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重组蛋白及合成肽抗原在GBV-C/HGV感染诊断中的应用
GBV-C是近几年刚发现的新病毒,对其致病性等方面的研究还不是很清楚.其诊断主要依赖于RT-PCR检测病毒RNA,但不适于临床常规检测及大面积筛查.以重组蛋白和合成肽作抗原检测血清中抗GBV-C抗体更适合于GBV-C感染的诊断和流行病学调查,有望得到广泛的应用.本文从GBV-C/HGV抗原表位研究及重组蛋白、合成肽在GBV-C感染诊断学和流行病学中的应用及其意义作一综述.
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重组蛋白及合成肽抗原在戊型肝炎病毒感染诊断中的应用
由于HEV体外培养一直未获成功,以重组蛋白或人工合成肽作为抗原来检测抗-HEV已成为戊肝实验室诊断及流行病学调查的主要手段.本文从HEV抗原表位的研究、重组蛋白和合成肽在HEV感染诊断中的应用及其诊断学意义和存在的问题几个方面作一综述.
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重组诺如病毒GⅡ4型衣壳蛋白的表达、纯化及鉴定
目的 通过基因重组方式获取高浓度重组诺如病毒GⅡ4型衣壳蛋白.方法 将诺如病毒GⅡ 4型衣壳蛋白基因片段插入pHT A载体中,测序鉴定正确后,将重组质粒转化到MAX Efficiency(C) DH10BacTM感受态细胞,表达目的蛋白.重组蛋白用Ni-NTA His蛋白亲和柱纯化,用诺如病毒检测试剂盒进行鉴定.结果 SDS-PAGE结果表明成功表达了分子量约为60 kD的重组蛋白,经诺如病毒检测试剂盒鉴定,表达产物为重组诺如病毒衣壳蛋白,并且具有较好的免疫原性.结论 构建了诺如病毒GⅡ 4型衣壳蛋白表达载体,并获得重组诺如病毒GⅡ 4型衣壳蛋白.
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重组蛋白检测肺炎支原体IgM抗体分析
目的:用重组肺炎支原体P1蛋白检测患儿血清中IgM抗体,探讨该重组蛋白抗原在肺炎支原体感染早期诊断中的应用价值.方法:被动凝集实验检测130例呼吸道感染患儿血清标本,从中选出35例阳性血清标本,用纯化的重组肺炎支原体P1蛋白做抗原,间接ELISA方法分别检测患儿血清中IgM和IgG抗体.结果:被动凝集实验检测阳性率为33.1％(43/130).间接ELISA试验MpIgM抗体的阳性率为91.4％(32/35),IgG抗体的阳性率为85.7％(30/35),两种抗体检出的阳性率比较,差异具有统计学意义(P<0.05)且两者阳性符合率为93.3％.结论:重组肺炎支原体P1蛋白抗原检测IgM抗体提高了检测的特异性和敏感性,适用于肺炎支原体感染的早期诊断.
关键词： 肺炎支原体 重组蛋白 ELISA IgM抗体 -
7种结核分枝杆菌重组蛋白的纯化及血清学特性
目的 分离纯化结核分枝杆菌重组蛋白38-kDa、16-kDa、Mtb81、ESAT-6、CFP10、Rv3425、Rv3391,并比较7种蛋白的免疫学特性,评价其在结核血清学诊断中的应用价值.方法 利用间接酶联免疫吸附试验评价确诊结核病人、非结核病人、健康人血清中7种重组蛋白的抗原性.结果 成功分离纯化了7种重组蛋白；酶联免疫吸附试验结果表明,7种抗原均能有效区分确诊结核病人、非结核病人和健康人,其中阳性率高的是ESAT-6为47.3％,特异性高的是Rv3391为98.3％.联合抗原中阳性率和特异性高的是CFP10+ ESAT-6+ Rv3391抗原组合.结论 单一抗原中ESAT-6具有较高的免疫原性,联合抗原中CFP10+ ESAT-6+ Rv3391抗原具有很高的阳性率和特异性,在结核诊断具有很高的诊断潜力.
