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集合PCR(实时荧光定量)快速鉴定副溶血性弧菌食物中毒
目的:2013年3月12日,重庆市长寿区某酒楼发生一起食物中毒,经流行病学调查调查和实验室检测,证实为副溶血性弧菌污染所致.方法:采集到的所有标本采用集合方式进行核酸提取,采用深圳生科源技术有限公司MABSKY系列荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光定量PCR核酸检测,然后根据核酸检测结果提示,采用国家食品安全检测标准方法进行细菌培养,生化鉴定.结果:根据流行病学调查和实验室检测结果,可明确诊断这是一起由副溶血弧菌引起的细菌性食物中毒.结论:本次食物中毒用国标方法检测副溶血性弧菌由样品制备算起,需经增菌、定性/定量检测、分离、纯培养、确定鉴定到出具报告,用时(不计算每一步骤操作用时)需要68~114小时,而采用集合实时荧光定量PCR检测[2.3.4],从接到样本到出具核酸检测结果仅3小时,时间上优势非常明显.基层疾控中心因为实验室条件限制和公共卫生人员经验问题,增加了病因漏判和错判的可能,采用核酸检测方法特别是荧光定量PCR与传统方法联合运用可明显增加阳性检出率.同一厂家荧光定量PCR试剂盒因为扩增参数完全一致,可大大缩短检测指向时间,采用集合PCR方法更节约了大量人力物力.建议国家尽快将核酸检测方法引入食品安全检测标准体系,至少在食物中毒的标准中应考虑加入核酸检测手段.
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荧光定量PCR检测食品中沙门氏菌研究
实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)实现了PCR从定性到定量的飞跃,可对目标DNA分子起始拷贝数精确定量。因其检测方法精确、灵敏、污染途径少,已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法,在食品中安全微生物的鉴定也有重要应用[1]。沙门氏菌是引起食物中毒为常见的致病菌,因此,建立食品中沙门氏菌中荧光定量PCR检测方法有重要的研究意义。材料与方法?1菌株:鼠伤寒沙门氏菌(C77-31)有中科院微生物所提供,肉类、奶制品等产品均购于农产品市场。2主要试剂和设备:DNA提取试剂购买于美国Invitrogen公司;Taq酶和缓冲液购买于日本TaKara;opction2荧光定量PCR购买于美国MJ公司;超速离心机购买于Eppendorf;细菌鉴定仪;所用的常规试剂均为分析纯,购买于国药化学试剂有限公司;方法,将标准菌株在XLD、三糖铁斜面和肉汤培养基上培养,从肉汤培养基中取一定量的菌液装入EP管中,离心,去上清,加入双蒸水,沸水浴、冰水浴,离心,取上清。食品样品采用沙门氏菌国标检测法(GB?4789.4-2010)中BPW前增菌之后的培养液装入EP管中,进行相同的操作。引物探针设计,在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象,然后用PrimerPremier5搜索引物和用Oligo验证评估引物。经过筛选进行特异性和灵敏度的实验。
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实时荧光定量PCR技术在食品检验中的应用
实时荧光定量PCR技术是基于定性PCR技术而形成的一种核酸定量技术,这种技术能够达到定量DNA模板的效果,同时,灵敏度比较高,具有准确性、特异性强等特性.本文先分析了实时荧光定量PCR技术基本原理,接着具体阐述了食品检验中实时荧光定量PCR技术的应用情况.希望通过此次研究不断优化及完善实时荧光定量PCR技术,使其更好地用于食品检验工作当中.
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现代技术在食品检测领域的应用
食品的安全关乎百姓的生活质量,对于百姓的重要性不言而喻。随着生活水平的逐渐提高,人们对食品安全的要求也越来越高。近年来,食品安全事件屡有发生,从欧洲的疯牛病、二恶英到国内发生的苏丹红、瘦肉精和三聚氰胺等事件让人对食品安全产生不少担忧。因此,加强食品检测刻不容缓,重要的是不断加强食品检测技术。传统的检测技术已无法满足现代食品检测要求,要将现代生物分子技术应用到食品检测领域才能让食品的质量更安全,使百姓的生活更有保障。现代生物技术应用在食品检测领域也已有一定成果,本文围绕实时荧光定量PCR技术、核酸探针技术、近红外光谱技术、生物芯片技术等技术在食品检测领域的应用及其优缺点进行介绍。
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转基因大豆定量检测方法的建立
转基因产品标识管理的关键是以有效的定量检测方法为基础的.因此,迫切需要建立特异、灵敏、高效的转基因产品定量检测方法.
