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肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体的构建
目的:构建肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体,为进一步表达、纯化SSX1蛋白,制备肝癌疫苗奠定基础.方法:行RT-PCR从肝细胞癌组织中扩增CT基因SSX1,将SSX1和pMAL-C2质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,然后连接并转化大肠杆菌DH5a,后对重组质粒进行蓝白斑筛选,酶切和测序鉴定.结果:重组表达质粒经鉴定准确无误.结论:成功构建了肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体.
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半定量RT-PCR检测肺癌组织S100C的表达及其原核表达载体的构建和鉴定
目的 分析S100C基因在肺癌组织中的表迭情况,并构建S100C蛋白的原核表达栽体.方法 以β-actin为内参,运用半定量RT-PCR技术检测26例肺癌组织和配对癌旁组织S100C基因mRNA的表达水平;运用RT-PCR技术克隆S100C基因的cDNA全长片段,与PET30a连接构建原核表达栽体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,进行阳性克隆筛选鉴定.结果 肺癌组织中S100C mRNA表达水平低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05).成功构建了S100C原核表达载体,序列同源性达100%.结论 S100C基因表达下调在肺癌的发生中可能起重要作用;成功构建了S100C原核表达裁体.
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一种适用于短肽制备抗体的亲和纯化方法
在免疫组织化学检测过程中,抗体的纯度对于减少检测背景和假阳性起着关键作用.为了获得高纯度的抗体,亲和纯化的方法被广泛应用[1-3].为了研究某种特定基因编码产物的时空表达模式,可将基因的序列克隆到原核表达载体上,获得目的基因的原核表达蛋白,用于制备抗体进行免疫组化研究.
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白纹伊蚊AL-100 30 ku蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建
目的 克隆白纹伊蚊主要过敏原AL-100 30 ku蛋白基因,并构建其原核表达载体. 方法 RT-PCR克隆白纹伊蚊主要过敏原AL-100 30 ku的全长基因,设计简并引物,扩增白蚊伊蚊30 ku的完整开放阅读框,与Pet-28a载体连接,构建原核表达载体. 结果 成功克隆白纹伊蚊主要过敏原30 ku基因并构建其原核表达载体.该基因含有长度为816 bp的开放阅读框,编码271个氨基酸.该蛋白质的分子质量单位为28.33 ku,等电点为4.04,编码序列与数据库中已知的白纹伊蚊30 ku基因的同源性为99%. 结论 成功克隆了白蚊伊蚊主要过敏原30 ku基因并构建了原核表达载体,为白纹伊蚊主要过敏原30 ku蛋白的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础.
关键词: 白纹伊蚊 过敏原 AL-100 30 ku 克隆 原核表达载体 -
水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的表达及免疫性鉴定
水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白中糖蛋白E(gE)的免疫活性强,本试验成功构建了VZV糖蛋白E的原核表达载体,所表达的重组蛋白可以有效激活小鼠的免疫反应.
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重组SARS-CoV核衣壳蛋白的表达及免疫原性研究
我们利用全基因合成方式及原核表达系统获得大量纯化的N蛋白,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究提供新的思路.由于长片段目的基因在原核系统中不易表达,根据抗原性预测分析将N蛋白分成两部分表达,第一部分为N-1蛋白1~549 bp,第二部分为N-2蛋白496~1269 bp,上下游分别设计BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点,并将基因中包含这两种酶切位点的基因以无义读码方式进行突变,通过全基因合成分别将两段基因克隆至原核表达载体pET32a(+),由上海生工生物工程技术公司完成,测序证实序列无误.
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ASGPR单链抗体-蜂毒肽融合蛋白的构建及其溶红细胞效应
去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是一种异源低聚物的内吞受体,定位于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面,在介导肝脏疾病靶向治疗方面具有潜在应用价值.我们在获得抗ASGPR单链抗体C1的基础上[1],将C1作为靶向分子,与编码蜂毒肽(melittin)的寡核苷酸基因连接,并克隆至原核表达载体,在大肠杆菌中融合表达,并探讨了融合蛋白(C1M)的体外溶红细胞效应.
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绿色荧光蛋白干扰素-α2b融合基因的构建与表达
干扰素-α2b(IFN-α2b)作为治疗慢性乙肝、丙肝的首选药物,已成为医药生物技术产业的重要产品.目前研究IFN与其受体的作用关系多采用酶联免疫吸附法,间接的分析IFN或测定其受体被封闭的情况,但在细胞水平直观实时的检测IFN与其受体相互作用关系的研究报道甚少.本研究利用来源于维多利亚水母的绿色荧光蛋白(GFP)作为分子标签,构建含有GFP与IFN-α2b融合基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达融合蛋白.
