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3D HepG2细胞药物肝毒性评价模型的建立及其在药物安全性评价中的应用
该研究采用磁悬浮3维(3D)培养技术建立了3D HepG2细胞评价模型,并应用此模型对典型的肝毒性药物进行了简单评价.HepG2细胞形成稳定3D结构后,采用免疫组化技术检测了HepG2细胞在2D,3D培养条件下的糖原储存能力,并应用RT-PCR技术对比研究了HepG2细胞在2D,3D不同培养条件下Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶、药物转运体、核受体及肝细胞特异标志性分子白蛋白(ALB)等相关基因的mRNA表达水平.免疫组化结果显示,HepG2细胞在3D培养条件下具有丰富的糖原储存能力,此特性与人肝组织相类似.此外,在3D培养条件下,HepG2细胞绝大部分药物代谢酶、转运体、核受体及ALB的mRNA表达水平与2D相比均有不同程度的上调.在药物肝毒性评价方面,该实验选用了典型的肝毒性药物对乙酰氨基酚(APAP)和近年来肝毒性报道较多的中药何首乌Polygonum multiflorum Thunb.及补骨脂Psoraleae corylifoliaL.进行单剂量和重复剂量(7 d)给药实验;在重复剂量给药实验中,3D HepG2细胞表现出更高的敏感性.应用磁悬浮3D培养技术建立的3DHepG2细胞模型无论在形态上还是功能上都更接近于人的肝组织,是较好的3D肝毒性评价模型.
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人腹膜假黏液瘤原代细胞培养及鉴定
目的 体外培养和扩增腹膜假黏液瘤(PMP)原代细胞,为腹膜假黏液瘤的研究及药物筛选提供基础.方法 用胶原酶消化法分离5例腹膜假黏液瘤样本并进行原代细胞培养,然后用染色体核型分析鉴定培养的细胞是否为肿瘤细胞;再用PAS染色检测细胞中性黏多糖;3D细胞培养模拟肿瘤在体内的状态;HE染色观察3D细胞的组织形态;裸鼠成瘤实验检测原代细胞的致瘤性.结果 PMP细胞原代培养5例均成功;2D培养的细胞贴壁增殖,形态为多边形鹅卵石样排列,可传代到18代;染色体核型分析显示大多数细胞是亚二倍体核型的肿瘤细胞;细胞PAS染色阳性,说明培养的原代细胞内含有黏液;3D培养的类器官与体内肿瘤组织形态相似;裸鼠成瘤率低,且形成的肿瘤与患者PMP相似度不高.结论 PMP原代细胞可在体外培养和扩增.
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类器官研究进展及其在胃癌中的应用
胃癌是我国主要癌肿之一,发病率和死亡率均位居全部癌症第二位.受制于研究模型的缺乏,胃癌发生机制、胃癌治疗药物开发等研究进展缓慢.类器官(Organoid)是干细胞在体外三维环境中培养所形成的细胞结构;通过体外模拟细胞在体内的生存环境,类器官技术能够高效培养原代细胞,包括正常细胞、肿瘤细胞.来自肿瘤的类器官被称为"瘤器官"(Tumoroid);瘤器官具有很高的"保真性",能够保持原肿瘤的组织细胞形态、基因组学特征和药敏特征等.由于瘤器官的重要性,全球各种瘤器官生物样本库纷纷被建立起来.在胃癌方面,德国和日本近期分别建立大样本胃癌瘤器官生物样本库,对于研究胃癌发生、胃癌个体化治疗等具有重要意义.本综述针对类器官在胃癌研究中应用的前沿研究进行总结,向大家介绍该领域内的新进展.
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体外模型在药物性肝损伤的应用进展
药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是新药研发上市后被撤市或限制使用的主要原因.由于临床表现复杂,发病率低,而且涉及化学药、中草药和膳食补充剂等种类繁多,在临床前药物筛选过程中难以有效发现药物对肝的损伤作用.国内外均在探索和研究能够预测DILI的相关体外模型,本文汇总了当前国内外DILl新体外模型研究进展,以期为致肝损伤药物早期筛选和评价模型的合理选择提供参考.