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LightCyclerTM全自动实时荧光定量PCR诊断系统原理分析
聚合酶链反应(Polymemse chain reaction,PCR)技术自1989年应用于临床检验以来,以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点.2000年6月瑞士罗氏公司生产的LightCyclerTM全自动荧光定量PCR系统通过国家药品监督管理局医疗器械产品准入审查,医疗器械注册证号:SDA(I)20000755.目前,已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测.
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沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用
[目的]建立一种快速、灵敏、准确的检测方法,预防沙门菌食物中毒.[方法]根据沙门菌保守基因序列fimY基因设计合成了引物和TaqMan探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量方法,并对反应条件进行了优化,组装成快速检测试剂盒.[结果]其检测灵敏度达到4.5cfu,比常规PCR高100倍,而且稳定性良好,冷冻至少可以保存9个月.[结论]通过临床样品的检测,该试剂盒具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性强等优点,很适合大量样品的检测.
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结核分枝杆菌的检验及结果分析
检出痰液中结核分枝杆菌一直是临床诊断肺结核或鉴别肺结核与其他肺病的主要依据,涂片法简单易行,但阳性率较低,罗氏培养法虽为金标准,但因周期较长,均难以满足临床需要.近年来,作为直接检测分枝杆菌种系的鉴定及药敏的许多分子生物学方法得到长足发展,这些方法能将诊断的时间从几周缩短到几天,其中实时荧光定量PCR(FO-PCR)因其技术成熟,具有较高的敏感性和特异性,已逐步应用于临床,我们用以上3种方法同时检测100例临床痰液标本结核杆菌,对结果进行分析.
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晶芯(R)RT-Cycler636实时荧光定量PCR仪
仪器简介博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心自主研发的晶芯(R)RT-Cycler636实时荧光定量PCR仪是致力于生命科学研究和分子诊断应用领域的新型产品.它采用离心式实时荧光检测方式,通过热循环PCR对特异性的靶基因进行扩增并定量.
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立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立
目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法.方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法.结果建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈线性关系(R2=0.996),低检测浓度为5拷贝/μl;用荧光定量PCR方法检测其他相关立克次体和常见非立克次体病原菌,检出结果均为阴性.用该方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本,检测的结果与立氏立克次体感染相关.结论研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性,适用于快速检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断.
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实时荧光定量PCR模板DNA快速制备的方法建立与应用
实时荧光定量PCR技术于1996年美国AppiedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现PCR从定性到定的飞跃,而且与常规PCR相比,具有特异性更强、敏感度更高、操作简便快速、可以有效解决常规PCR污染问题等优点[1-2],已广泛应用于突发公共卫生事件应急处置中病原体的检测.提高实时荧光定量PCR的检测速度,服务于突发公共卫生事件应急检测是当前备受关注的技术问题.实时荧光定量PCR由模板制备和PCR两部分组成,缩短模板制备时间就可提高实时荧光定量PCR的检测速度.我们研制了一种模板制备方法,使制备时间从原来的30 min以上缩短至5 min以内,制备效果与经典的煮沸裂解法和先进的柱式核酸提取试剂盒相同,用于实时荧光定量PCR可在15~30 min内完成病原体DNA检测.
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沙门菌检测的实时荧光定量PCR联合显色培养技术
<中华人民共和国国境卫生检疫法>及其实施细则和<中华人民共和国食品卫生法>及<公共场所卫生管理条例>规定,口岸食品和公共场所从业人员必须进行沙门菌检测.实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用[1-2].
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基于新疆紫草转录组的对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)基因的挖掘及生物信息学分析
对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)在紫草素类化合物的生物合成途径中起重要作用.该文主要通过生物信息学的方法从新疆紫草转录组中获得6个PGT基因,并预测其编码蛋白的理化性质,进行相关基因的表达分析.结构域预测结果显示,6个PGT蛋白序列均包含UbiA异戊烯基转移酶家族保守结构域及异戊烯焦磷酸结合位点NDxxDxxxD和可能的芳环的结合位点GX(K/Y)STAL;系统进化树分析显示PGT与同源的对羟基苯甲酸多异戊烯转移酶(PPT)属于2个不同的进化枝;基因表达分析表明在紫草素类化合物产量较高的新疆紫草红色高产系悬浮细胞及植株的地下部分,其PGT基因的表达量明显高于白色低产系及植株的地上部分,说明新疆紫草PGT基因的表达量与紫草素类化合物的合成呈正相关.该研究为进一步了解对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)的功能及特性奠定了基础,并为紫草素类化合物生物合成及代谢调控提供依据.
