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卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/mGM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定
目的构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv和鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM),以观察其在动物体内诱导的特异性免疫反应,为卵巢癌抗独特型疫苗应用于临床提供依据. 方法用DNA重组技术,将mGM-CSF连于单链抗体6B11ScFv羧基末端,构建重组质粒pET30-6B11mGM,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,以包涵体形式获高效表达,超声破碎细菌细胞获得包涵体,用8mol.L-1尿素溶解包涵体后直接稀释复性,SDS-PAGE分析蛋白纯度,ELISA分析技术和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性. 结果复性蛋白纯度达90%以上.采用氧化型谷胱甘肽(GSSG)浓度为1mmol.L-1,还原型谷胱甘肽(GSH)浓度为5mmol.L-1,10℃复性48h,复性率达36%.表达的融合蛋白分别能与COC166-9单抗和大鼠抗小鼠GM-CSF单抗特异结合,并能刺激mGM-CSF依赖株NFS-60细胞增殖. 结论以包涵体表达的融合蛋白6B11mGM保留了两种蛋白的活性,为研究融合蛋白在体内的免疫功能提供了基础.
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大鼠凝血因子Ⅶ EGFP-EGF1融合蛋白的表达及其结合功能初步研究
本研究通过融合蛋白EGFP-EGF1的表达,探讨大鼠凝血因子Ⅶ上EGF1片段与组织因子(TF)的结合功能.用RT-PCR方法自大鼠肝脏组织获得EGF1编码区基因并将其插入EGFP原核表达载体中,构建pET28aEGFP-EGF1融合蛋白表达载体;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达EGFP-EGF1融合蛋白;采用亲和层析方法Ni柱纯化融合蛋白,将融合蛋白作用于经脂多糖刺激表达TF的大鼠血管内皮细胞;通过荧光显微镜及流式细胞术观察和检测融合蛋白与细胞结合情况.结果表明:EGFP-EGF1在转化的大肠杆茵中获得高效表达并成功纯化,SDS-PAGE证实分子量约为36kD.荧光显微镜及流式细胞术检测显示该融合蛋白能与内皮细胞膜上的TF结合.结论:大鼠凝血因子Ⅶ上EGF1区可介导FⅦ与TP特异性结合,从而可能为分子靶向抗栓治疗研究提供部分基础.
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注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的药效学、药代动力学及安全性评价研究
目的 对拥有独立自主知识产权的世界原创原研注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(rHSA/EPO)创新药开展临床前药效学、药代动力学和安全性评价研究.方法 通过对动物体内外试验研究,观察rHSA/EPO升红细胞(网织红细胞)作用.药效学研究观察rHSA/EPO对小鼠、食蟹猴以及不同的大鼠肾性贫血模型的红细胞生成影响.药代动力学研究则是对rHSA/EPO不同剂量、单次、多次给药大鼠与食蟹猴后的药代/毒代进行研究.毒理学研究通过rHSA/EPO给予小鼠、大鼠和食蟹猴后,观察其一般毒性以及生殖毒性等反应,从而对安全性做出评价.结果 药效学研究结果显示rHSA/EPO可刺激小鼠、大鼠和食蟹猴生成红细胞,升高网织红细胞计数(Ret%),同时对药物或肾切除造成损伤所致的肾性贫血大鼠模型,rHSA/EPO每周或者每2周给药一次,与阳性对照药rhEPO每周给药3次均显示出显著的治疗作用,且较rhEPO具有明显的长效性.药代动力学研究结果显示rHSA/EPO在食蟹猴体内的半衰期平均值约为53.34 h,比rhEPO的平均半衰期7.16 h要长,rHSA/EPO不与血浆蛋白结合,不易透过血脑屏障,主要排泄器官为肾,在动物体内的吸收和消除均慢于rhEPO.毒理学研究结果显示rHSA/EPO以100、300、1000μg/kg单次皮下注射给予ICR小鼠,对其中枢神经系统功能无影响,以25、100、400μg/kg单次皮下注射给予食蟹猴,对其呼吸与心血管系统无明显影响,单次皮下注射给予SD大鼠和食蟹猴未见明显毒性反应,大耐受剂量分别为10 mg/kg和4 mg/kg,rHSA/EPO未见胚胎毒性和致畸性.食蟹猴及大鼠重复给药毒性试验可见与药理学作用相关的即红细胞增多引起的血液生化、骨髓造血和(或)胃肠、肾脏的一些变化,停药后可见恢复趋势,给药后3周可产生抗rHSA/EPO的结合抗体IgG.大鼠体内产生的抗体较食蟹猴的强,与受试物中含有HSA相关,因而在大鼠重复给药毒性试验中也就出现由于抗体的产生中和了体内的EPO,进而可见严重贫血现象.结论 rHSA/EPO具有显著的升红作用,表现出长效特征,总体安全性好,毒性表现与常规rhEPO产品相似,没有出现新的不良反应.研究结果可为rHSA/EPO临床试验研究提供参考,并具有重要的指导意义.
