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三种细胞培养模型的效果评价
原代大鼠肝细胞经不同体外细胞培养模型培养后,对肝细胞的酶渗出量、白蛋白分泌水平和细胞色素P450 1A(CYP 1A)活性进行了分析.结果显示:在三种培养模型中,培养液的LDH水平随培养时间的延长而逐渐降低,但在单层培养(MC)的第5天,LDH水平明显升高,而夹层培养(SC)的LDH在第8天后没有检出,AST和ALT水平在整个培养过程中无明显变化.在生物反应器中( bioreactor),肝细胞基础CYP1A活性可维持2周以上,培养液中白蛋白的含量以生物反应器高,其次是SC和MC.随着培养时间的延长,MC和SC中肝细胞CYP 1A活性逐渐降低,且MC肝细胞CYP 1A活性的下降速度比SC快.这种现象可被细胞色素P450(P450)的诱导剂如奥美拉唑和3-甲基胆蒽(3-MC)部分改变,MC肝细胞的诱导作用总是比SC肝细胞强.结果证实每一个体外细胞培养模型都有各自的优缺点,不同的体外细胞培养模型可以解决问题的不同方面.
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单层培养的人关节软骨细胞生物学行为研究
目的:研究单层培养的人关节软骨细胞生物学行为的改变.方法:对来自8例手术切除负重关节非负重区的软骨细胞在10%DMEM中进行单层传代培养,观察细胞形态学、增殖细胞倍增时间(DT)、细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色以及流式细胞分析细胞增殖指数(PI)和细胞凋亡.结果:随着传代次数的增加,(1)细胞形态由原代的多角形转变为第3、4代的短梭形、第8、9代的成纤维细胞形态;(2)DT在逐渐延长,PI在逐渐减小;(3)细胞分泌的Ⅱ型胶原逐渐减少;(4)细胞凋亡指数未见明显的改变(P>0.05).结论:体外单层培养的关节软骨细胞存在着失分化和老化,但第3、4代能较好地保持软骨细胞的生物学行为,可作为种子细胞的来源.
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氧氟沙星、叠氮胸苷单独及与干扰素合用对黄病毒增殖的影响
选用氧氟沙星(OFLX)和叠氮胸苷(AZT)单独投入及与IFN并用,观察其抗病毒活性结果如下: 1 材料和方法 1.1 病毒和细胞所用黄病毒为乙型脑炎病毒JEV的JaGAr-01株。细胞是人肝癌细胞株HepG2。细胞培养所用培养液为DMEM加10%胎牛血清(FCS)。 1.2 感染病毒病毒感染剂量为l0 m.o.i(multiplicityinfection),37℃吸附60min,在5%CO2孵箱中培养。将各种浓度的药物添加至含病毒的细胞培养液中,24h后采取培养上清液,测定病毒的含量。 1.3 病毒滴定用空斑形成方法。将含有病毒的培养上清液按比例稀释,在24孔培养板内单层培养的仓鼠肾细胞株BHK上,添加0.6%的甲基纤维素液和含有1%FCS的MEM培养液,3d后用甲醇固定,l%结晶紫染色,计算空斑数。
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胰高糖素样肽GLP-1(7-36)NH2对β细胞内游离钙和胰岛素分泌的影响
GLP-1(7-36)NH2是“肠-胰岛轴”中重要的调节胰岛素释放的激素,我们采用新生大鼠胰岛细胞单层培养的方法,探讨了GLP-1(7-36)NH2对胰岛素分泌的作用,并以Fluo-3为探针,用粘附式细胞仪,研究了它对胰岛β细胞内游离Ca2+的作用。 一、材料与方法 1.胰岛细胞培养:出生2~3d的Wistar大鼠,无菌取出胰腺,Hanks液漂洗,剪碎,加入0.2%胰蛋白酶和2g/L V型胶原酶(Sigma公司产品),置38℃水浴中反复振荡消化5~8min,用冰冷的Hanks液终止消化,及时分离消化物,离心收集细胞,加入含15%小牛血清的RPMI-1640培养基[1]。调整细胞浓度,接种于75mm3细胞培养瓶,置37℃、5% CO2和95%空气的培养箱中培养16h后,转入24孔培养板中,同时取一定量的细胞悬液接种于改良的Petri皿中(细胞浓度均为1×109个/L,记为0 d),培养48h后,用新配制的碘乙酸2.5mg/L处理3~5h,再换无碘乙酸培养液继续培养,每两天换培养液一次,培养7d后,选生长良好的细胞用于实验[1]。
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体外模型在药物性肝损伤的应用进展
药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是新药研发上市后被撤市或限制使用的主要原因.由于临床表现复杂,发病率低,而且涉及化学药、中草药和膳食补充剂等种类繁多,在临床前药物筛选过程中难以有效发现药物对肝的损伤作用.国内外均在探索和研究能够预测DILI的相关体外模型,本文汇总了当前国内外DILl新体外模型研究进展,以期为致肝损伤药物早期筛选和评价模型的合理选择提供参考.
