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炎症环境下组蛋白去乙酰化对牙周膜干细胞影响的研究现状
牙周炎是口腔常见疾病,目前无有效根治办法,牙周组织中牙周膜干细胞(PDLSCs)具有较高的增值能力和多分化潜能,但是在炎性微环境下PDLSCs再生能力减弱,而组蛋组蛋白去乙酰化酶(HDACs)可以调控基因表达,维持细胞正常功能,所以,检测炎性微环境下PDLSCs中HDACs的表达和HDACs对PDLSCs免疫调节特性的影响,并利用组蛋白去乙酰化抑制剂(HDACIs),检测其在炎症微环境下骨形成能力、PDLSCs成骨分化的变化.
关键词： 牙周炎 牙周膜干细胞 组蛋组蛋白去乙酰化酶 组蛋白去乙酰化抑制剂 成骨分化 -
基质细胞衍生因子(SDF)-1对人类伴糖尿病牙周病患者的人牙周膜干细胞增殖、分化影响及其可能机制的研究
目的 针对伴糖尿病牙周病患者群体,研究基质细胞衍生因子(SDF)-1对人牙周膜干细胞增殖、分化影响及其再生修复的可能机制.方法 拟从伴糖尿病牙周病患者的炎症牙周组织分离培养鉴定牙周膜干细胞,100 ng/mL SDF-1的培养液添加与否分为两组进行比较.通过MTT法实验方法来检测细胞增殖能力;Real time PCR检测碱性磷酸酶alkaline phosphatase(ALP)表达水平来确定细胞的分化水平.结果 MTT法显示P.g+diabetes+SDF-1组中人牙周膜干细胞增殖能力提高;PCR结果显示P.g+diabetes+SDF-1组中,炎性牙周膜干细胞中的ALP mRNA表达明显增高(P<0.05).结论 对于伴糖尿病牙周病患者群体,基质细胞衍生因子SDF-1作为重要的细胞因子诱导并促进了人类牙周膜干细胞的增殖和分化,起到类似中间衔接和催化的作用.
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牙周膜干细胞的研究进展
牙周膜干细胞是存在于牙周膜组织中的一种间充质干细胞，具有高度增殖、自我更新能力和多分化潜能。牙周膜干细胞的研究对牙周组织工程和牙周组织再生具有重大意义，本文结合近年来国内外文献对牙周膜干细胞的研究进展作一综述。
关键词： 牙周膜干细胞 -
表皮生长因子Epiregulin促进牙周膜干细胞成骨分化
目的 研究表皮生长因子Epiregulin (EREG)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSC)成骨定向分化能力的影响.方法 利用EREGshRNA基因敲除EREG进行丧失性功能研究,利用重组EREG活性蛋白进行获得性功能研究.通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨分化相关基因的表达研究牙周膜干细胞体外成骨分化能力.结果 随着牙周膜干细胞向成骨分化,EREG的表达明显升高.基因敲除EREG抑制牙周膜干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨分化相关基因骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)和Osterix (OSX)的表达.人重组EREG活性蛋白增强牙周膜干细胞ALP活性和体外矿化能力.结论 表皮生长因子EREG具有促进牙周膜干细胞成骨分化的潜能,可以作为一个候选的细胞因子用于牙周组织工程技术再生牙周组织.
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脂肪干细胞对TNF-α诱导的牙周膜干细胞炎症因子表达的影响
目的 观察脂肪干细胞对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的牙周膜干细胞炎症因子表达的影响,以期为脂肪干细胞应用于牙周炎治疗提供理论指导.方法 培养、鉴定脂肪干细胞和牙周膜干细胞.采用Transwell细胞共培养系统,上、下室均接种第3代细胞.实验分3组:A组:牙周膜干细胞对照组,上、下室均接种牙周膜干细胞;B组:肿瘤坏死因子-α诱导组,上、下室均接种牙周膜干细胞,下室加入10ng/mL肿瘤坏死因子-α;C组:肿瘤坏死因子-α联合脂肪干细胞干预组,上室脂肪干细胞,下室牙周膜干细胞,下室加入10 ng/mL肿瘤坏死因子-α.逆转录聚合酶链反应检测牙周膜干细胞白介素-6、白介素-8和肿瘤坏死因子-α的mRNA表达.结果 B组较A组白介素-6、白介素-8和肿瘤坏死因子-α的表达均增加,且均在2h时达到峰值(P〈0.05).2h时C组较B组白介素-6、白介素-8和肿瘤坏死因子-α的表达明显下降(P〈0.05).结论 脂肪干细胞能抑制TNF-α诱导的牙周膜干细胞的炎症反应.