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口服鼠疫F1-Ⅴ重组融合蛋白活菌疫苗的构建及免疫效果的初步研究
鼠疫耶尔森菌能产生很多由染色体或质粒编码的毒力因子,包括pgm、pst、Yops、F1抗原、Ⅴ抗原等[1].F1和V抗原已被证实为主要保护性抗原,且存在属间保守性,F1-Ⅴ融合抗原分子在免疫原性和免疫保护性上具有叠加效应,将两者联合接种可保护小鼠抵抗109 LD50强度攻击[2].在鼠疫杆菌基因组、蛋白组和功能基因组研究的基础上,F1和Ⅴ是鼠疫新型疫苗研究首选的保护性抗原分子的靶标.
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复合佐剂 MF59／hBCG 对结核病蛋白疫苗免疫原性的影响
目的：探讨复合佐剂[MF59和热灭活BCG（hBCG），MF59/hBCG]对结核分枝杆菌重组融合蛋白PstS1-LEP 免疫原性的影响。方法 BALB/c 小鼠分为6组，1组：MF59＋PstS1-LEP；2组：MF59/hBCG＋PstS1-LEP；3组：hBCG＋PstS1-LEP；4组：MF59；5组：PstS1-LEP；6组：hBCG。分别于第0、2、4周皮下免疫小鼠。末次免疫2周后解剖小鼠，PstS1-LEP体外刺激培养脾细胞和腹腔巨噬细胞。间接ELISA检测血清抗PstS1-LEP抗体，夹心ELISA检测培养上清细胞因子含量。结果1组IFN-γ、IL-1β、IgG、IgG1和IgG2a水平显著高于4组、5组和6组（P＜0.05），IL-2和IL-4水平显著高于4组和6组（P＜0.05）。2组IFN-γ、IL-1β、IL-12、IgG、IgG1和IgG2a水平显著高于4组、5组和6组（P＜0.05），IL-2水平显著高于4组和6组（ P＜0.05）。3组IL-4水平显著高于4组（ P＝0.05），IL-1β水平显著高于4组和5组（ P＜0.05），IgG水平显著高于4组和6组（ P＜0.05）， IgG1水平显著高于4组、5组和6组（ P＜0.05）。结论以PstS1-LEP为抗原，hBCG佐剂偏向诱导Th2型免疫反应，MF59佐剂诱导Th1/Th2型免疫反应，MF59和hBCG联合抑制脾细胞分泌IL-4，但增强巨噬细胞分泌IL-12。
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Id3-EGFP融合基因表达载体的构建及其在人肺癌细胞A549中的表达
目的 构建人分化抑制因子3(Id3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因表达载体pEGFP/Id3,使Id3-EGFP融合蛋白在人肺癌细胞A549中得到表达.方法 扩增并克隆人Id3 cDNA,构建Id3和EGFP的融合基因表达载体pEGFP/Id3.用脂质体转染技术将pEGFP/Id3导入A549细胞,使Id3-EGFP融合蛋白在A549细胞得到表达.结果 经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实,Id3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游,获得融合基因表达载体pEGFP/Id3.利用脂质体转染技术将pEGFP和pEGFP/Id3转入A549细胞,24 h后,在激光共聚焦荧光显微镜下可观察到表达EGFP的细胞发出绿色荧光,流式细胞术分析表明,转染48 h时EGFP阳性表达细胞率高,分别可达65.40%和60.50%.pEGFP/Id3转染的A549细胞S期细胞和G2期细胞比例均明显高于pEGFP转染细胞组和未转染细胞组,表明Id3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论 真核表达载体pEGFP/Id3的成功构建及其在A549细胞中的表达,为研究Id3的细胞定位表达及Id3在细胞生长调控中的作用奠定了实验基础.