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六种真菌毒素对培养软骨细胞的作用
1.目的方法真菌及其毒素中毒是大骨节病(KBD)重要病因学说之一,由于检出的优势真菌和毒素在各病区的结果不一致.我们用脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、互隔交链孢霉单甲醚(AME)、丁烯酸内酯(BUT)和串珠镰刀菌素(MON)等毒素对体外单层培养的幼兔关节软骨细胞进行损伤实验,测定软骨细胞DNA、基质葡萄糖醛酸量作为生长代谢的指标,并于倒置显微镜和透射电镜下观察细胞结构情况,了解这些毒素对KBD靶细胞-软骨细胞生长代谢和超微结构的作用,为KBD的病因研究积累基础实验资料.
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细胞黏附介导的肿瘤多细胞耐药
近年来人们对肿瘤的耐药机制进行了大量研究,如某些耐药基因(MDR)和细胞表面蛋白(P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白)介导的多药耐药[1].然而针对这些耐药机制所设计的治疗方法,尽管在体外研究中效果显著,但在临床上却难以奏效,特别是对实体瘤的治疗更是令人失望.这提示体内肿瘤作为一个细胞群集体,其生物学特性和对药物的敏感性与体外单层培养的癌细胞有着明显的差异.
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人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染半月板细胞的实验研究
我们在实验中观察了不同区域半月板细胞在体外单层培养时的形态差异,并采用脂质体介导人胰岛素样生长因子Ⅰ( hIGF-Ⅰ)基因转染半月板细胞,以期为生物学方法修复半月板缺损提供基因修饰的种子细胞.
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肾上腺皮质细胞的单层培养方法
目的: 体外单层培养大鼠肾上腺皮质细胞,以便为肾上腺皮质细胞的有关实验提供必要条件.方法: 采用胶原酶Ⅱ、透明质酸酶消化等步骤分离Wistar大鼠的肾上腺皮质细胞;分离的细胞于含15% NBS的DMEM培养基、37℃、5% CO2的环境中培养,3β-羟基类固醇脱氢酶特异染色鉴定.结果: 培养的肾上腺皮质细胞呈梭形,胞体较大、有少量突起,3β-羟基类固醇脱氢酶特异染色后胞体显著着蓝色.肾上腺皮质细胞不呈典型的"S"形增殖趋势,适于作原代培养.上皮样细胞和成纤维样细胞同时存在.结论: 通过细胞形态观察及特异酶染色鉴定,本文培养的细胞为大鼠肾上腺皮质细胞.