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人与犬牙周膜干细胞的生长特性比较
目的:培养、分离人与犬牙周膜下细胞(PLSCs),比较其生长特性,为相关体内研究提供理论和实验依据.方法:采用免疫磁珠分选系统分别从原代培养的人与犬牙周膜细胞中分离PLSCs,通过倒置相差显微镜、细胞计数、集落形成检测、流式细胞仪等方法比较人与犬PLSCs的细胞形态、生长曲线、集落形成率(CFR)及STRO-1+表达情况.结果:人与犬PLSCs形态相似,均为梭形,生长曲线也都旱"S"形.但CFR人PLSCs显著高于犬PLSCs(P<0.05),而且人牙周膜中STRO-1+细胞的表达率高于犬牙周膜中STRO-1+细胞(P<0.05).结论:STRO-1+免疫磁珠分选系统可用于分离人和犬PLSCs,所分离的两种PLSCs的形态和体外生长模式相似,但细胞亚群增殖能力和表型有差异.
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牙周膜干细胞的表型分析
目的:分析人牙周膜干细胞(PDLSCs)的表型特点,为分离、鉴定和应用PDLSCs提供有效途径.方法:采用免疫磁珠法分离PDLSCs,制备细胞爬片.分别采用免疫荧光、免疫细胞化学染色法检测PDLSCs表面蛋白STRO-1、CD44、Vimentin、CK、COL-Ⅰ、BSP的表达.收集PDLSCs,采用RT-PCR法检测PDLSCs Scleraxis mRNA、Col Ⅰ及CAP mRNA的表达情况.结果:PDLSCs表达间充质干细胞表面标志STRO-1、CD44,强阳性表达间充质来源细胞表面蛋白Vimentin,弱表达Col-Ⅰ,不表达上皮细胞标志蛋白CK、成骨细胞相对特异性蛋白BSP.RT-PCR也显示PDLSCs表达韧带组织特异性基因Scleraxis和Col-Ⅰ,不表达成牙骨质细胞特异性蛋白CAP.结论:本实验所分离的PDLSCs具有间充质来源的、牙周组织特异性的、未分化细胞的表型特点,该特点可作为PDLSCs分离和鉴定的重要依据.
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犬牙周膜干细胞用于附着龈组织工程化再生的实验研究
目的:探讨牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)复合脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)对犬附着龈缺损模型再生修复效果,评估其用于附着龈缺损治疗的可行性.方法:原代培养犬PDLSCs,采用免疫磁珠法分离PDLSCs,将Brdu标记的PDLSCs与生物支架材料ADM复合,体外培养5天后植入犬附着龈缺损模型部位.8w时大体测量修复前后附着龈宽度、面积,Brdu免疫组化标记细胞的迁移、分化及转归,组织学观察PDLSCs-ADM复合物修复再生犬附着龈缺损效果.结果:PDLSCs-ADM复合体移植后8w,新生附着龈呈粉红色,与原黏膜组织形成明显界限,其宽度及面积增加量明显高于对照组.组织学结果显示ADM-PDLSCs组上皮结构类似正常附着龈,为复层鳞状上皮,但上皮钉突粗大、圆钝,无角化层.固有层血管、细胞成分较对照组明显增多,胶原纤维丰富.免疫组化显示ADM-PDLSCs组Brdu标记的阳性细胞在上皮基底层及黏膜下层表达,而ADM对照组无表达.结论:PDLSCs复合ADM较ADM单独使用能显著提高犬附着龈缺损修复效果,本实验为牙龈缺损的生物再生修复提供了有效途径.