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重组融合蛋白TNFR2-Fc-IL-1ra抑制血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心肌肥厚
目的 探讨新型重组融合蛋白TNFR2-Fc-IL-1ra(TFI)对高血压心肌肥厚的抑制作用及可能机制.方法 8周龄雄性C57BL/6J健康小鼠24只随机分为3组:对照组(生理盐水)、模型组[血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1500 ng/(kg·min),灌注7 d]、治疗组[AngⅡ1500 ng/(kg·min)+TFI 5 mg/(kg·2d)],每组8只.第7天时采用鼠尾套法检测尾动脉血压、超声检测心脏结构及功能;即刻处死并取其心脏进行组织切片,行苏木素-伊红(HE)染色观察大体形态;麦胚凝集素(WGA)染色观察心肌细胞肥大;免疫组化染色检测各组心肌中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β);实时定量PCR检测TNF-α、IL-1β和心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的mRNA水平.结果 与对照组相比,模型组1、3、7d的血压明显升高;左心室舒张、收缩末期前壁厚度增厚;心肌细胞横截面面积[(322.2±11.6)比(199.7±12.4)μm2]明显升高;TNF-α[(1.33±0.26)％比(0.03±0.01)％]和IL-1β[(1.84±0.33)％比(0.08±0.03)％]阳性面积增加;TNF-α、IL-1β、ANP和β-MHC mRNA表达升高(均P＜0.05).与模型组相比,治疗组小鼠血压无明显变化;心室壁厚度减轻;心肌细胞横截面面积减小;TNF-α、IL-1β表达降低;ANP和β-MHC mRNA表达降低(均P＜0.05).结论 TFI通过抑制炎症反应改善心肌肥厚.
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胃癌相关基因GCRG224的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224.方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:高效表达出相对分子量约16 800的重组融合蛋白.薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%.结论:在大肠杆菌中成功表达了GCRG224重组融合蛋白.
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幽门螺杆菌HspA与大肠杆菌LTB基因融合及表达
目的:构建和表达人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A亚单位(HspA)与E. coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.方法:采用PCR技术从人H pylori染色体DNA中扩增出354 bp的HspA基因,并克隆至pPLtB载体中与1tB基因融合,形成含有1tB-H spA融合基因的原核表达载体pPLH,并在工程菌E.coli JM109中诱导表达.结果:经序列分析,1tB-HspA融合基因由684个碱基组成,为编码228个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Westernblotting检测发现,融合蛋白的Mr 25×103,并与Hpylori感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示融合蛋白中存在LTB组分,并保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论:LTB-HspA融合蛋白有可能用于Hpylori基因工程疫苗的研究.
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卵巢癌抗独特型单链抗体3D5ScFv/鼠GM-CSF融合蛋白(3D5mGM)的构建、表达
目的构建卵巢癌抗独特型单链抗体3D5ScFv 和鼠GM-CSF 融合蛋白(3D5mGM ),并对其活性进行鉴定.方法用DNA 重组技术,将3D5ScFv基因与鼠粒细胞集落刺激因子(mGM-CSF)基因融合,插入到pET30a(+)中,构建重组质粒pET30a-3D5mGM,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导,以包涵体形式获高效表达,超声破碎细菌细胞获得包涵体,用8 mol/L尿素溶解包涵体后直接稀释复性,SDS-PAGE分析蛋白纯度,ELISA和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性.结果复性蛋白纯度达90% 以上.表达的融合蛋白能够与OC125单抗结合,也能与大鼠抗小鼠GM-CSF 单抗特异结合.并能刺激mGM-CSF 依赖株NFS-60细胞增殖.结论表达的融合蛋白3D5mGM保留了两种蛋白的活性,为进一步研究该融合蛋白治疗卵巢癌的可能性提供了基础.
关键词： 卵巢癌 重组融合蛋白 抗独特型抗体 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 -
重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎
目的 研究注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(etanercept)对活动性类风湿关节炎(RA)患者的疗效和安全性.方法 89例患者随机分为试验组和对照组.试验组皮下注射etanercept治疗,每周2次,每次25mg;对照组每周1次口服甲氨喋呤(MTX,每周12.5mg),疗程12周.结果 治疗2周后,etanercept组ACR20有效率为44.4%,MTX组为22.5%,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).治疗8周后,etanercept组与MTX的ACR20有效率组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).治疗12周后,etanercept组ACR20有效率为66.7%,MTX组为42.50%,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).两组不良反应无明显差别.结论 和口服MTX相比,采用etanercept治疗活动性RA能更快的缓解症状,具有良好的安全性和显著的疗效.
