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精子抗体引起免疫性不孕
一对青年夫妻,婚后性生活十分美满,可几年都不孕.几经检查,后找到了不育的原因是患了免疫反应性不孕症.
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甲型乙型肝炎联合疫苗研究进展
本文简单介绍了甲型肝炎和乙型肝炎疫苗的研究历史,以及研制甲型乙型肝炎联合疫苗的必要性;综述了甲型乙型肝炎联合疫苗的安全性、免疫原性、免疫反应性的研究历史和现状,指出-甲型乙型肝炎联合疫苗应用上存在的问题以及未来甲型乙型肝炎联合疫苗的发展趋势.
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乙型肝炎疫苗预防效果和乙型肝炎病毒基因变异的研究
乙型肝炎(乙肝)疫苗是预防和控制乙肝病毒(HBV)感染的流行和传播有效措施,同时也是第一个有可能预防人类癌症的疫苗.国家"七五"和"八五"科技攻关课题研究证实[1-4]:国产乙肝血源疫苗免疫新生儿后,安全性、免疫原性、近期和中期预防效果均很好,但随着免疫后年限的延长,抗-HBs阳性率逐年下降,乙肝疫苗远期预防效果如何及是否需加强免疫? HBV基因变异与疫苗免疫的关系? 如何进一步提高母婴阻断效果? 新型乙肝基因重组疫苗(酵母、CHO)取代血源疫苗的可行性及其免疫反应性和近期预防效果? 及我国长期推广乙肝疫苗的成本效益等关键技术问题,直接影响我国乙肝疫苗免疫策略的完善及乙肝疫苗的效果和效益,也影响我国预防和控制乙肝战略目标的实现.为此,国家"九五"科技攻关项目开展了乙肝血源疫苗长期保护效果和基因重组疫苗近期预防效果的研究.主要研究成果综述如下.
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雷公藤治疗类风湿关节炎细胞和分子生物学机制的研究与进展
雷公藤治疗类风湿关节炎(RA)至今已40余年, 其对RA具有显著疗效[1].现认为[2]RA是易感机体由不明病因激活免疫系统后, 在综合因素作用下, 产生一种以破坏关节为主要特征的自身免疫性疾病, 即便病因不复存在, 但因分子模拟机制作用于自身抗原而发生的自身免疫反应性.
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风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白基因的表达分析
风疹病毒(rubella virus,RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员.通常RV感染症状较轻,表现为急性、轻型、病程短、自限性出疹性疾病.RV对公众健康的大威胁是它的致畸特性.妇女妊娠期,尤其是前3个月感染RV可导致新生儿产生一系列的器官畸形,称为先天性风疹综合征(CRS)[1].
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结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性
目的 通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白.方法 用PCR从结核分枝杆菌1137Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达.用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性.利用PCR技术鉴定fopA基因在不同分枝杆菌的分布.结果 32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化.表达Ag85A蛋白的fopA基因在结核分枝杆菌1137Rv、1-137Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达.结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度高.结论 重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性.
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五日热巴通体重组外膜蛋白HbpA的研制和抗原性分析
为克隆并表达五日热巴通体外膜蛋白HbpA的基因,并对其抗原性进行初步分析,采用PCR方法从五日热巴通体基因组DNA扩增hbpA基因,将目的基因片段插入原核表达质粒pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hbpA;将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导目的基因表达,以SDS-PAGE电泳以及免疫印迹实验分析表达的目的蛋白.SDS-PAGE电泳分析发现pET32a(+)-hbpA转化菌高效表达一48 kDa重组蛋白;免疫印迹分析发现该蛋白与其免疫血清发生强烈反应;间接免疫荧光分析发现该重组蛋白免疫血清能特异识别五日热巴通体.实验结果表明五日热巴通体外膜蛋白HhpA的基因已在大肠杆菌中高效表达.
