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抗独特型抗体的研究现状
在目前的免疫技术中,抗独特型抗体的研制是一种可行的免疫原替代技术.抗体的独特型是指存在于抗体分子上的独特型抗原决定簇的总称,它反映抗体分子的多样性.独特型抗体(Ab1)是指具有独特型抗原决定簇的抗体,而抗独特型抗体(Ab2)是指针对抗体的独特位产生的抗体.该技术首次出现于1974年,Jerne在Burnet的细胞克隆选择学说的基础上提出了著名的免疫网络学说,在Jerne提出免疫网络学说的基础上,Nisonoff和Lamoyi明确指出,抗独特型抗体实质上能替代抗原诱导特异性免疫应答,是近年来生物技术研究的一个热点,尤其作为人、畜疾病防治的一种新制剂,已展示出十分诱人的前景[1].
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抗猪带绦虫六钩蚴独特型抗体疫苗对猪体免疫保护作用的研究
目的本研究在证实猪带绦虫六钩蚴抗原具有很高的免疫保护性的基础上,探讨六钩蚴抗独特型抗体作为六钩蚴抗原替代物对猪体的保护作用,为研制猪体囊虫疫苗提供理论基础. 方法用六钩蚴粗制抗原免疫家兔,制备兔抗六钩蚴抗体(Ab1),再用Ab1免疫昆明小白鼠,制备抗独特型抗体(Ab2),免疫猪体,以3节猪带绦虫孕卵节片攻击感染,90 d后剖杀,观察感染情况. 结果 5头试验猪只有1头在膈肌发现1个囊虫,而2头阳性对照猪均被感染,各检查部位囊虫数平均为4.5个/100 g和3.2个/100 g. 结论抗猪带绦虫六钩蚴独特性抗体Ab2对猪体有较强的免疫保护作用.
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丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
目的:制备抗丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2(E2)的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗-Id scFv),为研制HCV E2的抗-Id scFv疫苗奠定基础.方法:采用噬菌体表面展示技术,将抗HCV E2单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出53个克隆,利用酶联免疫黏附法、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCV E2单克隆抗体结合活性较强的抗独特型抗体单链可变区片段(抗-IdscFv)的阳性克隆,并对HCV E2特异性抗-Id scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了12倍.用酶联免疫黏附实验(ELISA)方法测定第五轮筛选后上清液中含有的抗-Id scFv与HCV E2单克隆抗体结合活性.其中有18株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(E11 A450 nm 0.928,E14 A450 nm 1.152,E17 A450 nm 1.136,E28 A450 nm 1.163,E53 A450 nm0.965).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有5株交叉反应较弱(E11 A450nm 0.044,E14 A450 nm 0.062,E17 A450 nm 0.166,E28 A450nm 0.012,E53 A450 nm 0.069),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(E28)阳性克隆提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768bp.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得单抗HCV E2的抗-Id scFv,本实验结果为开展用抗-Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.
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6B11ScFv-mHSP70融合蛋白诱导抗卵巢癌免疫应答的体外实验研究
目的 既往研究证实,6B11抗独特型单链抗体(6B11ScFv)具有模拟卵巢癌相关抗原OC166-9的作用.本文研究6B11ScFv与小鼠热休克蛋白70(mHSP70)构建而成的融合蛋白(6B11ScFv-mHSP70)在体外抗卵巢癌免疫应答,探讨其作为卵巢癌疫苗的可能性.方法 以大肠杆菌表达6B11ScFv-mHSP70融合蛋白,经变性复性后纯度达95%.采用ELISA检测其免疫学活性.采集HLA-A2阳性的女性健康志愿者的外周血单个核细胞,用6B11ScFv-mHSP70刺激并培养.采用CCK-8法、LDH释放法分别观察淋巴细胞增殖情况和对卵巢癌细胞系的细胞毒作用,流式细胞术检测6B11ScFv-mHSP70刺激前后淋巴细胞表型的改变.结果 6B11ScFv-mHSP70具有特异性结合卵巢癌单抗COC166-9及抗小鼠-HSP70抗体的双重免疫学活性;可以刺激人外周血淋巴细胞的增殖;并对HLA-A2阳性、OC166-9表达阳性的卵巢癌细胞系有细胞毒作用;经6B11ScFv-mHSP70刺激后,实验组的淋巴细胞表型与未经蛋白刺激的对照组相比:CD4+T细胞明显增加,CD8+T细胞略有增加.CD4+/CD8+的比率明显增加,CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比率明显下降,差异有统计学意义.结论 6B11ScFv-mHSP70融合蛋白在体外可诱导特异性抗卵巢癌的细胞免疫反应,有可能作为抗独特型疫苗用于卵巢癌的主动免疫.