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年龄相关性黄斑变性的药物治疗进展
伴随老龄社会的步入，一组在医药发展历程中不曾出现的疾病群，成为临床和社会关注的热点，包括年龄相关性视网膜黄斑病变（ age-related macular degeneration，AMD），归属于当前老年人致盲的重要原因。其中，湿性型（渗出型）视网膜黄斑病变以脉络膜新生血管（ choroidal neovascularization，CNV）异常增生为特征，以血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor，VEGF）过度生长为机制，以致盲与视力减退为疾病终点，严重影响着人们的生活质量。作为一种非侵入疗法，靶向药物（包括分子和抗体靶向药物）治疗为研发的重点，并成为了防治AMD的主要手段。康柏西普是中国获得世界卫生组织（ WHO）国际通用名的生物制品1类新药，为利用中国仓鼠卵巢细胞（ CHO细胞）表达系统产生的重组融合蛋白，与VEGF亲和力高，作用全面，可同时阻断VEGF所有亚型（VEGF-A、VEGF-B）和胎盘生长因子（placenta growth factor，PIGF）。在多项临床研究中，康柏西普显示出了良好的效果，为新型靶向药物的研发开创出一条科学、严谨并可借鉴的路径。
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胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽与肿瘤坏死因子的融合与鉴定
目的 将胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽pd20与人肿瘤坏死因子α(TNF-α)进行基因融合,并构建原核表达载体,表达pd20-TNF-α融合蛋白.方法 利用全基因合成法制备pd20-TNF-α融合基因,构建pd20-TNF-α原核表达载体,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达.对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot 检测分析.结果 成功构建了pd20-TNF-α重组融合质粒,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量约21000处出现了1条新生的蛋白条带,转印NC膜后该融合蛋白可与抗TNF-α单克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了pd20-TNF-α基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达,为下一步融合蛋白的纯化奠定了实验基础.
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重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对类风湿关节炎病人实验室指标的影响的初步观察
目的:观察重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc,商品名"益赛普")对类风湿关节炎病人实验室指标的影响.方法:采用随机、双盲双模拟、阳性药物对照的方法,将40例活动性类风湿关节炎病人随机分为试验组和对照组.治疗组20例,受试者每周口服1次空白模拟甲氨喋呤(MTX)(7.5mg/次起,8周内逐步加到15mg/次),同时每周2次皮下注射rhTNFR:Fc(25mg/次);对照组20例,受试者每周1次口服MTX(7.5mg/次起,8周内逐步加到15mg/次,同时每周2次皮下注射空白模拟rhTNFR:Fc(25mg/次).连续用药24周.观察药物对血常规、肝肾功能和类风湿关节炎炎症活动指标的影响.结果:治疗组出现1例白细胞下降,1周内复查恢复正常,未发现药物对红细胞系统、血小板系统和肝肾功能有不良影响.治疗后两组病人的ESR均有明显下降,但益赛普于用药2周即可显著降低ESR,起效速度快于对照组.两组病人CRP、RF滴度均有显著下降,两组差别无统计学意义.结论:益赛普与MTX均可有效降低RA炎症或病情活动的指标.益赛普有良好的实验室指标安全性.
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家蝇抗真菌肽MAF-1原核表达条件优化及活性验证
目的 优化家蝇抗真菌肽(MAF-1)原核表达条件及重组蛋白的活性验证.方法 利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Quantity One凝胶电泳图像分析系统研究不同的诱导温度、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响;融合蛋白用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行蛋白纯化,切除His标签后进行活性验证.结果 在加入浓度为25 μmol/L的IPTG,34℃诱导18h,融合蛋白的表达量高;融合蛋白纯化后浓度为0.706 mg/mL,其低抑杀白色念珠菌的浓度为70 μg/mL.结论 成功获得重组融合蛋白的佳表达条件,并纯化目的蛋白,切除His标签后的目的蛋白具有抗真菌活性.