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GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白的表达和纯化鉴定
目的 通过杆状病毒表达系统,获取高纯度GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白,为制备抗GⅡ.3型诺如病毒单克隆和多克隆抗体提供免疫原.方法 将GⅡ.3型诺如病毒衣壳蛋白基因片段修饰后插入pHTA表达载体中,经测序鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化到MAX Efficiency(R)DH10BacTM感受态细胞中,获取表达杆粒并转染SF9细胞,表达GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白.重组蛋白用Ni-NTA His蛋白亲和柱纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定.结果 SDS-PAGE和Western blot结果表达了分子量约为60 kDa的重组蛋白,动物试验表明重组蛋白具有较好的免疫原性,为制备抗GⅡ.3型诺如病毒单克隆抗体和多克隆抗体、建立相应的免疫学检测方法奠定了基础.结论 构建了GⅡ.3型诺如病毒衣壳蛋白表达载体,并获得GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白.
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重组人乳铁蛋白致敏性的初步研究
目的 初步评价牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白(rhLf)的致敏性.方法 通过生物信息学分析和消化稳定性试验了解rhLf致敏的可能性.结果 生物信息学分析显示rhLf与已知致敏原乳转铁蛋白和卵转铁蛋白有序列同源性,与Asp f2、Ole e 10和Ole e9存在结构相似性.消化稳定性试验显示rhLf在胃液中易被消化成小片段,在肠液中不易被消化.结论 rhLf具有一定的潜在致敏可能性.
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重组人α-乳清白蛋白潜在致敏性的生物信息学预测
目的 通过生物信息学分析预测牛乳腺生物反应器表达的重组人α-乳清白蛋白(rhLA)的致敏性.方法 使用在线致敏原数据库(The Allergen Online Database)、致敏蛋白结构数据库(Structural Database of Allergenic Proteins)和食品安全致敏原数据库(Allergen Database for Food Safety),分析目标蛋白与已知致敏原的序列或结构相似性.结果 rhLA致敏性的生物信息学分析结果显示,rhLA与已知致敏原牛α-乳清白蛋白、牛乳糖合酶B蛋白(致敏原Bos d 4)、鸡溶菌酶C(1,4-β-N乙酰胞壁质酶C、致敏原Gal d Ⅳ、致敏原Gal d 4)存在较高的序列或结构同源性.结论 rhLA具有潜在的致敏可能性.
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小鼠PDL1胞外区的克隆、表达及生物学效应研究
目的:克隆小鼠PDL1膜外区(简称mPDL-1IgV)基因,构建原核表达载体,检测其表达和生物学活性.方法:提取小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆mPDL-1IgV基因,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达质粒pET28a(+)/rap.DL-1IgV,转化大肠杆菌DH5et,进行PCR和双酶切鉴定,并测序.筛选阳性菌落,提取质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Westemblot检测分析,同时纯化mPDL-1 IgV蛋白,进行生物学活性检测.结果:从小鼠脾细胞总RNA中成功获得mPDL-1IgVcDNA克隆,重组质粒pET28a(+)/mPDL-1IgV构建正确.转化pET28a(+)/mPDL-1 IgV的E.coli BL21(DE3)成功诱导性表达重组小鼠PDL-1胞外区蛋白,并纯化mPDL-1IgV蛋白,对其进行了复性和浓缩,复性后的蛋白显示出良好的生物学活性.结论:成功地克隆、表达和纯化了小鼠PDL1胞外区蛋白,为进一步研究其功能提供了条件.
