等电聚焦和SDS-PAGE双向电泳对感染单核细胞和非感染单核细胞同时做蛋白分离,用专业电泳图谱分析软件发现它们之间的差异表达蛋白,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪鉴定差异表达蛋白.结果 质谱分析鉴定97个差异表达蛋白,经蛋白氨基酸序列数据库检索和生物信息学分析发现其中15个差异表达蛋白参与调节单核细胞的吞噬、杀菌、细胞凋亡等.结论 贝氏柯克斯体侵入单核细胞诱导细胞某些蛋白分子差异表达,增强柯克斯体细胞内入侵、抑制单核细胞的杀菌活性和细胞凋亡,促进贝氏柯克斯体在细胞内生存.
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氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的免疫保护性评价
目的 动物实验评价采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗(CMRV)的免疫保护性.方法 将三批小量制备的CMRV和灭活贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)分别用1μg、10μg、100μg三个剂量皮下注射免疫BALB/c小鼠,4周后用初次免疫的一半剂量腹腔注射加强免疫1次,2周后用107的贝氏柯克斯体强毒株腹腔注射感染免疫小鼠,感染第7d活杀小鼠、摘取小鼠脾脏,用荧光定量PCR检测小鼠脾脏组织的贝氏柯克斯体.结果 所有Q热疫苗免疫组的小鼠脾脏荷菌量均显著少于非免疫组,100μg免疫组的荷菌量显著低于10μg免疫组,10μg疫苗组显著低于1μg免疫组.每批CMRV免疫组与相同剂量WCV免疫组之间的贝氏柯克斯体含量无显著差异.结论 国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗具有与灭活Q热疫苗一样良好的抗贝氏柯克斯体感染的免疫保护性.
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贝氏柯克斯体新桥株刺激人树突状细胞的表型分析
目的 树突状细胞 (dendritic cell, DC)具有成熟与未成熟两种形态,前者是早期免疫应答强有力的抗原呈递细胞,后者能诱导免疫耐受.分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)、Cb脂多糖(LPS)、去除LPS的Cb对DC的激活作用,探讨Cb逃逸宿主免疫清除的机理.方法 从健康成年人的外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF 和 IL-4体外培养单核细胞成未成熟DC;分别用灭活Cb、Cb LPS、去LPS Cb刺激体外培养未成熟DC,大肠杆菌LPS作为阳性对照刺激因子;刺激后24h,用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter, FACS)检测DC表面分子:成熟标记分子CD83与共刺激分子 CD40、CD58、CD80、CD86.结果 去LPS Cb刺激DC表面分子表达水平与大肠杆菌LPS刺激相近,显著强于未刺激DC,而灭活Cb、Cb LPS刺激DC表面分子CD83、CD40、CD80、CD86的表达在一低水平.结论 LPS遮盖了Cb激活DC所需的表面分子,除去LPS后暴露的分子与DC相互作用,对DC的成熟刺激作用显著高于灭活Cb、Cb LPS的刺激作用.LPS的存在有利于贝氏柯克斯体逃逸宿主的免疫清除.