关键词: 肾上腺皮质细胞 单层培养 3β-羟基类固醇脱氢酶 -
SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察
目的 建立大鼠肋软骨细胞(RCC)分离、培养的方法,探讨其传代过程中细胞外基质及其形态的变化.方法采用胰酶和Ⅱ型胶原酶两步消化法结合机械吹打获得分散的单个RCC,观察单层培养的不同代数RCC的细胞形态变化;采用免疫细胞化学方法检测不同代数RCC蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达.结果大鼠肋软骨经两步消化后,可获得高纯度的软骨细胞,经免疫组化及甲苯胺蓝染色呈阳性结果,同时观察到RCC在传代过程中细胞发生了去分化现象.结论软骨细胞可以通过传代培养获得扩增,但仅限于四代以内细胞.
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体外重建皮肤及单层培养角质形成细胞对模拟日光紫外线照射的分子应答
白种人的皮肤癌发病率已经高于过去的40年,主要原因是人们开始改变自己的生活习惯,外出度假而将自己过度暴露于日光下.现已确定,非黑素瘤皮肤癌发生的首要、而且是主要步骤为紫外线诱导的突变.UVB辐射(290~320 nm)在诱导环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物中影响显著,这两种损害均具有高突变性.目前已有相关的人类基因突变的研究报道,特别是着色性干皮病,由于紫外线诱导DNA损伤的修复障碍而使该病患者发生皮肤癌的概率增加.UVA辐射(320 ~ 400 nm)也可以诱导DNA损伤,如,DNA链断裂、氧化损害和环丁烷嘧啶二聚体,即使诱导效应低于UVB,但无疑也具有基因毒性.因此,UVA与UVB均参与导致皮肤癌的发生.
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人髂骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定
[目的] 探讨人髂骨生长板软骨细胞体外培养的可行性并观察其生物学特征.[方法] 对手术中获得的10例青少年特发性脊柱侧凸患者髂骨生长板软骨行体外分离、培养,观察细胞形态,MTT法测定细胞增殖,Ⅱ型胶原免疫组化染色,采用逆转录聚合酶链反应检测各代细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达水平.[结果] (1) 体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加,细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形;(2) MTT比色法检测显示,第2代髂软骨细胞的生长曲线近似倒"S"形,在第4~8 d细胞呈对数生长,在9~10 d达平台期,至第11 d开始出现生长抑制.(3)第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性.(4) Ⅱ型胶原mRNA表达水平从第2代后随着传代次数的增加逐渐下降.[结论] 采用联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块共同体外培养髂软骨细胞简单、有效,P2代细胞很好的保持了软骨细胞的特性,可以作为种子细胞来源.
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腰椎间盘细胞培养方法探讨
目的寻找使椎间盘细胞更具生物学活性的培养方法.方法将25例胎儿及成人腰椎间盘细胞分为A组(足月胎儿)、B组(18~24岁)、C组(25~34岁)、D组(35~44岁)、E组(45~55岁),均分别进行单层培养和立体培养,培养检测Ⅰ、Ⅱ型胶原(CⅠ、CⅡ)的含量.结果 C、D、E组立体培养较单层培养CⅠ、CⅡ含量明显增高(P均<0.05).结论立体培养细胞具有更大的生物学活性,有助于椎间盘细胞生物学的进一步研究.
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BMSCs成软骨分化的影响因素
关节软骨缺乏血管和神经且软骨细胞包裹于软骨基质里,不易迁移到损伤区域参与修复,故其修复是一棘手过程[1]。传统外科方法疗效均不理想,探索软骨修复新方法成为目前研究热点。1994年,Brittberg等[2]成功使用自体软骨细胞移植的方法治疗软骨损伤。限于软骨细胞取材困难、来源有限,且单层培养时无法保持表型或生物学功能,制约了大规模应用。
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重视对肿瘤多细胞耐药的研究
肿瘤细胞耐药是影响化疗疗效和患者预后的主要原因之一.为克服肿瘤耐药,多年来人们对肿瘤的耐药机制进行了大量研究,并在细胞乃至分子水平有了诸多进展,这其中包括某些耐药基因(如MDR)和细胞表面蛋白(如ρ-糖蛋白和多药耐药相关蛋白等)等介导的多药耐药[1].然而针对这些耐药机制所设计的治疗方法,尽管在体外研究中非常有效,但在临床上却难以奏效,特别对实体瘤的治疗更是令人失望.因此不难想象体内情况下肿瘤作为一个细胞群集体,其生物学特性和对药物的敏感性可能与体外单层培养时的单个癌细胞有着明显的差异.