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体外肝毒性评价细胞模型的研究进展
药物性肝损伤是导致药物临床实验失败和上市后撤回的主要因素,而导致肝毒性药物进入临床实验的一个重要原因,是临床前动物模型与人类的种属差异.因此,开发新的临床前药物安全评价模型显得至关重要,临床前药物安全性评价模型中以人类肝细胞的体外培养为可靠、快速、经济的模型.本文综述了在新药研发早期安全性评价中,不同体外模型的优点和不足之处,以期为药物安全性评价模型的进一步发展提供参考.
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类器官技术在肿瘤研究中的应用与展望
背景:作为一类新型的体外模型,类器官能用于研究正常组织器官的生理特性,也能稳定地维持肿瘤细胞在体内的特征,同时可应用于抗肿瘤药物筛选和个性化治疗.目的:简述类器官技术的发展历程及现状,综述其在肿瘤研究中的应用.方法:第一作者以"类器官,肿瘤研究,3D培养,干细胞;Organoid,Three-dimensional culture,Cancer research,Stem cell"为关键词,检索2013年5月至2018年5月期间收录在CNKI、PubMed数据库中的相关文献,文献类型包括临床研究、基础研究及综述类文章,排除与文章研究目的无关及重复性的文献,终纳入47篇文献进行综述.结果与结论:肿瘤类器官为癌症研究和治疗提供了可靠的模型,特别是为个性化癌症治疗开辟了新的视野.肿瘤来源的类器官是源自组织或肿瘤特异性干细胞的三维组织细胞簇,它可模拟体内肿瘤特征及肿瘤细胞异质性.目前,科研人员通过优化各种培养条件成功产生了许多肿瘤类器官,包括结肠癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌、宫内膜/卵巢癌、子宫癌肉瘤、尿路上皮癌和肾癌等.但类器官培养具有明显的局限性,其中之一就是该模型中神经、血管及免疫细胞缺乏,这就使其不能完全表现出器官的全部特征,对于疾病过程的模拟也只能是部分重现.
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3D培养脐带间充质干细胞治疗1型糖尿病及其免疫调控机制
背景:脐带间充质干细胞可分化成胰岛β细胞用于移植治疗1型糖尿病,但需要进一步提高疗效,并研究其免疫调节机制.目的:观察3D培养的脐带间充质干细胞移植对1型糖尿病小鼠的疗效及免疫调节机制.方法:组织贴壁法分离脐带间充质干细胞并进行3D培养,扫描电镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物;采用链脲佐菌素诱导1型糖尿病小鼠模型,2D干细胞移植组和3D干细胞移植组于造模7 d后尾静脉注射脐带间充质干细胞(5×106/只),对照组和模型组小鼠注射等体积生理盐水.移植后每周检测各组小鼠空腹血糖,连续4周;移植后30 d,制备小鼠单个脾细胞悬液,流式细胞术检测T细胞亚群变化;移植后30 d, ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中细胞因子白细胞介素4,白细胞介素10,白细胞介素2,γ-干扰素水平.结果与结论:①3D 培养体系下脐带间充质干细胞生长良好,高表达细胞表面标志物 CD44,CD73、CD90和CD105;②细胞移植2-4周后,小鼠血糖水平显著下降,与模型组相比差异有显著性意义(P < 0.05);3D干细胞移植组血糖水平低于2D干细胞移植组,第4周差异有显著性意义(P < 0.05);③与模型组相比,干细胞移植组Th1细胞百分比下降,Th2细胞与Treg细胞百分比显著升高(P < 0.01);与2D干细胞移植组相比, 3D干细胞移植组Th1细胞亚群百分比降低,Th2细胞亚群和Treg细胞百分比升高(P < 0.05);④与模型组相比,干细胞移植组白细胞介素2和γ-干扰素水平降低,而白细胞介素4和白细胞介素10水平明显升高;与2D干细胞移植组相比,3D干细胞移植组白细胞介素2水平降低,白细胞介素4和白细胞介素10水平升高(P < 0.05);⑤结果表明,3D培养的脐带间充质干细胞移植治疗1型糖尿病小鼠效果优于2D培养的脐带间充质干细胞,其机制可能与上调调节性T细胞,维护体内Th1/Th2平衡相关.