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人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与鉴定
人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用.本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定.首先密码子优化设计合成了HCoV-NL63的RBD大片段(RL:232-684aa)与小片段(RS:476-616aa)的编码基因,并将其克隆进硫氧还蛋白表达载体pM48,构建了人冠状病毒NL63的受体结合区蛋白(RBD)大(RL)、小(RS)片段与硫氧还蛋白的融合表达质粒；转化E.coli BL21pLys S,利用IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析对蛋白进行纯化,并以表达HCoV-NL63 RL与RS蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠血清对重组蛋白进行免疫印迹鉴定.结果表明在37℃,0.8mM IPTG诱导4h时,蛋白表达量达到高,融合蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后纯度可达95％以上.Western blot显示,两个融合蛋白均与痘苗病毒(天坛株)表达的HCoV-NL63 RL与RS蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应.本研究首次在国内用原核系统表达纯化并鉴定了人冠状病毒NL63受体结合区大小蛋白(RL和RS),为人冠状病毒NL63感染的免疫学检测与疫苗研究提供了基础.
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家蚕核型多角体病毒的基因组结构及其表达模式
Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV)是家蚕(Bombyx mori)的重要病原,属于杆状病毒.20世纪80年代后期发展了基于杆状病毒作为载体的昆虫杆状病毒表达系统技术.由于家蚕可以规模化饲养,利用重组的BmNPV以家蚕作为"生物工厂"生产重组蛋白因具有低成本、适合产业化的优点而受到高度重视.BmNPV的分子生物学研究以及作为表达载体的应用在过去十几年间得到了较快发展,本文主要就近年来关于BmNPV的基因组结构及其基因表达模式的研究作一概述.
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重组BJ46a 蛋白抑制B16 细胞的体外侵袭及转移
目的 探讨蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a的抗肿瘤侵袭及转移作用. 方法 以蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a为目的基因,选择杆状病毒表达系统生产重组BJ46a蛋白,纯化并测定其生物学活性;利用Alamar blue法及Transwell小室分析法评价重组蛋白对小鼠黑色素瘤细胞B16体外生长、黏附、运动和侵袭能力的影响(n＝3). 结果 经ProBond亲和层析纯化出的重组BJ46a蛋白具有抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的活性;经重组BJ46a蛋白处理的B16 细胞穿过 Matrigel的细胞数明显低于对照组(P<0.01),抑制率为84.8%. 结论重组BJ46a蛋白能抑制B16细胞的侵袭转移.
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旋毛虫Ts87重组蛋白诱导的小鼠黏膜免疫保护性研究
本实验探讨旋毛虫Ts87重组蛋白灌胃免疫小鼠诱导的黏膜免疫保护性作用.实验分对照组、佐剂组(霍乱毒素B亚单位组,CTB)和免疫组(CTB+Ts87重组蛋白),灌胃免疫,间隔1周共免疫3次.末次免疫后第7天用400条旋毛虫感染期幼虫攻击,比较3组小鼠肠道成虫数、雌虫生殖力和肌幼虫数.且于末次免疫后第7天刮取肠黏液、取血检测特异性sIgA、IgG抗体水平.结果显示免疫组小鼠成虫减虫率、新生蚴减虫率、肌幼虫减虫率分别是81.34%、67.02%、84.49%;小鼠肠黏液sIgA水平及血清IgG水平显著高于对照组和佐剂组.结果表明Ts87重组蛋白黏膜免疫能够诱导小鼠产生抗旋毛虫的保护性免疫.灌胃免疫能显著提高肠黏液特异性sIgA水平,对促进肠道成虫的排出有明显作用.
