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彗星试验琼脂糖凝胶片保存方法研究
单细胞凝胶电泳技术检测环境因素致DNA损伤具有很高的灵敏性,已在国内外广泛用于职业危险因素引起的人群健康效应研究[1].国内多数现场与实验室距离较远,不具备荧光显微镜和图像存储设备,因此极大地限制了该技术的应用和推广.湿片在保存和运输方面困难较大,并且储存时间越长,DNA扩散的可能性就越大,结果越不稳定.找到一种稳定可靠的凝胶片保存方法,是将该方法推广应用于现场工作的迫切需求.国内有文献报道使用冷冻法保存凝胶片,但只能保存2~3天.国外已有研究使用甲醇脱水干燥法和乙醇脱水干燥法保存凝胶片,但尚没有系统的研究这两种脱水干燥法对琼脂糖凝胶片保存的影响[2, 3].本研究比较了乙醇和甲醇两种脱水干燥法对凝胶片保存的影响.
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一种新的神经干细胞抗贴壁培养方法
目的建立一种适合神经干细胞长期、大量体外培养的抗贴壁培养方法.方法制作琼脂糖抗贴壁培养瓶.实验组在琼脂糖抗贴壁培养瓶中培养神经干细胞,对照组在塑料培养瓶中培养.通过BrdU掺入法检测S期标记指数,噻唑蓝(MT)法检测两组细胞的增殖速度.传代培养3个月后,检测两组细胞的分化率,以及实验组细胞的分化潜能.结果实验组细胞在抗贴壁培养瓶中生长旺盛,S期标记指数和细胞增殖速度与对照组无显著性差异.培养3个月后,实验组神经干细胞的分化率为0.64%,对照组的分化率为32.05%,差异有高度显著性(P<0.01).实验组神经干细胞仍保持多分化潜能.结论琼脂糖抗贴壁培养法有利于神经于细胞持续增殖并保持未分化状态,适合神经干细胞在体外长期、大量扩增.
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检测鼠疫耶尔森菌LcrV抗体的上转换发光技术免疫层析试纸条的制备及应用
目的 本研究旨在制备一种用于检测鼠疫耶尔森菌LcrV抗体的上转换发光技术(UPT)免疫层析试纸条.方法 通过在试纸条分析膜检测带处固定抗原,质控带处固定抗体,结合垫位置半固定将上转换发光(UCP)颗粒标记的抗原,制备出了双抗原夹心模式的LcrV抗体检测UPT免疫层析试纸条.对制备成型后的试纸条进行了线性和灵敏度、准确性、及热稳定性4个方面的性能评价.后用此试纸条检测了40份自然感染鼠疫的兔和人血清标本,并将结果与ELISA检测结果进行了比较.结果 试纸灵敏度达0.97 mg/L,对所测17份猴血清标本的检测准确度为100%,在37℃的稳定存放期为10d.试纸对40份实际血清标本的检测结果与ELISA检测结果一致.结论 试纸有良好的灵敏度和线性检测能力.
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乙型流感病毒诱导HeLa细胞凋亡并伴随P16蛋白高效表达
近年的研究发现,甲、乙、丙型流感病毒感染宿主细胞时均可不同程度地诱导细胞凋亡,细胞凋亡是流感病毒杀死宿主细胞的主要方式.目前,甲型流感病毒诱导宿主细胞凋亡基因的调控及蛋白表达的研究结果已有报道,而乙、丙型流感病毒诱导细胞凋亡调节机制的结果尚未见报道.本文以乙型流感病毒(B/沪防93-1株)感染HeLa细胞,通过Hoechst 33258荧光染色、琼脂糖凝胶电泳分析检测细胞凋亡,并用免疫组化技术测定P16基因蛋白表达,以MPIAS-500计算机多媒体图象分析系统作蛋白表达图象分析,用阳性染色A值(吸光度,原为光密度OD值)表示P16蛋白表达量,从而探讨乙型流感病毒诱导细胞凋亡及P16蛋白在细胞凋亡过程中可能的调节作用.