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使用透明质酸钠复合海藻酸钠水凝胶球3D培养软骨细胞抑制细胞去分化的研究
目的:验证海藻酸钠(Alginate,Alg)水凝胶球添加透明质酸钠(Sodium hyaluronate,HA)后,对大鼠膝软骨细胞体外3D培养时软骨细胞去分化的抑制情况.方法:用Ⅱ型胶原酶消化法获取2周龄SD大鼠膝关节原代软骨细胞,体外培养传代至P2.细胞分为2组,l组用2％海藻酸钠水凝胶球3D培养(Alg组),另一组用2％海藻酸钠+1％透明质酸钠的水凝胶球3D培养(Alg/HA组),采用正交法制作海藻酸钠水凝胶球.培养14天后,两组各取水凝胶球进行死活细胞染色观察细胞状态.其他水凝胶球收集后用4％多聚甲醛固定,30％蔗糖溶液脱水,OCT (Optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋切片,采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态;采用阿利新蓝染色观察对比糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量;采用免疫荧光染色对比Ⅱ型胶原(Collagen type Ⅱ,Col Ⅱ)含量;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测软骨细胞Col Ⅱ和聚蛋白多糖(Aggrecan,ACAN)的表达情况.结果:死活细胞染色显示两组水凝球内软骨细胞状态良好,几乎无死细胞;阿利新蓝染色显示Alg/HA组与Alg组相比软骨细胞分泌更多的GAG;免疫荧光染色显示Alg/HA组比Alg组软骨细胞内含更多的Ⅱ型胶原;Western blot显示Alg/HA组软骨细胞比Alg组Col Ⅱ的蛋白表达更多.结论:含透明质酸钠的海藻酸钠水凝胶可以更好地维持软骨细胞的表型,抑制软骨细胞去分化.
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乳腺癌细胞三维培养耐药模型的体外构建
本研究旨在体外构建乳腺癌三维(3D)培养模型,部分模拟肿瘤细胞在体微环境,以期建立理想的乳腺癌耐药研究模型.将乳腺癌MCF-7细胞与胶原支架材料复合,体外构建乳腺癌3D培养模型.用Carmine和HE染色法观察细胞形态,用CCK-8法检测细胞增殖情况,用活-死细胞染色试剂盒观察细胞活性,检测3D培养和二维(2D)培养条件下细胞对阿霉素、卡铂、5-氟尿嘧啶的药物敏感性,实时定量RT-PCR检测耐药相关基因P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多药耐药相关蛋白2(mrp2) mRNA表达水平,用Western blot检测P-gp蛋白的表达.结果显示,3D培养组内MCF-7细胞呈聚团生长,细胞增殖及活性良好.和2D培养组相比,3D培养组细胞对化疗药物的敏感性显著降低,P-gp和mrp2 mRNA水平显著升高,P-gp蛋白水平升高至5.3倍.以上结果提示,本研究成功构建了具有耐药表型及功能的乳腺癌3D培养模型.该模型对深入阐明耐药发生相关机制等研究具有重要意义.
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Matrigel在肿瘤体内外研究模型中的应用
Matrigel是一种从Engelbreth-Holm-Swarm（ EHS）小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜成分，其主要成分包括层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白和各种细胞因子。上皮来源的肿瘤含有丰富的基底膜，并在肿瘤生长、转移和形态等方面表现出独特的作用。 Matrigel已广泛用于肿瘤研究中，本文阐述了matrigel在肿瘤体内外实验模型中的应用。研究matrigel将有助于我们加深对肿瘤本质的认识并提供更为有效的治疗靶点。
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3D培养人工皮肤组织黑色素瘤模型建立及评价
目的 建立体外人工皮肤组织黑色素瘤模型,为研究黑色素肿瘤侵袭和转移的机制及药物筛选奠定基础.方法 采用3D培养技术,制备体外人工皮肤组织黑色素瘤C8161、A375模型.应用不同浓度血清(0.5％、5％)优化模型的优培养条件.HE和免疫荧光观察该模型基底膜形成情况,检测黑色素瘤细胞C8161、A375侵袭能力.应用单层细胞培养检测细胞生长速度和细胞分泌E-钙黏素情况.采用Transwell实验检测不同黑色素瘤细胞侵袭能力.结果 体外人工皮肤组织肿瘤模型建立成功,血清浓度0.5％为佳3D培养条件.构建的人工皮肤组织肿瘤模型形成的基底膜良好,黑色素瘤细胞在此模型中发生侵袭和转移,且C8161侵袭能力强于A375细胞.侵袭力较弱的A375细胞增殖速度高于侵袭力较强的C8161细胞.C8161和A375细胞均不产生E-钙黏素.结论 成功建立体外人工皮肤组织肿瘤模型,血清浓度为0.5％为佳3D培养条件;黑色素瘤细胞的侵袭与生长速度并无直接关系,且失去E-钙黏素表达能力并不是导致肿瘤细胞侵袭的必要条件.