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高效天然分子疫苗免疫猪血清筛选尾蚴抗原的结果分析
采用日本血吸虫天然分子(Schistosoma japonicum immature egg ws-vaccine,SjiEw)免疫猪血清识别日本血吸虫可溶性尾蚴抗原(Soluble cercariae antigen,SCA),以筛选新的具有保护性免疫潜在价值的抗原分子.按常规方法制备日本血吸虫尾蚴抗原.家猪随机分组并分次免疫日本血吸虫天然分子疫苗,制备SiiEw疫苗免疫猪血清,通过蛋白免疫印迹技术分析其与SCA的免疫反应性.结果显示SDS-PAGE中SCA有16条主带.SjiEw疫苗免疫猪血清共筛选6种具免疫学活性的抗原分子,分子量分别为:50、56、66、68、70、85kDa.这些抗原分子的获得为以后的天然分子编码基因工程疫苗的制备奠定基础.
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弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析
本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)基因原核表达重组质粒,进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性.设计合成引物,从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析.目的片段用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7,而后转入大肠埃希菌BL21 (DE3)中诱导表达,Western blotting分析表达蛋白.结果显示,从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710 bp的GRA7基因片段,构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序,目的基因片段与预期相符.重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后,可高效表达重组蛋白,Western blotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别,而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白.原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性,为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础.
关键词： 刚地弓形虫 致密颗粒蛋白7 (GRA7) 基因克隆 原核表达 免疫反应性 -
弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定
本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2 (ROP2),并初步评价其免疫反应性.主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His-ROP2,后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性.本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础.
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结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的表达、纯化及其免疫反应性分析
目的 构建结核分枝杆菌rPstS1-hspX (rph)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+)-rPstS1-hspX[pET-23b(+)-rph],表达、纯化rPstS1-HspX (rPH)融合蛋白,并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将PstS1和HspX编码基因通过多肽接头(GSGSG)的DNA序列进行连接,构建融合基因rph.将融合基因定向克隆入原核表达载体pET-23b(+),构建重组原核表达质粒pET-23b(+)-rph.将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3) pLysE感受态细胞,IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE和Western印迹法鉴定其表达情况.用镍离子鳌合亲和层析柱纯化融合蛋白,Western印迹法初步评价融合蛋白的免疫反应性.结果 融合基因rph及其原核表达载体pET-23b (+)-rph构建成功.融合蛋白rPH主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51 000,表达量约占菌体总蛋白的23％.经亲和层析后得到了纯度达92％的融合蛋白.Western印迹证实融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫反应.结论 成功构建了原核表达载体pET-23b(+)-rph,获得了rPH融合蛋白,为rPH融合蛋白在结核病诊断中的应用提供了依据.
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梅毒螺旋体Tp0259假定蛋白的原核表达、纯化及活性研究
目的 表达、纯化梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0259 (rTp0259),鉴定其免疫原性,并探讨其在梅毒血清诊断中的价值.方法 PCR扩增tp0259基因,构建pET-28a(+)/Tp0259原核表达载体,转化至E.coli BL21中诱导表达.采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,并进行Western blot鉴定.以重组蛋白Tp0259为抗原,采用Western blot方法检测梅毒患者血清(一期梅毒患者血清21份,二期梅毒患者血清13份,潜伏梅毒患者血清6份,并与梅毒诊断金标准比较).结果 PCR扩增获得600 bp左右大小的目的基因片段并成功构建原核表达载体pET28a-Tp0259,经诱导高效表达分子质量单位为28 ku的重组蛋白.Western blot证实该重组蛋白为Tp0259假定蛋白,能被梅毒患者血清识别.以Tp0259为抗原采用Western blot检测梅毒患者血清特异性抗体结果与梅毒诊断金标准(临床症状、病史结合血清学诊断方法)间的κ值为0.944,表明这两种方法检测结果的一致性较好.结论 成功表达、纯化了可溶性rTp0259,该蛋白具有良好的免疫反应性并具有较高的血清学诊断价值.