关键词： 旋毛虫 黏膜免疫 重组蛋白 霍乱毒素B亚单位(CTB) IgA -
白纹伊蚊(广州株)唾液Aalb_56ku基因克隆表达与免疫原性分析
探讨Aalb_56 ku基因在白纹伊蚊(广州株)不同组织中的表达差异;对唾液腺中Aalb_56 ku基因进行克隆表达并探索其免疫原性.采用实时荧光定量RT-PCR法对雌蚊中肠、脂肪体、唾液腺不同组织中Aalb_56 ku基因的表达差异进行分析.针对Aalb_56 ku基因序列设计特异性引物,以唾液腺RNA为模板获得56 ku全长基因序列,构建重组质粒并测序,将测序序列进行生物信息学和抗原表位预测分析.IPTG诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白;制备小鼠特异性抗Aalb_56 ku蛋白抗血清.结果显示,Aalb_56 ku在白纹伊蚊(广州株)唾液腺(SG)中高表达.克隆所获唾液腺56 ku基因全长1 593 bp,可编码530个氨基酸,信息学分析提示该基因含有信号肽序列,等电点为8.40,抗原表位预测提示含有23个表位.pET30a(+)-56 ku重组质粒可表达约56 kDa大小的融合蛋白,且呈包涵体形式表达,Western blotting鉴定具有His标签.纯化蛋白免疫Balb/c小鼠后可获得1:100效价的特异性抗血清,提示该重组蛋白具有一定的免疫原性.
关键词： 白蚊伊蚊 Aalb_56ku基因 重组蛋白 免疫原性 -
旋毛虫Ts87重组蛋白诱发小鼠保护性免疫的研究
为了进一步探讨旋毛虫Ts87基因原核表达重组蛋白的保护性免疫作用,本试验用此纯化重组蛋白组分加福氏完全佐剂(FCA)皮下注射免疫NIH小鼠3次,继以旋毛虫感染性幼虫250条攻击,攻击后每周取血清测抗体IgG滴度,第35天计数小鼠肌肉幼虫数.结果显示重组蛋白免疫鼠的肌肉幼虫减虫率为42.3%,血清抗Ts87重组蛋白体IgG的几何平均倒数滴度(GMRT)达到8 000以上,均显著高于佐剂组和对照组.Ts87基因表达的重组蛋白可产生明显的保护性免疫作用.
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普氏立克次体120kDa表面蛋白N端和C端重组蛋白的抗原特异性研究
用免疫印迹和酶联免疫吸附试验分析普氏立克次体N端和C端重组蛋白,发现2个重组蛋白除与普氏立克次体免疫血清发生特异性反应外,并与立氏立克次体免疫血清发生反应,这2种立克次体也被这2个重组蛋白免疫血清所识别,提示这2个重组蛋白含有普氏和立氏立克次体的共同抗原决定簇.
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EB病毒病毒壳抗原、核心抗原重组蛋白的制备及在鼻咽癌血清学诊断中的应用
目的 探讨EB病毒(EBV)病毒壳抗原(VcA)-BFRF3和核心抗原(NA)1-BKRF1重组蛋白在鼻咽癌(NPC)血清学诊断中的应用.方法 以EBV DNA为模版,用PCR扩增目的基因BFRF3和BKRF1,捅入大肠杆菌表达载体pET.51b后转化大肠杆菌JM109,诱导重组蛋白表达.表达产物经SDS-PAGE、免疫印迹分析鉴定,金属螯合亲和层析纯化后,分别制备用BFRF3、BKRF1及BFRF3,BKRF1作为包被抗原的ELISA试剂,检测NPC患者和正常人群EBV-IgA抗体.结果 大肠杆菌高效表达BFRF3和BKRF1重组蛋白,表达产物相对分子质量分别为20000和29000,均有良好免疫反应性;BKRF1的NPc诊断灵敏度(71.20%,178,250)明显高于BFRF3(64.80%,162,250)(P<0.01),但两者NPc诊断特异性差异无统计学意义(P>0.05);相对于单独应用一种抗原,联合两种重组抗原的方法诊断NPC具有高灵敏度(84.80%,212,250)和相对低的特异性(82.00%,328,400)(P<0.01).结论 NA1-BKRF1诊断NPC的灵敏度高于VCA-BFRF3,两种抗原联合使用,可提高诊断灵敏度,但特异性明显降低.