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SiRNA沉默β-catenin对人牙周膜干细胞增殖能力的影响
目的:研究小干扰RNA(siRNA)干扰β-catenin基因表达对人牙周膜干细胞增殖能力的影响.方法:分离培养人牙周膜干细胞(periodontal ligament tissue-derived mesenchymal stem cells,PDLSCs).应用β-catenin基因的siRNA转染PDLSCs,荧光显微镜下观察转染后细胞形态,流式细胞仪检测转染后GFP细胞表达率.流式细胞仪分析转染后细胞周期,用实时定量PCR技术检测转染后β-catenin、LEF-1、Cyclin D1 mRNA表达.结果:RNA干扰β-catenin处理PDLSCs 24小时后可特异并有效地抑制β-catenin基因的表达.siRNA抑制β-catenin使PDLSCs“S”期细胞减少,“G0,G1”期细胞增多;LEF-1及Cyclin D1 mRNA表达水平显著降低.结论:β-catenin siRNA可特异性抑制PDLSCs细胞中β-catenin基因表达,并明显抑制细胞增殖.
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炎症微环境下线粒体融合蛋白2及其介导的内质网-线粒体偶联对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响
目的 探讨内质网与线粒体偶联及线粒体融合蛋白(mitofusion 2,Mfn2)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSC)成骨分化能力的影响,为促进牙周炎患者牙周组织再生提供理论基础和治疗靶点.方法 刮取正常及牙周炎牙齿(由第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科门诊收集)的牙周膜组织,用原代和有限稀释法单克隆化培养健康来源的(health,H)PDLSC (H-PDLSC)及炎症来源的(periodontitis,P)PDLSC(P-PDLSC),透射电镜及细胞器特异性荧光染色检测内质网-线粒体偶联水平;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测两种来源PDLSC中Mfn2的表达差异;用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)模拟炎症微环境,分别应用正常培养基及含5、10 mg/L TNF-α的培养基培养H-PDLSC,设为H-PDLSC组、H-PDLSC+TNF-α (5 mg/L)组和H-PDLSC+TNF-α(10 mg/L)组,培养7 d后qPCR检测Mfn2表达水平;通过小干扰RNA Mfn2(siMfn2)下调P-PDLSC中Mfn2的表达,成骨诱导液培养7 d后qPCR检测成骨因子的表达差异,培养28 d后茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量检测各组矿化结节形成差异.结果 透射电镜下观察内质网与线粒体偶联结构,与H-PDLSC组(偶联长度/线粒体周长为0.23±0.07、偶联长度/内质网周长为0.18±0.05)相比,P-PDLSC组中内质网线粒体偶联水平显著增加(偶联长度/线粒体周长为0.55± 0.10、偶联长度/内质网周长为0.44±0.08)(P<0.01);特异性荧光染色检测内质网与线粒体共定位显示,P-PDLSC组内质网与线粒体共定位系数(0.71±0.09)显著高于H-PDLSC组(0.40±0.10)(P<0.01).P-PDLSC组Mfn2表达量(1.46±0.10)显著高于H-PDLSC组(0.99±0.08)(P<0.01);H-PDLSC+TNF-α (5 mg/L)组及H-PDLSC+TNF-α(10 mg/L)组Mfn2表达量均显著高于H-PDLSC组(P<0.01).成骨诱导7 d qPCR结果显示,P-PDLSC+siMfn2组碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2及骨钙蛋白mRNA表达量均显著高于对照组(P<0.01),28 d茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量结果与qPCR结果一致.结论 炎症微环境下PDLSC的内质网-线粒体偶联增加,线粒体融合蛋白Mfn2表达量升高导致PDLSC成骨分化能力下降,其具体机制还需进一步研究.