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钩虫抗原组份分析及其免疫反应性的研究
应用SDS-PAGE和ELIB对十二指肠钩虫第三期幼虫和成虫可溶性抗原蛋白组份及免疫反应性进行了比较研究.SDS-PAGE电泳结果显示,钩虫幼虫和成虫蛋白区带数分别为21条和19条.ELIB反应表明,钩虫幼虫和成虫特异性抗原组份为40～41 kDa和54～56 kDa.该结果为钩虫病免疫学及其疫苗的研究提供了科学资料.
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间日疟原虫PvMSP1-19基因重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建与鉴定
目的 体外扩增间日疟原虫pvMSP1-19基因,构建大肠埃希菌-穿梭质粒PMV261/pvMSP1-19和电转化耻垢分枝杆菌.方法 采用聚合酶链反应(PCR),体外扩增间日疟原虫的pvMSP1-19基因,克隆入PMD19-T载体,构建亚克隆PMV/pvMSP1-19大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒；电转化方法将PMV/pvMSP1-19穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中.并热诱导此重组分枝杆菌,SDS-PAGE电泳观察pvMSP1-19蛋白的表达,Western blot鉴定其免疫学活性.结果 成功扩增了间日疟原虫pvMSP1-19基因,并且正确构建PMV/pvMSP1-19穿梭质粒和转化耻垢分枝杆菌.采用Westernblot证实该重组耻垢分枝杆菌表达的pvMSP1-19蛋白能被间日疟患者的血清识别.结论 构建的重组耻垢分枝杆菌能表达pvMSP1-19蛋白,该蛋白具有免疫反应性,为pvMSP1-19基因重组BCG疫苗的研制提供了必要的基础.
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猪囊尾蚴膜联蛋白基因的原核表达和免疫学分析
目的 对猪囊尾蚴AF239799-1膜联蛋白基因进行高效原核表达,对表达产物进行免疫学分析. 方法 通过DNA自动合成仪,用固相亚磷酸酰胺法合成一段5'端有Nde Ⅰ内切酶位点,3'端有Xho Ⅰ内切酶位点的猪囊尾蚴AF239799-1基因序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,经测序、PCR及双酶切鉴定后,将其转入到宿主菌E.coli BL21 (DE3)中,用IPTG诱导表达,表达产物采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化,纯化的重组蛋白用Western blot进行免疫学分析. 结果 该基因全长为1 250 bp,编码区为2～1 042 bp,编码346个氨基酸,理论分子质量、等电点分别为40.39 ku和6.80.经DNA测序、PCR及双酶切鉴定,pET28a(+)-AF239799-1重组质粒构建成功.重组质粒在E.coli BL21 (DE3)主要以包涵体形式表达,Westernblot显示重组蛋白可被猪带绦虫病猪血清识别. 结论 猪囊尾蚴AF239799-1基因可在原核表达系统中高效表达,表达产物具有免疫反应性.
关键词： 猪囊尾蚴 AF239799-1基因 原核表达 免疫反应性 -
截短弓形虫表面抗原SAG2C的基因克隆、蛋白表达及其初步应用
目的 克隆截短的弓形虫表面抗原SAG2C基因,在大肠埃希菌中表达SAG2C蛋白,并探讨其在弓形虫病诊断中的应用.方法 对已知的弓形虫SAG2C基因序列进行部分取舍,用RT-PCR技术从弓形虫Prugniaud(PRU)株的总RNA中扩增截短的SAG2基因片段,插入载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达,应用Western blot和ELISA检测重组表达蛋白的免疫反应性.用重组SAG2C蛋白ELISA法检测弓形虫感染血清特异抗体,观察初步应用效果.结果 从弓形虫PRU株总RNA中扩增出截短的SAG2C基因片段,成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-tSAG2C;该重组质粒经IPTG诱导能表达可溶性大小为51 ku的SAG2C蛋白.Western blot显示重组SAG2C能被弓形虫感染小鼠血清识别;以重组SAG2C蛋白、重组SAG1蛋白及BAG1蛋白 ELISA检测精神病患者L清弓形虫抗体,阳性率分别为8.07％(23/285)、4.56％ (13/285)和7.37％(21/285),差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了重组质粒pET32a(+)-tSAG2C,表达的融合蛋白具有免疫反应性,具有用于弓形虫感染诊断的潜在价值.