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人类抗凋亡基因survivin的克隆及其原核表达
目的:克隆人类抗凋亡基因survivin(SVV),实现SVV基因在大肠杆菌中的高效表达.方法:提取胃癌细胞系SGC-7901总RNA,RT-PCR扩增人SVV全长cDNA,克隆于载体pGEM-T,酶切、测序鉴定.将人类SVV基因全长cDNA克隆入原核表达载体pRSET,实现该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达.结果:得到人SVV基因全长cDNA,经测序与SVV基因的已知序列相同,原核表达所获融合蛋白经SDS-PAGE电泳与已知SVV基因的蛋白质表达产物大小相近.结论:克隆出人SVV基因的全长cDNA,并克隆入原核表达载体pRSET,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.
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抗肝癌人源化Diabody在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定
目的:构建人源化抗肝癌双价抗体,并实现其在大肠杆菌中的可洛性表达.方法:缩短人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的连接肽为5肽,构建(hscFv25)2基因,克隆入原核表达载体后,转化入大肠杆菌表达,并纯化目的蛋白,细胞ELISA、免疫组织化学法检测其生物活性.结果:目的基因在大肠杆菌中得到了可洛性表达,纯化蛋白的相对亲和力比亲本抗体提高了10倍左右,对肝癌组织切片的免疫组织化学染色呈强阳性,阳性率为75%.结论:成功制备了人源化抗肝癌双价抗体,该抗体具有较高的亲和力,为进一步的临床研究奠定了基础.
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HCV包膜糖蛋白E2基因的克隆、蛋白表达及纯化
目的:获得大量重组HCVE2蛋白,为研究E 2蛋白的功能及制备其抗体奠定基础.方法:利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp(384-661 aa)的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a(+)上,得到重组质粒pET32a-HCVE2,转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和western blot检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化融合蛋白.结果:经IPTG诱导后,可见分子量约55 000的融合蛋白表达;表达的蛋白主要以包涵体形式存在;经Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化的融合蛋白与抗His抗体及HCV阳性血清具有良好的反应原性.结论:HCV E2基因的克隆、表达及其融合蛋白的纯化为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因2基因组DNA结构分析及其不同剪切体的克隆化研究
目的:HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2及其不同剪接体基因序列的确立、克隆化研究.方法:依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得,提取HepG2细胞的总RNA,进行反转录(RT-PCR),扩增产物与原核表达载体连接,进行测序鉴定.结果:经测序鉴定成功获得新基因的编码序列,并意外发现了NS5ATP2的不同剪接体,对NS5ATP2基因组进行分析,获得剪接体的编码序列,并成功进行了克隆化研究.结论:利用分子生物信息学技术,发现并鉴定了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2(615)及其可变剪接体NS5ATP2(216),为研究新基因的生物学功能及丙肝发病机制提供新的依据.
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HCV干扰素敏感决定区"基因盒"的构建,体外表达及功能探讨
目的:构建对干扰素敏感和不敏感的丙型肝炎患者的干扰素敏感决定区(ISDR)基因;在体外表达含ISDR的丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白,探讨表达的NS5A蛋白是否通过ISDR与干扰素诱导的RNA蛋白激酶(PKR)结合来影响干扰素的抗HCV作用.方法:采用合成寡核苷酸,PCR,分子克隆等方法构建ISDR基因"盒",包括3个对干扰素敏感的丙肝患者ISDR及1个对干扰素耐受的丙肝患者ISDR,将含不同ISDR的NS5A基因克隆进原核表达载体PRSET,转染BL21(DE3)细胞后由IPTG诱导表达,获得蛋白过柱纯化及透析去掉高盐后,与经体外转录和翻译系统获得的PKR进行蛋白结合试验.结果:经测序证实获得4个不同ISDR基因,包括1个对干扰素不敏感基因和3个对干扰素敏感基因;体外表达的含ISDR的NS5A蛋白约58 000,体外试验初步证实,无论对干扰素敏感或不敏感的ISDR均可与PKR结合.结论:体外构建的含不同ISDR的NS5A蛋白能在原核细胞系统中获得较好表达;研究显示,ISDR影响干扰素抗病毒作用可能不是由ISDR与PKR直接结合导致的.
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幽门螺杆菌HspA与大肠杆菌LTB基因融合及表达
目的:构建和表达人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A亚单位(HspA)与E. coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.方法:采用PCR技术从人H pylori染色体DNA中扩增出354 bp的HspA基因,并克隆至pPLtB载体中与1tB基因融合,形成含有1tB-H spA融合基因的原核表达载体pPLH,并在工程菌E.coli JM109中诱导表达.结果:经序列分析,1tB-HspA融合基因由684个碱基组成,为编码228个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Westernblotting检测发现,融合蛋白的Mr 25×103,并与Hpylori感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示融合蛋白中存在LTB组分,并保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论:LTB-HspA融合蛋白有可能用于Hpylori基因工程疫苗的研究.