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炎症微环境作用下经典及非经典Wnt通路平衡对牙周膜干细胞成骨分化的调控作用
目的 探讨炎症微环境作用下经典Wnt/β-联蛋白(β-catenin)与非经典Wnt/Ca2+通路的平衡对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSC)成骨分化的调控作用.方法 收集解放军总医院口腔科2015年3至6月因治疗需要拔除的前磨牙和第三磨牙8颗及慢性牙周炎牙齿8颗,培养慢性炎症组织来源的PDLSC (PDLSC from patients diagnosed as periodontitis,P-PDLSC)与正常组织来源的PDLSC (PDLSC obtained from a healthy microenvironment,H-PDLSC).RNA干扰转染β-联蛋白至H/P-PDLSC,观察细胞状态并用蛋白质印迹法检测转染效果.实时定量PCR技术检测转染后Runt相关转录因子2 (Runt-related transcription factor 2,Runx2)、β-联蛋白及Nemo样激酶(nemo like kinase,NLK) mRNA表达.成骨诱导3d后蛋白质印迹法检测Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)和NLK的表达,免疫荧光检测CaMKⅡ的表达.结果 蛋白质印迹法检测RNA干扰24 h抑制H/P-PDLSC siRNA β-联蛋白转染组中β-联蛋白的表达.成骨诱导3d后实时定量PCR结果显示,P-PDLSC siRNA β-联蛋白组Runx2(4.553±0.659)显著高于P-PDLSC空质粒转染组(1.918±0.315)(P=0.000),NLK mRNA表达(7.341±1.331)亦显著高于空质粒转染组(5.664±0.792)(P=0.030);与之相应的是蛋白质印迹法检测P-PDLSC siRNA β-联蛋白组与P-PDLSC空质粒转染组相比CaMKⅡ、NLK蛋白表达水平上升.免疫荧光检测结果显示,成骨诱导后H-PDLSC及P-PDLSC siRNA β-联蛋白组CaMKⅡ表达增强且高于H/P-PDLSC空质粒转染组.结论 炎症微环境作用下经典/非经典Wnt通路在PDLSC成骨分化过程中均发挥重要作用,抑制β-联蛋白可增强非经典Wnt/Ca2+通路,促进干细胞的成骨分化.
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牙周内源性再生的策略与展望
牙周病等多种原因造成的牙周支持结构( periodontal supporting apparatus)破坏或丧失是成年人失牙的首要原因,牙周病的治疗和牙周缺损的修复是学者们共同关注的课题,目前还没有哪一种临床治疗方法可以实现真正意义上的牙周组织生理性和功能性再生[1-3].自2004年Seo等[4]从人牙周膜组织中成功分离出牙周膜干细胞( periodontal ligament stem cells,PDLSC)以来,利用干细胞移植技术修复牙周组织缺损已成为牙周组织再生研究的主要策略[3].值得注意的是,无论是动物体内的临床前期研究,还是牙周病患者的临床病例报告,干细胞移植均取得了令人振奋的结果[5-10].然而,干细胞移植需要高标准的体外细胞培养条件、严格的调控措施和复杂的操作规程,其临床转化面临着巨大的人力、物力与财力的挑战,特别在一些非致死性疾病(如牙周组织缺损)的治疗上,"取,,与"舍"仍然存在争议[11].随着干细胞生物学研究的不断深入,利用干细胞在体内的运动和迁移机制,诱导患者自身干细胞募集和"归巢"( cell homing)促进牙周组织自我修复再生有望解决体外干细胞培养与移植面临的"转化困难",具有广阔的研究前景和临床应用空间[12-14].