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超声造影评价肝肿瘤血管形成的实验研究
目的应用二维超声观测兔VX2肝肿瘤生长及能量多普勒超声造影评价肿瘤血管形成.方法将VX2瘤组织块悬液0.3ml (约含107~108个瘤细胞/ml) 超声引导下注入15只新西兰白兔肝左叶,拔针前针道注入0.2 ml加热的琼脂糖,超声监测肿瘤生长.肿瘤生长至3周时,静脉团注超声造影剂,能量多普勒检测肿瘤血流信号,并通过图像分析技术定量测定肿瘤内彩色血管平均密度(MCVD).同时二维超声测定肿瘤大小与大体病理的测定结果进行相关性分析.采用免疫组化技术检测肿瘤内微血管密度(MVD).结果①二维超声肿瘤表现为等回声、低回声及略高回声,以等回声居多,周围可见声晕;②彩色多普勒和能量多普勒均可检出血流信号;③肿瘤与肝实质无明显边界,可见多个核分裂相;④超声与大体病理下测定肿瘤的大切面直径有相关关系;⑤能量多普勒超声造影测定肿瘤内MCVD与免疫组化测定的肿瘤内MVD之间有线性相关.结论超声能有效监测肿瘤生长.能量多普勒超声造影测定肿瘤内MCVD,可用于肿瘤内血管形成的评价.
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实时荧光定量聚合酶链反应技术开始用于临床常规基因诊断
聚合酶链反应(PCR)技术问世20年来,已经成为致病基因分析的重要手段.但是,多年来PCR一直很难直接用于临床疾病的常规诊断,其原因主要是PCR常规实验中存在的污染问题难以解决.常规PCR是将样品和实验反应剂加入小试管进行基因扩增,PCR后汲取反应产物行琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳,用PCR产物是否出现特异性条带来判断样本中有无疾病中发生变异的基因片段.尽管这种方法简便易行,但很难避免试管中的PCR产物飞散于实验室,污染下一次检测的结果,导致出现假阳性,影响疾病诊断.长期进行PCR的许多实验室都有污染造成试验失败的经验和教训.常规PCR的另一缺陷是PCR产物不易定量.
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HCV包膜糖蛋白E2基因的克隆、蛋白表达及纯化
目的:获得大量重组HCVE2蛋白,为研究E 2蛋白的功能及制备其抗体奠定基础.方法:利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp(384-661 aa)的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a(+)上,得到重组质粒pET32a-HCVE2,转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和western blot检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化融合蛋白.结果:经IPTG诱导后,可见分子量约55 000的融合蛋白表达;表达的蛋白主要以包涵体形式存在;经Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱纯化的融合蛋白与抗His抗体及HCV阳性血清具有良好的反应原性.结论:HCV E2基因的克隆、表达及其融合蛋白的纯化为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.
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多对型特异性引物巢式PCR检测湖南省乙肝病毒基因型
目的:采用多对型特异性引物,通过巢式PCR法检测湖南省乙肝患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况.方法:根据从前Sl基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物,并将其中8条内引物分成A、B两组,分别扩增A、B、C和D、E、F型HBV,然后将第2轮PCR的两组产物分别用3%琼脂糖进行电泳,根据PCR产物片断大小直接判定HBV基因型.与目前常用的PCR-RFLP法进行了比较,并做重复试验以证实该方法的可靠性和准确性.用此法检测了220例湖南籍慢性乙肝血清中的HBV基因型,以了解湖南人群的HBV基因型分布情况.结果:多对型特异性引物巢式PCR与PCR-RFLP法的检测结果完全一致,重现率(100%);湖南人群HBV基因分型结果为B型190例(86.4%)、C型30例(13.6%).结论:这种新的巢式PCR分型法能清晰直观地辨别HBV基因型,结果准确可靠.用此法证实了湖南人群的HBV优势基因型以B型为主,C型次之.
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教您用琼脂制作美食
一、琼脂是什么?琼脂,学名琼胶,又叫洋菜、冻粉,是从石花菜、江蓠等红藻植物中提取的多糖,以半乳糖为主要成分.制成的商品有的为条状,有的为粉状.琼脂色泽由白色到浅褐色,具有胶质感,无气味,轻而松脆.琼脂不溶于冷水,但在冷水中能吸水膨胀,吸水率达20倍.琼脂加热到95℃可与水形成黏液,0.1%浓度的溶液在室温下即可形成半透明的凝胶状物.琼脂中含有的琼脂糖越多,琼脂的凝胶强度就越高.