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幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB的表达和免疫学活性
目的:构建表达幽门螺杆菌(H pylori)融合蛋白HspA-UreB的重组表达质粒,并研究其免疫学活性.方法:定向克隆方法将郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因融合连接入原核表达载体pET30(a),构建重组表达质粒pET-HU27.该质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析融合蛋白HspA-UreB表达情况.Ni2+柱亲和层析纯化融合蛋白,与小鼠免疫血清进行Western blot分析,检测融合蛋白的免疫反应性.结果:特异PCR法与质粒酶切鉴定证实重组表达质粒pETHU27构建成功.SDS-PAGE分析显示在82.1 KDa处出现特异蛋白带,占菌体总蛋白的21%,亲和层析法获得纯度为91%的纯化融合蛋白,经免疫小鼠制备的血清可以识别该融合蛋白.结论:成功构建表达H pylori HspA-UreB融合蛋白的重组表达质粒,表达的融合蛋白具有良好的免疫反应性.
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幽门螺杆菌vacA毒性片段与hpaA融合基因的原核表达
目的:构建幽门螺杆菌vacA毒性片段(v)与hpaA融合基因的原核表达载体,并诱导表达,为制备具有治疗与预防作用的疫苗奠定基础.方法:通过设计带有编码IL-3N端12个氨基酸引物,用PCR技术从pQE30-V质粒扩增出有接头的v基因,克隆至质粒pTrc99A-HpaA中与hpaA融合.将融合基因插入原核表达载体pQE30,再将pQE30-V-HpaA转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,Western blotting鉴定其抗原性.结果:融合蛋白的相对分子量约为65 000,能与幽门螺杆菌感染的人阳性血清发生抗原抗体反应.结论:重组表达质粒pQE30-V-HpaA表达成功,为进一步研究其免疫学活性及制备疫苗提供了材料.
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铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达
目的:克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因,构建其原核表达载体并鉴定其表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因;采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒,并经酶切和序列测定后,获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中,以构建pET28b-OprH重组表达质粒,并在表达宿主菌E?Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功;重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物,为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。
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抗乙酰胆碱受体单链抗体原核表达载体及表达菌株的构建
目的 将含有抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体基因的载体重新构建并建立表达菌株.方法 采用聚合酶链反应(PCR)从质粒pHEN1中克隆单链抗体scFv1929#全长基因, 将PCR产物再定向克隆至载体pET32a(+)的多克隆位点中, 并转入大肠杆菌BL21(D E3)plysS以构建表达菌株.结果 PCR产物约730 bp, 与预期一致, 重组阳性克隆菌株JM109+pET32a(+)-scFv1929#经菌液PCR可见730 bp处有特异性条带, 所提取质粒pET32a(+)-scFv1929#经PCR及酶切鉴定正确, 经测序后证实scFv1929#的核苷酸序列正确并正确地插入载体pET32a(+)的读码框内.将新构建载体转化大肠杆菌BL21(D E3)plysS以获得表达菌株. 结论 已成功地重新构建含有抗AChR单链抗体基因的载体并建立大肠杆菌表达菌株BL21(D E3)plysS+pET32a(+)-scFv1929#, 为今后表达抗AChR单链抗体scFv1929#融合蛋白打下基础.
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重组ORF50和ORF73融合抗原检测HHV-8病毒的探讨
目的 构建高效表达重组HHV-8病毒ORF50和ORF73融合蛋白原核表达载体,为诊断试剂国产化提供抗原.方法 设计并合成扩增ORF50和ORF73基因引物,以HHV-8感染血清DNA为模板,扩增出目的基因,连接基因片段,IPTG诱导表达重组融合蛋白.包被ELISA酶标板后对无偿献血人员血清进行检测,以市售HHV-8 ELISA试剂盒作对照.结果 与市售人疱疹病毒8型(HHV-8)ELISA试剂盒检测结果一致.结论 构建的原核表达载体可成功表达重组HHV-8病毒ORF50和ORF73融合抗原,该抗原可作为HHV-8感染检测的诊断抗原.
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重组人肝刺激因子非融合性蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化
目的 构建人肝刺激因子(human hepatic stimulator substance, hHSS)体外表达体系.方法 hHSS基因片段经PstⅠ和NdeⅠ消化后,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pT7-7载体,通过限制性酶切图谱分析及DNA测序反应鉴定hHSS基因.再将pT7-7-hHSS表达载体转化到BL21(DE3)中表达,通过超滤膜及阴离子交换柱纯化,获得目的蛋白.结果 表达产物在15000处有一明显条带,蛋白质肽指纹图谱分析与预期结果相符,经Western blot杂交印证,该15000蛋白质为hHSS.结论 通过构建pT7-7-hHSS原核表达体系,能正确高效地表达hHSS.