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卵巢癌单克隆抗-抗独特型抗体32F2的制备及其特性研究
目的 6B11是可模拟卵巢癌抗原的鼠源性抗独特型单克隆抗体,为了深人探讨其作为肿瘤疫苗的主动免疫机制,制备抗6B11的IgG型抗-抗独特型单克隆抗体并对其特性进行研究.方法 以卵巢癌抗独特型抗体6B11作为免疫原,与载体钥孔槭血兰蛋白(KLH)偶联并辅以福氏佐剂,多次免疫同系Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合;采用酶联免疫吸附实验(ELlSA)筛选杂交瘤细胞,经克隆化后建立稳定分泌鼠源性抗-抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株.秋水仙素法确认杂交瘤细胞染色体数目及形态,ELISA法鉴定抗体类型,采用非竞争酶免疫结合实验测定抗体亲和力,ELlSA、免疫组织化学方法检测抗-抗独特型单克隆抗体特异性结合抗原的性质.结果 制备出一株能稳定分泌抗-抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为32F2.其染色体数目平均为103条,并有端着丝点和亚中部着丝点染色体,符合小鼠杂交瘤细胞特点.抗体类型为IgGl型,抗体亲和力约为2.311 9×107L/mol,能够竞争抑制卵巢癌单克隆抗体COC166-9与原始抗原OC166-9的结合,免疫组织化学染色证实32F2鼠腹水与84.6%卵巢浆液性乳头状囊腺癌呈阳性染色,与COC166-9类似,表明32F2可与OC166-9抗原产生特异性结合.结论 通过杂交瘤技术建立了分泌IgG1亚型的卵巢癌抗-抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株.对抗体的初步研究显示其能特异性结合初始抗原OC166-9,并能竞争抑制COC166-9与OC166-9的结合,属Ab1样Ab3,间接证实6B11为抗原内影像型抗体,具有模拟抗原作用.32F2的制备成功为进一步研究卵巢癌抗独特型疫苗6B11的作用机制打下了基础,并且该抗体具有潜在的临床治疗卵巢癌的价值.
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模拟卵巢癌抗原的人源化抗独特型抗体的构建与表达
目的对模拟人卵巢癌抗原的鼠源性抗独特型单链抗体6B11scFv进行人源化改造和表达.方法采用重叠PCR和基因工程技术,将6B11scFv基因与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合,构建人源化抗独特型抗体6B11VHVLhC基因.用IPTG诱导大肠杆菌进行表达,并采用酶切法、DNA测序、SDS-PAGE电泳、ELISA和免疫印迹技术等进行鉴定.结果酶切和DNA测序表明插入片段正确;SDS-PAGE凝胶电泳显示融合蛋白分子量50 000 Da处有一诱导蛋白带;而不连续非变性凝胶电泳表达产物分子量为100000 Da;ELISA和免疫印迹结果显示,表达出的6B11VHVLhC人源化抗体仍具有6B11scFv和人IgG1CH3的活性.结论已成功构建并表达出双价的可模拟卵巢癌抗原的人源化抗独特型抗体.
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卵巢癌抗独特型单链抗体3D5ScFv/鼠GM-CSF融合蛋白(3D5mGM)的构建、表达
目的构建卵巢癌抗独特型单链抗体3D5ScFv 和鼠GM-CSF 融合蛋白(3D5mGM ),并对其活性进行鉴定.方法用DNA 重组技术,将3D5ScFv基因与鼠粒细胞集落刺激因子(mGM-CSF)基因融合,插入到pET30a(+)中,构建重组质粒pET30a-3D5mGM,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导,以包涵体形式获高效表达,超声破碎细菌细胞获得包涵体,用8 mol/L尿素溶解包涵体后直接稀释复性,SDS-PAGE分析蛋白纯度,ELISA和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性.结果复性蛋白纯度达90% 以上.表达的融合蛋白能够与OC125单抗结合,也能与大鼠抗小鼠GM-CSF 单抗特异结合.并能刺激mGM-CSF 依赖株NFS-60细胞增殖.结论表达的融合蛋白3D5mGM保留了两种蛋白的活性,为进一步研究该融合蛋白治疗卵巢癌的可能性提供了基础.
