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成年小鼠肺成纤维细胞分离纯化及原代培养
成年小鼠肺成纤维细胞的原代培养是获得肺组织后在体外进行的培养,能反映体内的生长特性,对研究细胞的生长分化及其生理病理变化的机制具有极其重要的价值,具有细胞系所无法比拟的优点.本文主要探讨合理的成年小鼠肺成纤维细胞的分离纯化培养方法及其生长曲线特点.1材料与方法1.1试剂:高糖DMEM(Gibco公司),胎牛血清(杭州天杭公司),胰蛋白酶(Sigma公司),波形蛋白vimentin、α-平滑肌肌动蛋白α-SMA抗体和免疫组化SABC试剂盒(武汉博士德公司).1.2实验动物:清洁级雄性成年昆明小鼠(25±5)g[华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005].
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大鼠脊髓微血管内皮细胞的分离培养与鉴定
脊髓微血管内皮细胞(spinal cord microvascular endothelial cells,SCMECs)参与构成血脊髓屏障,其功能变化与多种脊髓相关疾病相关.目前分离SCMECs的文献很少.本研究拟基于分离多种原代内皮细胞的经验[1-2],建立分离纯化SCMECs的方法.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂:DMEM(高糖)、胎牛血清(FBS)、Ⅱ型胶原蛋白酶、双抗、庆大霉素、谷氨酰胺和l×PBS(北京协和医学院细胞中心);牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、胶原蛋白酶/分散酶(collagenase/dispase)(Roche公司);嘌呤霉素(Sigma公司);内皮细胞培养基(ECM)(Scien Cell公司);兔抗大鼠yon Willebrand factor(vWF)抗体(SantaCruz公司);抗GFAP抗体和抗α-SMA抗体(Abcam公司);FITC标记和TRITC标记的二抗(北京中衫金桥公司).
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不同浓度胎牛血清肝浸汤培养基培养阴道毛滴虫效果观察
3株阴道毛滴虫用肝浸汤培养48 h,虫体密度分别为0.7×105/ml、1.5×105/ml和2.0×105/ml;用含终浓度为1%、5%、10%的胎牛血清肝浸汤培养48 h,虫株Ⅰ的密度分别为6.0×105/ml、640.0×105/ml和1 280.0×105/ml,虫株Ⅱ分别为16.0×105/ml、1 600.0×105/ml和2 400.0×105/ml,虫株Ⅲ分别为65.0×105/ml、840.0×105/ml和520.0×105/ml.表明肝浸汤添加适量胎牛血清后培养效果良好.
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人脐血清代替胎牛血清培养树突状细胞
为探讨脐血清(umbilical cord serum,UCS)取代胎牛血清(fetal calf serum,FCS)对体外培养体系中树突状细胞分化和功能的影响,用脐血清代替FCS培养树突状细胞,通过流式细胞术检测细胞表型和MTT法检测混合淋巴细胞反应的能力.结果表明,脐血清培养的DC(UCS-DC)表面CD83,CD86和HLA-DR的表达率明显高于FCS组DC;而CD1a表达率低于FCS-DC;对混合淋巴细胞反应的刺激能力UCS-DC与FCS-DC均较对照组明显增强,但UCS-DC与FCS-DC间无明显差别.结论:脐血清代替FCS可以产生完全不含异种蛋白、表型比含FCS体系培养的DC更成熟,且有较强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的DC.
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血管内皮细胞的活化或损伤诱导平滑肌细胞的增生和凋亡
一、材料与方法1.细胞培养:采用改进的Jaffe氏培养法,培养人脐带静脉内皮细胞.采用贴块法培养人脐动脉平滑肌细胞并传代.培养液均为含20%胎牛血清的DMEM培养液.