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胰岛β细胞株MIN6微囊胰岛素释放反应的研究
80年代初,Lim等[1]首次应用海藻酸盐作为免疫隔离膜微囊化胰岛移植,为解决胰岛移植的免疫排斥反应开辟了新的思路,被认为是治疗胰岛素依赖型糖尿病的有希望的途径。然而,胰岛供体不足、胰岛分离纯化质量的低下及移植后免疫排斥反应,阻止了胰岛移植的实验研究和临床应用的发展。随着近代基因工程技术的进展,已经建立了多种胰岛β细胞株,其中MIN6细胞株的糖代谢特征及糖刺激的胰岛素释放反应类似于正常胰岛[2,3]。本研究应用琼脂糖/聚苯乙烯磺酸免疫隔离膜,微囊化胰岛β细胞株MIN6作为新型人工生物胰岛,探讨其在体外糖刺激时胰岛素的释放反应。
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阿托伐他汀对血管平滑肌细胞PKB信号转导途径的影响
1材料与方法主要材料:阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司),羟甲戊酸(Mevalonate,MVA,Sigma公司),鼠抗兔PKB/AKT多克隆抗体(Sant Cruz公司),蛋白A-琼脂糖(Amersham公司),γ 32PATP(北京亚辉公司),组蛋白H2B(Histon H2B,BM公司).细胞培养与计数:采用贴块法培养兔主动脉平滑肌细胞.取生长状态良好的第5~6代血管平滑肌细胞(VSMC)制成细胞悬液(4×104/m1),接种于24孔细胞培养板中,每孔L0.5ml,孵育24h,换无血清培养液继续培养24h后,加10%胎牛血清,同时分组加入阿托伐他汀(1umol/L)、阿托伐他汀(1umol/L)+MVA(250 umol/L),培养3 d后计数.
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乙醇脱水干燥法彗星实验琼脂糖凝胶片保存时间的研究
单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤具有很高的灵敏度,已广泛用于职业危险因素引起的人群健康效应研究[1].因为多数现场与实验室距离较远,或不具备荧光显微镜和图像存储设备,所以限制了该技术的应用和推广.
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TAME法测定金龙消栓合剂中吲激酶单位效价
金龙消栓合剂由地龙、川芎等5 味中药组成,具有化痰熄风,祛瘀通络之功,用于中风引起的半身不遂,口舌歪斜等症.地龙为其主药,其有效成分为纤溶蛋白水解酶.为了控制该药品内在质量,我们对其酶活性进行效价测定.蚓激酶的效价测定有对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯法(TAME)、尿激酶琼脂糖-纤维蛋白平板法及组织纤溶酶原激活剂琼脂-纤维蛋白平板法[1].我们采用TAME法,并对其进行了一些改变,以期对中药复方中酶活力的效价测定也能够运用.
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基于琼脂糖/壳聚糖共混凝胶模型的壳聚糖生物相容性的机理研究
目的 以琼脂糖/壳聚糖共混凝胶为模型,研究壳聚糖材料生物相容性的可能机理.方法 通过共混法,制备出一系列不同壳聚糖含量的琼脂糖/壳聚糖共混凝胶.利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析共混凝胶的化学基团,利用荧光素-4-异硫氰酸酯(FITC)标记法观察琼脂糖和壳聚糖之间的可共混性.通过Zeta电势测量共混凝胶的电荷,利用二喹啉甲酸(BCA)法分别测定胎牛血清(FBS)总蛋白和牛血清白蛋白(RSA)在共混凝胶上的吸附,利用酶联免疫吸附(ELISA)法测定纤黏连蛋白(FN)在共混凝胶上的吸附.细胞实验以人微血管内皮细胞系(HMEC-1)为模型,通过观测细胞的黏附、增殖和形态来评价共混凝胶的细胞相容性.结果 琼脂糖/壳聚糖共混凝胶含有壳聚糖特征性的化学基团.琼脂糖和壳聚糖之间存在着良好的可共混性,壳聚糖的氨基基团在共混凝胶中呈均匀分布.在pH酸性条件下(pH 3.0)共混凝胶带有较强的正电荷,然而在pH中性条件下(pH 7.4)所有共混凝胶的Zeta电势均降低至0 mV附近.各组共混凝胶之间对FBS总蛋白以及BSA的吸附差异无统计学意义,但是共混凝胶对FN的吸附却随着壳聚糖含量的升高而显著升高.细胞实验结果显示:随着壳聚糖含量的提高,共混凝胶的细胞相容性有明显改善,HMECs在壳聚糖含量较高的凝胶上表现出良好的黏附、铺展和增殖.结论 相对于血清中的其他蛋白,壳聚糖组分对FN存在优先吸附,从而能够促进细胞在共混凝胶表面的黏附铺展.与传统观点不同,本研究发现壳聚糖的生物相容性与其所携带的正电荷无关.