关键词： 卵巢癌 重组融合蛋白 抗独特型抗体 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 -
卵巢癌抗独特型抗体6B11特异性表位肽在体内诱导抗原特异性体液免疫应答
目的探讨卵巢癌抗独特型抗体6B11表位多肽与诱导免疫应答之间的关系.方法采用化学合成的方法,合成抗独特型抗体6B11轻重链可变区的六条CDR区,分别以三种不同浓度免疫BALB/c小鼠.采用ELISA的方法检测免疫鼠血清,进行体内免疫学功能研究.结果 6B11抗独特型抗体的六条CDR肽分别加入佐剂免疫小鼠后,其中有两条肽可以诱导出Ab3,分别为重链的CDR2区和轻链的CDR2区.结论这两条肽作为后选肽有可能是6B11抗独特型抗体特异性的CTL表位.
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6B11抗独特型微抗体负载树突状细胞对卵巢癌细胞系细胞杀伤作用的体外研究
目的用6B11抗独特型微抗体体外负载树突状细胞(DC),以期诱导出抗原特异性的抗肿瘤免疫反应.方法分离培养HLA-A2+健康人外周血树突状细胞,培养过程中用6B11 微抗体负载,无关抗原F(ab)'2负载及未负载组为对照.光镜、电镜下观察树突的形态;流式细胞仪检测DC表面分子表达;3H-TdR掺入法测DC刺激自体T细胞增殖;51Cr 6 h释放试验测激活的T细胞对卵巢癌细胞系的杀伤.结果培养的树突细胞有典型形态,CD80、CD86、HLA-DR等表面分子呈高表达(分别为65%、86.2%、93.7%); 6B11 微抗体负载的DC不仅能刺激自体T细胞的增殖,而且其诱导的CTL细胞对HLA-A2+、OC166-9+卵巢癌细胞系HOC1A有特异性的杀伤,结论 6B11抗独特型微抗体模拟卵巢癌抗原OC166-9负载树突状细胞在体外可以诱导出抗原特异性的细胞毒T细胞,为进一步研究6B11微抗体对卵巢癌免疫治疗作用提供了依据.
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小细胞肺癌抗独特型疫苗功能的试验研究
目的探讨小细胞肺癌(SCLC)抗独特型抗体3F6和其单链抗体(3F6 ScFv)诱导体液和细胞免疫应答的能力,以证明其作为抗SCLC疫苗的可行性.方法 3F6和3F6 ScFv(Ab2)免疫BALB/c小鼠获得抗血清,以ELISA和Western blot方法分别检测抗血清中Ab3结合SCLC细胞膜表面特异抗原(NCI-H128抗原)的能力,用竞争Western blot检测Ab3与2F7竞争结合NCI-H128抗原的能力.以迟发型超敏反应(DTH反应)和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测3F6及3F6 ScFv诱发细胞免疫应答的潜能.结果 ELISA和Western blot方法均证明,3F6和3F6 ScFv免疫同系小鼠所产生的Ab3能特异的与NCI-H128抗原相结合,与对照血清相比,差异有统计学意义(P<0.001),且有很强的与2F7(Ab1)竞争结合靶抗原的能力.在DTH反应中,3F6和3F6 ScFv所致小鼠足垫肿胀的程度均明显高于对照组 (P<0.001).小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应试验证明,用3F6和3F6 ScFv免疫的小鼠脾脏淋巴细胞对靶细胞的再次刺激有明显的增殖反应,与阴性肿瘤细胞对照组和阴性抗体对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论抗独特型抗体3F6和3F6 ScFv均有模拟SCLC细胞膜表面特异抗原的能力,成功诱导了相应的体液和细胞免疫应答,可作为抗SCLC疫苗进行深入研究.