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氧氟沙星、叠氮胸苷单独及与干扰素合用对黄病毒增殖的影响
选用氧氟沙星(OFLX)和叠氮胸苷(AZT)单独投入及与IFN并用,观察其抗病毒活性结果如下: 1 材料和方法 1.1 病毒和细胞所用黄病毒为乙型脑炎病毒JEV的JaGAr-01株。细胞是人肝癌细胞株HepG2。细胞培养所用培养液为DMEM加10%胎牛血清(FCS)。 1.2 感染病毒病毒感染剂量为l0 m.o.i(multiplicityinfection),37℃吸附60min,在5%CO2孵箱中培养。将各种浓度的药物添加至含病毒的细胞培养液中,24h后采取培养上清液,测定病毒的含量。 1.3 病毒滴定用空斑形成方法。将含有病毒的培养上清液按比例稀释,在24孔培养板内单层培养的仓鼠肾细胞株BHK上,添加0.6%的甲基纤维素液和含有1%FCS的MEM培养液,3d后用甲醇固定,l%结晶紫染色,计算空斑数。
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血浆对细胞因子诱导杀伤细胞增殖、表型和毒性影响的研究
为了优化扩增细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞的培养方案并进一步推广到临床,本文比较了无血清培养基X-vivo15、成年人AB血浆(ABP)、脐带血血浆(CBP)和胎牛血清(FBS)对CIK细胞增殖、表型和毒性的影响.人外周血单个核细胞分别以4种培养基诱导CIK细胞,细胞增殖、表型和毒性的测定分别用MTT增殖分析法、流式细胞分析法、乳酸脱氢酶细胞毒性分析法.
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“克疣灵”治疗尖锐湿疣的实验研究
尖锐湿疣(CA)为难治性病毒性疾病,缺乏有效的治疗手段,为探讨中药"克疣灵"外搽剂(主要含生药苦参、黄连等)治疗CA的作用机理,我们开展(1) 兔包皮表皮细胞、CA细胞的原代与传代培养:无菌条件下剥离CA组织、雄性大白兔包皮表皮组织,修剪成1mm2大小置含20%胎牛血清的25ml无菌培养瓶,待组织块固定后翻转培养瓶,加RPMI 1640培养液1.5ml 37℃,5% CO2无菌培养箱中静置3~4 h后轻轻翻转,使组织小块浸于培养液中,14 d后待细胞贴满瓶底后传代至第5代.(2) 不同浓度的"克疣灵"对CA细胞、兔包皮表皮细胞增殖的影响:
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胎牛及人血清中低密度脂蛋白与光敏剂药效相关的比较研究
背景与目的评价新型的光敏剂通常需检测它与细胞以及细胞所生长的培养基之间的相互作用.光敏剂在体外蓄积的机制包括扩散、电荷梯度和受体介导的吸收过程.加入到血清中的光敏剂除了与白蛋白结合外,它们还会在脂蛋白[极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)]中分布,而这种分布会影响细胞对它们的吸收.光敏剂与脂蛋白的结合与其脂溶性有关.本研究的目的是比较人和胎牛血清中脂蛋白成分的异同,进一步探讨脂蛋白成分的不同对新型疏水性光敏剂n-丁基-3-[18-(2-丁烷氨基甲酰-乙基)-3,7,12,17-四甲基-18,13-二乙烯-22,24-二氢-卟吩-2-烃基]丙酰胺(n-butyl-3-[18-(2-butylcarbamoyl-ethyl)-3,7,12,17-tetramethyl-18,13-divinyl-22,24-dihydro-porphin-2-yl]propionamide,PP-N-3)和相对疏水性血卟啉酯(haematoporphyrin ester,HpE)在人和胎牛血清中分布的影响.
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自体血清与胎牛血清对经血源性基质干细胞增殖的影响
目的 探讨自体血清替代胎牛血清培养经血源性基质干细胞的可行性,从而为疾病的个体化治疗提供参考.方法 收集20~30岁健康育龄女性的月经血,通过密度梯度离心法分离出经血源性基质干细胞,分别均匀地接种于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养体系和含10%自体血清的DMEM/F-12培养体系中,观察细胞的形态及增殖特性,并采用CCK-8法绘制生长曲线.比较两种培养体系培养的经血源性基质干细胞的成骨及成脂能力.结果 两种培养体系下,经血源性基质干细胞均呈典型的短小梭形生长,均可形成集落.成人自体血清组培养的经血源性基质干细胞在增殖速度上接近于胎牛血清组,CCK-8生长曲线的吸光度值差异无统计学意义(P>0.05).结论 两种培养体系下的经血源性基质干细胞均具有成骨及成脂能力.成人自体血清组培养的经血源性基质干细胞的形态和增殖能力接近于胎牛血清组,并维持了经血源性基质干细胞的基本生物学特性,可以替代胎牛血清用于经血源性基质干细胞的扩增培养,作为一种无异种血清的培养体系,为大量扩增经血源性基质干细胞用于开展临床治疗提供了较为安全的选择.