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猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析
目的 将猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因进行原核表达,分析重组蛋白的免疫反应性. 方法 根据Ts8B3基因序列设计引物,以囊尾蚴RNA反转录的cDNA为模板PCR扩增Ts8B3基因,扩增产物经BamH I /Xho I双酶切后连接至原核表达载体pGEX 4T-1,将重组质粒转化人大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli BL21,用异丙基-βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物.纯化重组蛋白,以囊虫病人血清为一抗,采用Western blot分析其免疫反应性.结果 PCR扩增Ts8B3基因片段为201 bp,双酶切和测序显示重组表达质粒构建成功.重组质粒转化BL21后经IPTG诱导4h,以包涵体的形式表达相对分子质量单位(Mr)为33×103的目的蛋白.纯化的重组蛋白能被囊虫病患者血清识别. 结论 成功构建Ts8B3基因重组质粒,表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础.
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幽门螺杆菌临床分离株flaA和flaB基因的克隆、表达和鉴定
所有幽门螺杆菌(Hp)菌株均有鞭毛,由染色体基因组中的flaA和flaB两个基因编码,全长分别为1 533bp和1 545bp,其核苷酸或氨基酸序列高度保守,与其它细菌鞭毛蛋白无抗原交叉,多数Hp感染者血清中可出现FlaA和FlaB抗体[1],因而FlaA和FlaB可作为基因工程疫苗和诊断试剂盒的候选抗原.我们构建了Hp临床菌株Y06的高效原核表达系统,鉴定了重组FlaA(rFlaA)和重组FlaB(rFlaB)抗原性和免疫反应性,检测了Hp临床分离菌株FlaA、FlaB抗原表达和感染者血清抗体情况.
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贝氏柯克斯体30kD外膜蛋白基因表达及免疫保护性的研究
贝氏柯克斯体可引起人类急、慢性Q热.急性Q热临床表现多种多样,主要症状为发热、头痛和肌肉酸痛,并常伴有肺炎、肝炎等.慢性Q热常发展为Q热性心内膜炎、骨髓炎.Q热疫苗是预防Q热流行的有效手段,目前人用Q热疫苗是灭活的柯克斯体.虽然灭活疫苗的免疫保护效果很好,但注射该疫苗接种部位常出现不良反应.研究发现,在贝氏柯克斯体的Ⅰ相和Ⅱ相中含有相对分子质量(Mr)为30×103的外膜蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性[1].我们采用分子生物学技术,研制出贝氏柯克斯体Mr 30×103重组外膜蛋白,用重组蛋白免疫小鼠,对其免疫保护性进行初步评价,探讨该重组蛋白作Q热疫苗的可行性.
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幽门螺杆菌Lpp20核酸疫苗的构建及其免疫活性的初步研究
目的 构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Lpp20,并在HeLa细胞中进行表达.通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平.方法 用PCR法扩增Lpp20全基因,再将Lpp20基因克隆至pcDNA3.1(+)真核细胞表达载体构建pcDNA3.1(+)/Lpp20重组体,观察其在HeLa细胞中的表达.将核酸疫苗PcDNA3.1(+)/Lpp20、对照空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分组通过肌肉注射免疫6周龄C57BL/6小鼠.隔2周免疫一次,共免疫4次.间接ELISA法测定小鼠血清中抗Lpp20 IgG抗体水平,双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应.通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在.结果 小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,6周后ELISA测定血清抗体A450值为0.74,效价为1:1024.核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显升高[(410.36±56.23)ps/ml],与空质粒组[(25.26±10.85)pg/ml]之间差异有统计学意义(P<0.01).脾淋巴细胞增殖反应测定,核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数(2.37±0.22)明显高于空质粒组(1.53±0.47)和PBS组(1.20±0.13),P<0.01.PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在.结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗,且其在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答.为进一步研究该疫苗的免疫保护作用提供实验依据.