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丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
为探索新型治疗方法,制备抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体(抗-Id scFv),采用噬菌体表面展示技术,将抗HCV NS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选82个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与HCV NS4A单克隆抗体结合活性较强的抗-Id scFv阳性克隆,并对HCV NS4A特异性抗-Id scFv的编码基因进行序列测定分析.结果,经过筛选82个克隆中有40株克隆ELISA的吸光度(A450nm)值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应,确定其中有7株交叉反应较弱,结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株阳性克隆.提取质粒,进行DNA序列测定,DNA为789bp.本实验结果提示,用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCVNS4A的抗-Id scFv,为开展用抗-Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.
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丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体(抗-Id scFv),采用噬菌体表面展示技术,将抗-HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落.随机挑选60个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定.获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗-Id scFv阳性克隆,并对HCV核心蛋白特异性抗-Id scFv的编码序列进行测定分析.结果经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,在随机挑选的60个克隆中,有20株克隆ELISA的吸光度(A450nm)值较高,这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应后,确定了其中有6株交叉反应较弱,结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株阳性克隆,提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768 bp.本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗-HCV核心蛋白的抗-Id scFv,为开展用抗-Id scFv防治慢性丙型肝炎的研究创造了条件.
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抗CD22单抗血药浓度的ELISA法的建立
目的:进行重组人CD22单抗(SM03)临床药动学研究,建立血药浓度测定的酶联免疫分析(ELISA)方法.方法:构建并表达SM03抗独特型抗体(LRID03)和CD22抗原,分别建立夹心ELISA(S-ELISA)和竞争ELISA(C-ELISA)分析法,并对2种方法测定血药浓度的适用性进行比较和验证.结果:S-ELISA和C-ELISA都具有良好特异性、准确度和精密度.结论:S-ELISA方法的灵敏度更高并且干扰因素少,因而更适于临床药动学研究.
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湖南省2000年医药卫生科研进展
一、基础医学研究1.鼻咽癌抗独特型抗体的制备及主动免疫机制研究:中南大学湘雅医学院研究人员根据Jerne免疫网络理论,首先用小鼠杂交瘤单克隆抗体技术,以鼻咽癌细胞株为免疫原,制备了一系列抗鼻咽癌的单抗(Ab1).再用与钥孔()血兰素的交联物抗体为免疫原和小鼠杂交瘤技术制备了作用与Ab1的V区的抗独特型抗体(Ab2),并证实其中某些Ab2具有鼻咽癌相关抗原的内影像(Ab2β),以此抗体(Ab2)免疫小鼠,诱导与鼻咽癌细胞发生特异性结合的抗血清即抗独特型抗体(Ab3)和和特异性迟发型超敏反应(DTH),提示其具有抗肿瘤作用.Ab3与相应Ab1竞争结合鼻咽癌细胞上的靶抗原,说明Ab3与Ab1具有相同配位.这些结果证明Ab2型抗原能替代肿瘤抗原,并在小鼠体内诱导特异性细胞免疫和体液免疫.将所获得Ab2用氢氧化铝凝胶沉淀法制剂后对晚期鼻咽癌病人进行免疫,能明显提高特异性抗肿瘤抗体的含量.病人接受免疫后,肿瘤坏死因子、干扰素和白介素-2的血清含量升高.这些结果说明用抗独特型抗体进行主动免疫可能增强肿瘤患者的抗肿瘤免疫功能.
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日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30诱导保护性免疫的研究
目的 观察日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30主动免疫小鼠诱导的保护性免疫力.方法 选择L16(4×212)正交设计,8周龄昆明种小鼠随机分为16个实验组和2个对照组.对照组腹腔接种SP2/0腹水.所有小鼠在腹部皮肤感染100±2条日本血吸虫尾蚴,尾蚴攻击后第30天处死小鼠,行左心室-门静脉灌注收集成虫,计算减虫率.结果 根据不同的免疫方案,NP30主动免疫可产生22.36%-50.46%的减虫率,并确定了优免疫方案.结论 提示NP30主动免疫对尾蚴攻击可产生一定的保护力,具有血吸虫疫苗候选分子的潜能.