关键词： 家蝇抗真菌肽(MAF-1) 重组融合蛋白 表达条件 纯化 -
自身抗原gp210融合蛋白的重组表达及其临床应用研究
目的 重组表达人核包膜蛋白自身抗原gp210融合蛋白,以用于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的临床诊断和病情监测.方法 针对基因库中人gp210的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体PET28a(+),构建重组表达载体PET28a(+)-gp:210,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质,并经SDS-PAGE、Western-blot鉴定重组表达的gp210融合蛋自,进一步经Ni2+亲合层析柱纯化.应用重组gp210融合蛋白建立间接ELISA,检测PBC患者血清中的抗gp210抗体.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PET28a(+)-gp210重组质粒.经SDS-PAGE、Westem-blot鉴定,获得了具有免疫原性的重组gp210融合蛋白.经ELISA检测,PBC患者中抗gp210抗体的阳性率为40.5%,与疾病对照组及正常对照组比较有显著性差异(P＜0.05).PBC患者临床资料分析表明,抗gp210阳性患者中IgM浓度显著高于抗gp210阴性患者;经UDCA治疗后,28位PBC患者中,3例抗gp210抗体由阳性转为阴性,9例抗gp210抗体持续阳性,1例抗gp210抗体由阴性转为阳性,16例抗gp210抗体持续阴性;其他临床症状与抗gp210抗体无显著相关.结论 应用重组gp210融合蛋白建立ELISA检测自身抗体,对PBC诊断具有较好的特异性,为PBC的临床诊断和病情监测提供了有力依据.
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自身抗原OGDC-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定
目的基因工程重组表达2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2(OGDC-E2)融合蛋白.方法用PCR方法扩增得到OGDC-E2的基因片段,插入表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-OGDC-E2,测序正确后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.结果获得OGDC-E2融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子质量与预期大小一致;经免疫学鉴定,重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的免疫原性.结论基因重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的实验诊断.
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重组融合蛋白柱层析病毒去除工艺的验证
目的 对重组融合蛋白柱层析病毒去除工艺进行验证.方法 以脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)为指示病毒,考察重组融合蛋白生产中柱层析步骤(染料亲和层析、阴离子交换层析和凝胶层析)去除病毒的效果.结果 经染料亲和层析、阴离子交换层析、凝胶层析后,EMCV滴度降低平均值分别为1.968、1.984和4.391 log10,3步柱层析共去除EMCV 8.343 log10;PPV滴度降低平均值分别为2.135、3.936和2.048 log10,3步柱层析共去除PPV 8.119 log10.结论 染料亲和层析、阴离子交换层析、凝胶层析3步柱层析联合处理,在生产过程中可有效去除指示病毒(EMCV和PPV)及其所代表的相关病毒.
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人黑色素瘤相关抗原Restin的克隆和表达
目的:通过对原核表达载体、表达条件和宿主菌的优化,利用原核表达系统有效表达可溶性的人Restin融合蛋白.方法:应用PCR方法扩增获得Restin编码区,克隆入原核表达载体pET44a(+),分别转化E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3),不同的IPTG浓度诱导表达Restin重组融合蛋白,SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物.结果:成功构建了重组载体pET44a(+)-Restin,并在E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3)中获得了可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的8.9%.结论:可溶性Restin融合蛋白的获得为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础.
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猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在大肠埃希菌ArcticExpress(DE3)中的表达、纯化和兔抗血清的制备
目的 构建猪带绦虫pGEX-TSO45W-4B-TSOL18重组质粒,纯化重组融合蛋白及制备兔抗重组蛋白血清.方法 用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接TSO45W-4B和TSOL18编码基因,通过全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因.将融合基因定向克隆到pGEX-1 λT表达载体上,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18,再用重组质粒转化大肠埃希菌(E.col) ArcticExpress (DE3).用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达情况,亲和层析纯化获得重组融合蛋白.用纯化的重组蛋白按0.5 mg/只与弗氏完全佐剂(CFA)混合,于兔后腿肌肉及背部皮下多点免疫注射;2周后再用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂(IFA)混合加强免疫,此后每隔10 d按第2次免疫法重复加强免疫,第4次免疫后6d,采集兔心脏血并分离血清,立即纯化及制备抗血清.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗血清的效价,采用蛋白印迹(Western blot)法鉴定抗血清的特异性.结果 全基因合成的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段长度为789 bp.酶切证实pGEX-TSO45W-4B-TSOL18重组质粒成功构建,测序结果获得的基因片段大小为789 bp,与预期大小相符.SDS-PAGE分析和亲和层析后显示,重组质粒在转化E.col ArcticExpress(DE3)后,获得了相对分子质量约为55×103的重组融合蛋白,纯度为85％.ELISA测定兔抗血清的效价为1∶512 000,Western blot证实抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应,在相对分子质量约为55×103处出现1条与预期大小一致的特异性条带.结论 成功地构建猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18及制备了高纯度的TSO45W-4B-TSOL18重组融合蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清.