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链球菌组蛋白样蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞的损伤作用
组蛋白样蛋白(Histone-like protein,HlpA)存在于多种链球菌中,在生理状态下与细菌染色质相结合.中性粒细胞可使HlpA从菌体中释放出来[1],成为链球菌感染引起的心内膜炎、风湿性心肌炎和肾小球肾炎等疾病的一个毒力因素,在病变局部引起炎症和免疫病理反应[2].链球菌与血管内皮细胞相互作用被认为是触发多种血管内感染的重要原因[3],因此本实验观察了链球菌HlpA对单层培养人脐带静脉血管内皮细胞(Human umbilical cord veinvascular endothelial cells,HUVEC)的损伤作用.
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白藜芦醇恢复去分化正常髓核细胞表型的实验研究
目的 研究体外单层培养与藻酸盐微球立体培养对人正常髓核细胞分化的影响,并探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)恢复藻酸盐微球立体培养下去分化髓核细胞表型的调节机制. 方法 取6例腰椎爆裂骨折患者自愿捐赠的正常髓核组织分离培养髓核细胞,并行细胞鉴定;取单层培养的第1、3、5、7代髓核细胞分别行形态学观察、β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色观察细胞衰老情况及甲苯胺蓝染色观察蛋白多糖表达.分别取单层培养和藻酸盐微球立体培养的第1代髓核细胞检测细胞增殖情况.取立体培养1周的第7代髓核细胞随机分为立体培养空白组(A组)、RES组(B组)、沉默交配型信息调节子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)-小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)+ RES组(C组)、阴性对照-siRNA+RES组(D组),另设置髓核细胞单层培养空白组(E组),行相应培养后采用Western blot检测SIRT1、聚蛋白多糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原蛋白表达,实时荧光定量PCR检测SIRT1 mRNA表达水平. 结果 细胞鉴定提示培养细胞为髓核细胞.形态学观察及SA-β-ga1、甲苯胺蓝染色示,在体外连续单层培养条件下,正常髓核细胞易发生去分化,且随着传代次数增加趋势愈明显.藻酸盐微球立体培养48 h内髓核细胞增殖显著低于单层培养(P<0.05),但能显著提高去分化髓核细胞SIRT1、Ⅱ型胶原与Aggrecan蛋白的表达,E组与A组比较差异有统计学意义(P<0.05);与A组相比,B组3种蛋白表达显著提高(P< 0.05).C组SIRT1 mRNA和蛋白表达均受明显抑制,显著低于B、D组(P<0.05),Ⅱ型胶原与Aggrecan蛋白表达也显著低于B、D组(P< 0.05). 结论 连续体外单层培养条件下,髓核细胞增殖速度较快,但在培养过程中易发生去分化现象;而在藻酸盐微球立体培养条件下,RES可以恢复去分化髓核细胞表型,合成更多细胞外基质,这一机制与SIRT1的调节有关.
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纤维蛋白凝胶细胞培养模型的建立
创伤后的组织修复过程,在早期可表现为伤口收缩、肉芽组织形成及细胞外基质过度沉积等,在后期则表现为瘢痕形成及其异常增生,这些现象均与组织中成纤维细胞的生物学活动密切相关。近年来国内外学者利用细胞培养技术,在体外可控条件下对成纤维细胞进行了一系列研究,进一步丰富了创伤愈合的现代概念[1,2]。细胞培养方法主要有单层培养和立体培养法,本实验旨在建立并探讨成纤维细胞的立体培养模式。