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噬菌体抗体库技术筛选结肠癌单抗MC3的抗独特型抗体
目的：获得结肠癌单抗MC3的噬菌体呈现型抗独特型抗体(anti-Id)。方法：分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA，经RT-PCR分别扩增抗体VH和VLDNA，进而连接形成ScFv DNA。将ScFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1，经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MC3对文库进行四轮筛选后，随机挑取克隆经ELISA筛选呈现anti-Id ScFv的噬菌体单克隆。结果：VH、VL和ScFv DNA分别约为340、320和750 bp。抗体ScFv文库经四轮筛选后，在随机筛检的50个克隆中得到15个呈现anti-Id ScFv的噬菌体单克隆。结论：用噬菌体抗体库技术成功地获得了单抗MC3的anti-Id ScFv，从而为进行结肠癌重组anti-Id疫苗作用的研究提供了候选分子。
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抗人膀胱癌抗独特型抗体佐剂疫苗的动物实验研究
目的探讨抗独特型抗体佐剂疫苗对膀胱癌的免疫治疗作用.方法用抗人膀胱癌抗独特型抗体佐剂疫苗(Ab2+SAF)免疫BALB/C小鼠,即实验组;对照组用生理盐水,方法同实验组.免疫3次后,于末次免疫后1w,将新鲜人膀胱移行细胞癌组织移植于小鼠肾包膜下,分别于移植后第2、4、6、8和10天处死小鼠,取血清进行抗抗独特型抗体(Ab3)分析.移植瘤行组织学检查,观察宿主淋巴细胞浸润情况及瘤细胞可见率.结果实验组小鼠肾脏包膜下人膀胱癌细胞系很快受到排斥,在移植后第6天,淋巴细胞浸润即达高峰,而对照组在第10天才达高峰;瘤细胞可见率,在移植后第6天即明显降低,而对照组呈逐渐下降.实验组Ab3为阳性,而对照组阴性.结论 Ab2作为抗原免疫小鼠后,通过诱发或激活对人膀胱癌特异性体液和细胞免疫反应,排斥瘤细胞并抑制其生长.
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抗人膀胱癌抗独特型抗体佐剂疫苗的临床初步应用
目的研究抗人膀胱癌佐剂疫苗对人体的主动免疫治疗作用,为扩大临床应用提供理论依据.方法用抗人膀胱癌抗独特型抗体主动免疫治疗膀胱癌病人,同时用生理盐水注射作为对照组,检测血清中人抗鼠抗体的产生情况,并检测治疗前后各项体液免疫指标及NK细胞活性变化.结果与对照组相比,治疗组病人的免疫指标上升.结论抗人膀胱癌佐剂疫苗有增强免疫力的作用,有望成为膀胱癌治疗的一种新的有效手段.
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抗人膀胱癌抗独特型抗体诱导特异性迟发过敏反应的研究
目的研究对抗人膀胱癌抗独特型抗体(BC2)诱导的特异性迟发过敏反应(DTH).方法经过BC2免疫的小鼠,用膀胱癌细胞系进行脚掌注射攻击后,测定脚掌水肿厚度判定DTH反应强度,并进行病理学检查.结果BC2诱导的DTH平均水肿厚度为0.95mm,与膀胱癌组织抗原组比较差异无显著意义(P＞0.05);免疫鼠对胃癌细胞攻击呈阴性反应;BC2诱导的病变内可见大量炎性细胞,呈弥漫性浸润.结论BC2具有抗原模拟作用,可诱导特异性的DTH反应,可能成为膀胱癌防治的新途径.
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玉米赤霉烯酮抗独特型单抗的制备及特异性分析
目的 制备并鉴定玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)抗独特型单抗Ab2β-1D5.方法 将ZEN单抗1G4与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后,以ZEN单抗Fab片段作为包被抗原,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞.经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,制备腹水型单抗,并经Protein G亲和层析柱进行纯化.间接ELISA法检测ZEN抗独特型单抗的抗体效价及特异性;间接竞争ELISA法检测ZEN抗独特型单抗类型、灵敏度及其与ZEN毒素间的相关性.结果 共获得6株稳定分泌ZEN抗独特型单抗的杂交瘤细胞株,腹水型抗体效价为1∶1.2×105～ 1∶2.0×105;6株单抗均为β型抗独特型抗体(Ab2β),其中Ab2β-1D5抗体灵敏度高,对ZEN的IC50值达10.09 ng/ml,其与ZEN毒素呈线性相关(r=0.990);ZEN抗独特型单抗与莱克多巴胺、重金属铅、铬及虾过敏原单抗均无交叉反应,特异性良好.结论 已成功制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗,该抗体与ZEN间存在“内影像”关系,可以替代ZEN毒素标准品,用于建立ZEN的无毒免疫学检测技术.