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猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18在乳球菌中的表达
目的 观察猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中的表达情况. 方法 将胞内型表达载体pMG36e-TSOL18和分泌型表达载体pMG36 e-SP-TSOL 18电穿孔转化至L.lactis MG1363,PCR鉴定阳性克隆,经热诱导后采用SDS-PAGE和Western blot分析表达情况. 结果 PCR鉴定重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18成功转入L.lactis MG1363.SDS-PAGE检测重组质粒pMG36e-TSOL 18转化菌仅在胞内表达相对分子质量(Mr)约为15×103的TSOL18目的蛋白,pMG36e-SP--TSOL 18转化菌胞内和胞外均表达相应的TSOL 18目的蛋白,其相对分子质量(Mr)为15×103,与预期相符;Western blot分析重组pMG36e-TSOL18/L.lactis胞内表达的TSOL 18重组蛋白以及pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis胞内和胞外表达的TSOL 18重组蛋白均能被相应兔抗血清识别. 结论 猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18转化L.lactis MG1363后仅在胞内表达TSOL18蛋白,pMG36e-SP-TSOL18转化L.lactis MG1363后胞内胞外均有TSOL18蛋白表达,但产量较低,表达的重组蛋白均具有免疫反应性.
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Ts21重组蛋白斑点免疫金渗滤法检测旋毛虫抗体的研究
目的 应用旋毛虫Ts21基因重组蛋白建立诊断人体旋毛虫病及动物旋毛虫感染的快速血清学方法.方法 以胶体金标SPA、旋毛虫Ts21重组蛋白与肌幼虫排泄-分泌(excretory-secretory, ES)抗原包被硝酸纤维素膜(NCM),分别建立Ts21重组蛋白-斑点免疫金渗滤法(Ts21-dot immunogold-filtration assay,Ts21-DIGFA)与ES-DIGFA,对旋毛虫病及其他寄生虫病患者血清和感染动物血清进行检测,并与ELISA检测结果进行比较.结果 Ts21-DIGFA检测旋毛虫病患者血清抗体的敏感性和特异性分别为94.73%和86.96%,ES-DIGFA的敏感性和特异性分别为89.47%和86.96%,差异无统计学意义(χ2敏感=0.368,χ2特异=0,P>0.05);Ts21-ELISA的敏感性和特异性分别为94.73%和94.20%,与Ts21-DIGFA相比差异无统计学意义(χ2敏感=0,χ2特异=1.272,P>0.05).Ts21-DIGFA检测旋毛虫感染猪血清的敏感性和特异性分别为88.89%和100%,ES-DIGFA的敏感性和特异性分别为94.44%和95.00%,差异均无统计学意义(χ2敏感=0,χ2特异=0,P>0.05).小鼠感染300条旋毛虫后4周Ts21-DIGFA的血清抗体检出率为100%(10/10);感染10条及5条旋毛虫后6周血清抗体检出率均为100%(10/10).DIGFA可在3 min内肉眼观察结果,抗原包被后的NCM和金标SPA在4 ℃至少保存6个月.结论 Ts21-DIGFA检测旋毛虫抗体具有较高的敏感性和特异性及良好的稳定性和重复性,可用于旋毛虫病的血清学诊断及血清流行病学调查.
关键词： 旋毛虫 斑点免疫金渗滤法 重组蛋白 排泄分泌(ES)抗原 ELISA -
重组抗原应用于SPG-ELISA检测华支睾吸虫循环抗体的效果评价
目的 评价重组抗原用于SPG-ELISA诊断华支睾吸虫感染的价值. 方法 分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(Cs-CysB)与华支睾吸虫成虫可溶性抗原(CAA),以SPG-ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG,比较两种抗原包被SPG-ELISA方法的敏感性与特异性. 结果 检测50份华支睾吸虫感染者血清,重组Cs-CysB与CAA包被的SPG-ELISA阳性率均为94.00%,健康人血清50例均为阴性;检测日本血吸虫病血清20份、并殖吸虫病血清20份、囊虫病血清10份,交叉反应率分别为5.00%、10.00%、20.00%和5.00%、0、20.00%. 结论 以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性,检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当.