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大鼠骨髓间充质干细胞原代培养换液频度与细胞增生的关系
目的:探索成体大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养方法,观察采用不同的换液频度与细胞增生和生长的关系,为其应用提供实验依据.方法:从大鼠股骨获取骨髓,采用梯度离心的方法进行分离,在含10 mL/L胎牛血清的DMEM中常规培养,以MTT法检测不同的时间换液时细胞的生长曲线,并用碱性磷酸酶(AKP)检测的方法对分离的细胞进行鉴定.结果:采用梯度离心方法分离的骨髓间质干细胞的纯度较高,细胞活性佳,AKP染色为强阴性.首次换液后,每天更换培养液比每隔3-4 d换液一次更有利于MSCs的增生,原代长满培养瓶底比每隔2-3 d换液一次平均提前2 d.结论采用梯度离心的方法分离可获得纯度较高的骨髓间质干细胞,是简单易行的分离方法,每天更换培养液比每隔3-4 d换液一次更有利于MSCs的增生和形成形态均一的细胞集落.
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尼古丁诱导人气道成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化
吸烟是COPD的主要致病因素,气道重塑是COPD患者出现持续气流受限的主要病理基础.尼古丁占烟草生物碱总量的95%以上,尼古丁对COPD发病,特别是对气道重塑有着重要影响.我们以原代培养的人气道上皮下成纤维细胞为研究对象,观察尼古丁对成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的影响,以探讨尼古丁在COPD气道重塑中的作用.材料与方法癌周正常肺组织取自广州医学院第一附属医院胸外科2010年1-6月手术治疗的40~60岁肺癌患者,进行细胞原代培养及鉴定[1],分离正常支气管组织后用酶消化法及差速贴壁法获得支气管成纤维细胞,用含有100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,置于95%空气、5% CO2和37℃孵育箱中常规培养及传代.
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阿托伐他汀对血管平滑肌细胞PKB信号转导途径的影响
1材料与方法主要材料:阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司),羟甲戊酸(Mevalonate,MVA,Sigma公司),鼠抗兔PKB/AKT多克隆抗体(Sant Cruz公司),蛋白A-琼脂糖(Amersham公司),γ 32PATP(北京亚辉公司),组蛋白H2B(Histon H2B,BM公司).细胞培养与计数:采用贴块法培养兔主动脉平滑肌细胞.取生长状态良好的第5~6代血管平滑肌细胞(VSMC)制成细胞悬液(4×104/m1),接种于24孔细胞培养板中,每孔L0.5ml,孵育24h,换无血清培养液继续培养24h后,加10%胎牛血清,同时分组加入阿托伐他汀(1umol/L)、阿托伐他汀(1umol/L)+MVA(250 umol/L),培养3 d后计数.
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肝素小分子片段对平滑肌细胞生长及其抗凝作用的对比研究
肝素小分子片段抑制平滑肌细胞(SMC)增殖及抗凝作用的关系目前尚缺乏认识。本研究发现几种小肝素片段抗凝活性基本丢失,但均保持了抑制SMC增殖的活性。 1. 材料与方法:(1)肝素及其小分子片段对培养的人主动脉SMC的作用:将培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC)接种于24孔培养板。每孔1 ml (1×104细胞),实验共分7组:第1~5组含有不同糖基数的肝素小分子片段,第 6组含大分子肝素,第7 组为对照组,不含肝素及肝素小分子片段。上述各组肝素的浓度均以糖醛酸表示,每组3个浓度(19、38、76 μg/ml)。用含 10%人血清,10%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h,然后用3[KG*2]HTdR参入法观察肝素及其小分子片段对培养的hASMC生长的影响。(2)肝素小分子片段抗凝活性的测定:用凝血法测定肝素及不同肝素小分子片段激活全血凝固时间。
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小鼠骨髓基质细胞成内皮细胞分化及缺血区存活能力
目的探讨体外培养的骨髓基质细胞的部分生物学特性、成内皮细胞分化能力及在缺血区存活能力.方法分离5~6周龄的小鼠胫骨、股骨,预冷的DMEM/F12培养基冲洗出骨髓,密度梯度离心分离出骨髓单个核细胞,接种于DMEM/F12培养基中(含10%优质胎牛血清及双抗).