关键词: 新疆紫草 对羟基苯甲酸香叶基转移酶 生物信息学分析 实时荧光定量 -
合并HBV阳性的肝癌围手术期抗病毒治疗的初探
原发性肝癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤,其治疗原则主要是以外科治疗(包括肝癌切除,肝动脉结扎,肝动脉栓塞化疗,肝移植等)为基础的综合治疗.根据近年的临床统计,发现部分合并HBV感染的HCC患者经过外科治疗后无法达到预期的治疗效果,仅有10% ~ 30%的患者可获手术切除,根治性切除术后仍具有较高复发率,5年生存率仅为30%~50%[1].短期内出现肝功能衰竭,但以肝功能储备情况及手术创伤打击程度无法较好地解释.本文对合并HBV阳性的HCC患者在围手术期进行抗病毒治疗,从而为HCC患者的临床治疗提供依据.
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实时荧光定量PCR的应用体会
对于病毒的监测和疾病的诊断,定性检测已不能满足临床需要,实时荧光定量PCR技术(realtime quantitative PCR)于1996年由美国Aplied Biosystems公司推出.
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小鼠感染细粒棘球蚴早期TGF-β1表达分析
目的 观察细粒棘球蚴早期感染BALB/c小鼠TGF-β1的表达情况. 方法 用细粒棘球蚴感染BALB/c小鼠,分别于感染后第1、3、5、7、9、12d处死,取其脾细胞和外周血,采用酶联免疫法检测外周血细胞因子TGF-β1的含量,采用qRT-PCR法检测TGF-β1基因的表达量. 结果 实验鼠Eg感染后第1~12 d,外周血 TGF-β1的含量为2 695.79~3 055.09 ng/ml,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1 mRNA相对表达量为0.029~0.060,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).TGF-β1及其mRNA表达量均有随着感染时间延长呈增高的趋势. 结论 TGF-β1在小鼠细粒棘球蚴感染早期表达增加,可能有利于细粒棘球蚴的免疫逃逸.
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实时荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法的建立与初步应用
结核分枝杆菌不产外毒素和侵袭性酶,而结核分枝杆菌分泌的蛋白及菌体蛋白在宿主抗结核分枝杆菌的细胞免疫和体液免疫应答中发挥着重要作用.结核分枝杆菌mRNA的半衰期很短(3~5 min),是结核分枝杆菌活菌诊断及检测药物敏感性很好的分子标志.因此通过检测临床上分离的结核分枝杆菌的mRNA可以快速判断是否为致病性结核杆菌及结核分枝杆菌是否为活菌.
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实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白的表达
目的 应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(BMP)-2 mRNA水平.方法 建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2 mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第1、2、3、4周取断端组织,通过实时荧光定量RT-PCR检测标本标本中BMP-2 mRNA水平.结果 在对照组,创伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在1周开始增高,在第2周达到高峰后下降,第4周即可恢复正常.而实验组,受枪伤的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在第3周表达高,与对照组相比,升高较慢,表达量也偏低(P<0.05).结论 BMP-2 mRNA SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR可以很好地反应枪击伤对兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平的影响.枪击伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平与对照组相比升高较慢,表达量也偏低.
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实时荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核杆菌DNA的临床应用
结核病是严重危机全球公共卫生的问题之一.结核病的病原学检测是发现传染源的主要手段,是确定结核病的依据,在结核病的预防和治疗工作中起着不可或缺的重要作用[1].近年来随着结核分子生物学诊断技术的快速发展,其快速、敏感、特异性高等的优点使其在临床逐渐得到应用.其中实时荧光定量聚合酶链反应(FQ PCR)阳性结果可作为结核病诊断的重要临床依据.本文应用Real time-FQ PCR技术与传统抗酸染色方法对比分析56例脑脊液标本,结果报告如下.
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实时荧光定量PCR及其在军团菌检测中的应用
军团菌是一种兼性胞内寄生菌,可入侵人体巨噬细胞,并在其中繁殖,是引起人类军团菌病的重要病原体.目前已确认军团菌有50多个种,70多个血清型,其中如多种与人类疾病相关[1].由于军团菌种类繁多,常规的检测鉴定方法已不能满足需要.