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在琼脂糖表面无支架条件下构建组织工程软骨
背景:实验表明,软骨细胞在体外培养时,经常发生表型的丢失.但形成软骨细胞团块时可以维持软骨细胞表型,由此人们探讨无支架结构培养组织工程软骨的技术.目的:拟建立软骨细胞聚集培养体系,观察在琼脂糖表面培养软骨细胞,无支架条件下构建组织工程软骨的特点.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-10/2007-04在解放军南京军区总医院骨科研究所完成.材料:SPF级新西兰白兔4只,2周龄,雌雄不限.方法:分离、提取兔关节软骨原代软骨细胞,将低熔点琼脂糖铺于24孔培养板表面,按每孔2.5×105接种提取的兔原代软骨细胞,在培养箱内培养,定期换液.主要观察指标:取10d标本行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测.结果:10d时,软骨细胞自聚集形成有一定形状、大小的类软骨组织,苏木精-伊红染色可见软骨陷窝结构,甲苯胺蓝染色见紫红色异染,说明有蛋白聚糖的分泌.钙染色未见钙化, Ⅱ型胶原免疫组织化学染色有棕黄色颗粒,说明有Ⅱ型胶原分泌.结论:在琼脂糖表面构建组织工程软骨的培养体系,琼脂糖膜阻止软骨细胞的黏附和伸展,从而保持软骨细胞的圆形形态;软骨细胞在琼脂糖表面直接接触,加强了细胞之间的信息交流,有利于维持细胞的表型,维持软骨细胞分泌细胞外基质的特征.
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树舌多糖GF对小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白质组表达的影响
1 实验材料试剂:分子标准、PMSF、EDTA、RNase、DNase、Tris、丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、SDS、TEMED,均为sig-ma公司产品;琼脂糖等试剂均为国产分析纯.设备:XL-100K低温离心机,DYCZ-21型垂直板电泳槽,DYY-11型电泳仪,恒温摇床,-75℃冰箱,Mettler电子天平,Millipore超纯水机.UV-1700紫外可见分光光度计等.
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琼脂的质量与凝胶强度
琼脂又名琼胶,俗称洋菜、冻粉,英文名称为Agar,系有马来语Agar-Agar略称而来.琼脂系从石花菜、江篱及紫菜等红藻类植物中提取而制成的一种藻胶,它是由琼脂糖和琼胶质组成的长链多糖复合体,其化学成分是聚半乳糖硫酸酯,属于胶体物质[1].
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血管内皮生长因子的研究进展及其在缺血性脑血管病的应用前景
血管内皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),也称血管渗透因子(vascular permeability factor,VPF),是在1989年由Ferraral等牛垂体泡星状细胞培养液中利用硫酸铵析出、肝素琼脂糖亲和层析法及两次反相高压液相色谱纯化得到的一种糖蛋白.
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尿微量蛋白检测及尿蛋白电泳在肾脏疾病诊断中的应用
我们应用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳技术来进行蛋白尿的分类,并结合尿β2-微球蛋白(β2-m),尿视黄醇结合蛋白(RBP),尿微量白蛋白及α2-巨球蛋白测定进行对照分析,探讨尿微量蛋白检测及尿蛋白电泳在肾脏疾病中的诊断价值.
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碱性单细胞凝胶电泳铺胶技术的改进
目的聚苯乙烯孔槽单层铺胶技术在碱性单细胞凝胶电泳中的可行性研究.方法自制聚苯乙烯孔槽的载胶片,将1%低熔点凝胶与淋巴细胞混合后单层铺胶,经6 C-y γ射线照射后进行碱性单细胞凝胶电泳,观察胶面和淋巴细胞的DNA损伤情况.结果载胶片孔槽单层灌胶后胶面平整,操作过程无脱落;淋巴细胞DNA电泳图像清晰,6 Gy照射产生的"彗星"形态特征明显.结论采用聚苯乙烯孔槽进行单层铺胶的技术,可以克服碱性单细胞凝胶电泳中的胶板脱落等问题.