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烧伤前后大鼠血清对骨髓基质细胞生物学行为的影响
目的:观察烧伤前后大鼠血清对体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学行为的影响,为骨髓基质细胞在创伤修复中的应用奠定实验基础.方法:取Wistar大鼠,处死分离骨髓,原代培养骨髓基质细胞,传代后分别用含有10%胎牛血清、正常大鼠血清、烧伤后3d大鼠血清和烧伤后14d大鼠血清的F-12培养基培养,用MTT法测定其生长曲线,PI染色,流式细胞仪分析细胞周期、DNA含量和细胞凋亡率.结果:用含有10%大鼠血清的F-12培养基传代培养的细胞生长曲线相似,但与含有FCS的F-12培养基传代培养的明显不同.前者倍增时间缩短,N组、B1组、B2组细胞群体倍增时间分别为23.7h、18.6h、20.2h.平台期所能达到的细胞总数明显增加.烧伤后大鼠血清处理过的细胞中G0/G1期细胞比例明显低于其它两组,而S期细胞的比例则相反.正常大鼠血清处理过的细胞中G2+M期细胞的比例则比其它组明显升高.大鼠血清处理过的细胞中DNA含量明显高于胎牛血清培养的细胞,而烧伤后的大鼠血清处理过的细胞中DNA含量则明显高于正常大鼠血清处理过的细胞.而烧伤后3d的大鼠血清处理过的细胞的凋亡率比其它组细胞明显升高.结论:大鼠血清比胎牛血清能更好地促进大鼠体外培养的骨髓基质细胞生长;烧伤大鼠血清内可能含有多种能影响骨髓基质细胞生长的物质,且其含量随烧伤的时间改变而变化,对骨髓基质细胞生长的影响是复杂的.
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胎牛血清在体外培养肝细胞极性形成的作用
目的观察胎牛血清在体外培养肝细胞极性形成的作用.方法分别利用含胎牛血清和不含胎牛血清培养液培养成鼠肝细胞,并观察血清对肝细胞形态、特异性膜区域蛋白分布以及蛋白分泌的影响,以确定胎牛血清在体外肝细胞极性形成的作用.结果不含血清组,肝细胞形成肝板样结构,肝细胞膜区域蛋白特异性分布,肝细胞保持稳定的蛋白分泌并持续增长达2周之久.而含血清组肝细胞培养3 d后,分化良好的小管样结构消失,肝细胞膜区域蛋白失去特异性分布,蛋白分泌逐渐减少.结论胎牛血清可阻止肝细胞极性的形成,对于肝细胞移植及生物人工肝支持具有重要意义.
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胃液对BIU-87细胞系细胞凋亡的影响
为探讨胃代膀胱术抑制膀胱肿瘤复发的机制,我们采用体外实验方法,观察胃液对膀胱癌细胞系BIU-87细胞凋亡的影响,报告如下。 材料与方法细胞培养及处理:将BIU-87细胞系置于37 ℃、5% CO2、含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养,待细胞生长旺盛、进入指数增殖期时,收获培养瓶中的细胞,调配成2.5×105个/ml细胞悬液,接种至预先置有玻片的24孔培养板和T-75培养瓶,实验各组分别加入胃液(终浓度7.6 μmol/ml)、稀盐酸(终浓度7.6 μmo l/ml)、阿霉素(终浓度2 μg/ml)和无药培养液,继续置于37 ℃、5%CO2条件下培养,24 h后收集细胞进行检测。
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上尿路结石中纳米细菌的检测
纳米细菌是20世纪90年代新兴的研究课题,研究认为肾结石可能是一种纳米细菌疾病[1].我们从上尿路结石中培养出纳米细菌并通过电镜鉴定.现报告如下.材料与方法主要试剂:DMEM细胞培养液(高糖型,Hyclon公司),类标准胎牛血清(兰州民海生物公司),Hoechst33258DNA染色试剂盒(江苏碧云天生物公司).
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血管内皮生长因子反义寡核苷酸及抗KDR抗体对人肝癌细胞系HHCC的生长抑制作用
本研究采用VEGF反义寡核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)抑制VEGF分泌及抗KDR抗体封闭KDR的方法,观察它们对体外培养的肝癌细胞系HHCC细胞生长情况的影响,以探讨VEGF及其受体在肝细胞癌中的作用.材料与方法1.细胞株:人肝癌细胞株HHCC由第四军医大学病理学教研室863课题组保存并提供,培养于含100*!ml/L胎牛血清的RPMI-1640培养液中.