关键词： 恶性黑色素瘤 人工皮肤组织黑色素瘤模型 3D培养 -
脂肪干细胞联合筋膜干细胞修复大鼠骨性关节炎
目的 探讨联合使用脂肪间充质干细胞和筋膜间充质干细胞治疗大鼠骨性关节炎的效果.方法 从大鼠腹股沟处脂肪垫分离脂肪间充质干细胞、后肢骨骼肌筋膜分离筋膜间充质干细胞,经鉴定后扩增培养,两种细胞按不同比例混合,分为A组(1∶0)、B组(5∶1)、C组(1∶1)、D组(1∶5)、E组(0∶1),F(0∶0)组,总数为1×106,注射进由碘乙酸诱导的大鼠骨性关节炎关节腔内.干细胞注射治疗12周后获取各组大鼠后肢膝关节标本,分别进行大体和病理组织学评估.结果 分离的脂肪间充质干细胞、筋膜间充质干细胞CD29、CD71、CD90阳性表达,CD45阴性表达;均可以进行多向诱导分化;当两种细胞按1:1混合治疗时大体观得分:A组(4.25±0.96)、B组(4.83±1.11)、D组(4.41±0.90)、E组(4.91±0.79)、F组(5.75±1.21)均高于C组(2.92±0.79,P=0.010)、病理组织学评分A组(8.16±1.46)、B组(7.41±1.78)、D组(8.08±1.44)、E组(8.83±1.47)、F组(15.58±2.77)均高于C组(5.83±1.85,P=0.010).结论 脂肪间充质干细胞联合筋膜间充质干细胞关节混合比例为1∶1时,软骨修复效果佳.
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3D培养在神经胶质瘤研究中的应用
传统的肿瘤研究依赖于肿瘤细胞系构建肿瘤模型,并在细胞基础上测定肿瘤细胞的耐药性等,但在临床实验中大多数肿瘤药物以失败告终,其中主要的原因是细胞系不能模拟肿瘤细胞在人体内微环境的特性,3D培养技术在肿瘤研究中的应用愈加广泛.本文主要从3D培养在神经胶质瘤研究中的应用进行综述.
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3D培养牙周膜干细胞生物学特性的初步研究
目的：研究悬滴法3D培养和2D贴壁培养的牙周膜干细胞（PDLSCs）生物学特性的差异。方法：改良酶消化组织块法分离培养PDLSCs，分别行2D贴壁培养及3D培养（3D培养按不同细胞接种数分为2．5×104，5×104及1×1053组），培养96 h后分别用Live／Dead染色法分析细胞活性；流式细胞术检测干细胞表面标记物；然后对2D、3D培养的PDLSCs进行矿化诱导，茜素红染色及荧光定量PCR检测矿化结节形成情况以及矿化相关基因ALP和OPN mRNA的表达水平。结果：3D培养的PDLSCs可形成致密的细胞聚合物，2．5×104组PDLSCs细胞聚合物中心未见坏死现象，5×104组和1×105组则有较为明显坏死现象；3D和2D培养的PDLSCs间充质干细胞表面标记物的阳性表达率均无显著差异（P＞0．05）；茜素红染色和荧光实时定量PCR结果显示，3D培养的PDLSCs形成矿化结节的数量及其矿化相关基因ALP OPN mRNA的表达水平均显著高于2D培养的细胞（P＜0．05）。结论：3D悬滴培养法是一种理想的PDLSCs培养方法。
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基于水凝胶基质的肝细胞3D培养系统1
3D培养是近年来新兴的用于体外药物及毒物测试的细胞培养技术,该培养体系可高度模拟生理培养条件,从而提高细胞体外活率并延长其生存期.而作为细胞外基质成分的水凝胶材料由于以水为分散介质,能够给细胞提供完全自由的生长环境,且可人为的对其机械性能进行修饰等优势,近年来广泛应用于3D培养系统的研究.考虑到不同的凝胶材料会直接影响培养细胞的功能和活性状态,因此本综述中,我们首先介绍了用于细胞培养的常用的凝胶材料.其次,针对水凝胶构建体在肝细胞3D培养系统中的常用的体外建模方式及存在的问题做一简要介绍.