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碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子对人牙周膜干细胞体外增殖、迁移和黏附的影响
目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对体外培养的人牙周膜于细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSC)增殖、迁移和黏附能力的影响,探讨两种生长因子促牙周再生的相关机制.方法 体外培养人PDLSC,分为A组:2％胎牛血清+α-低必需培养基(α-minimum essential medium,α-MEM)(对照1组)；B组:20 μg/L FGF-2+A组；C组:10 μg/L VEGF+A组；D组:20 μg/L FGF-2+10 μg/L VEGF+A组；E组:10％胎牛血清+α-MEM(对照2组)；F组:20 μg/L FGF-2+E组；G组:10 μg/L VEGF+E组；H组:20 μg/L FGF-2+ 10 μg/L VEGF +E组,按分组要求施加刺激,第1、3、5、7天用可溶性噻唑盐法观察两种生长因子在不同体积分数的胎牛血清中对PDLSC增殖能力的影响；根据增殖实验结果重新分组:对照组:10％胎牛血清+ α-MEM;FGF-2组:20 μg/L FGF-2+对照组；VEGF组:10 μg/L VEGF+对照组；FGF-2+ VEGF组:20 μg/L FGF-2+ 10 μg/L VEGF+对照组,流式细胞仪、细胞黏附实验、划痕损伤愈合迁移实验观察细胞周期、迁移、黏附能力的变化.结果 在2％胎牛血清中,FGF-2和VEGF促增殖效果均不明显；在10％胎牛血清中,刺激第3、5、7天FGF-2组A值(分别为1.22±0.17、2.15±0.19、2.72 ±0.11)均显著高于对照组(分别为0.76 ±0.16、1.25±0.06、1.64 ±0.09) (P ＜0.01),但第5、7天A值均显著低于FGF-2+VEGF组(分别为2.46±0.17、3.18±0.27)(P＜0.05),第5、7天VEGF组A值(分别为1.66±0.05、2.13±0.13)显著高于对照组,但显著低于FGF-2组(P＜0.05)；流式细胞仪结果示VEGF组增殖指数[(34.3±2.0)％]显著低于FGF-2[(46.8±3.2)％]和FGF-2+VEGF组[(45.0±4.0)％],但显著高于对照组[(14.5±1.7)％](P＜0.01).细胞迁移实验结果示FGF-2组与对照组迁移至创伤区的细胞数比值差异无统计学意义(P＞0.05)；细胞黏附实验结果示FGF-2组黏附细胞数比值(79±4)显著高于VEGF组(62±4)(P＜0.05).光镜下观察示FGF-2组细胞在材料表面形态好于未加FGF-2组.结论 FGF-2和VEGF均可呈时间依赖性促进PDLSC增殖,二者联合应用有一定协同作用;FGF-2促PDLSC黏附能力较VEGF强；VEGF可促进细胞向创伤部位迁移.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子2 血管内皮生长因子类 牙周再生 牙周膜干细胞 -
低氧对人牙周膜干细胞骨向分化影响的实验研究
基因,如碱性磷酸酶、骨钙素和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的表达,从而抑制了人牙周膜干细胞骨向分化.
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影响牙周膜干细胞生物学特性的生物学因素
牙周膜干细胞(PDLSC)存在于牙周膜组织中,是一种具有高度增殖、自我更新能力和多向分化能力的间充质干细胞,在维持牙周组织动态平衡和缺损修复的过程中发挥重要作用,被认为是牙周组织工程和再生医学的关键种子细胞之一.近年来的研究发现,多种因素可调节其干细胞特性,本文结合近年来国内外文献对影响牙周膜干细胞生物学特性的生物学因素作一叙述,并展望其在未来干细胞治疗中的应用前景.
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两种培养条件对牙周膜干细胞生物学特性影响的对比研究
目的:对比无血清培养基和含血清培养基对原代培养、分离的人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)生物学特性的影响,为基于hPDLSCs的临床应用研究和药物试验奠定基础.方法:分别用含血清和无血清培养基培养分离hPDLSCs,倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞增殖能力;流式细胞仪分析细胞表型;免疫荧光染色、real-time PCR检测PDLSCs成骨、成脂分化诱导后相关特异性蛋白及基因表达.结果:采用无血清与含血清培养条件原代培养分离的hPDLSCs形态相似;但无血清培养基组细胞增殖力更强;两种培养条件培养的hPDLSCs表型相似,均表达CD105、CD44、CD166、CD73和CD90,不表达CD45、CD3、CD14、CD38、HLA-DR、CD31和CD34;且阳性表达vimentin、α-SMA和N-cadherin,阴性表达CK18和E-cadherin.无血清培养条件培养的hPDLSCs具有成骨、成脂潜能,且诱导效能强于含血清培养者.结论:无血清培养基能够在体外培养扩增hPDLSCs,并维持其干细胞特性.采用无血清培养条件培养hPDLSCs可能更适合其在细胞治疗和实验研究中应用.
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糖原合成酶激酶3β对炎症状态下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响
目的：探讨炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的变化及糖原合成酶激酶3β(glycogen synthesis kinase,GSK3β)对其成骨分化能力的影响。方法：培养正常及慢性牙周炎组织来源的牙周膜干细胞(H-PDLSCs,P-PDLSCs)，将两种PDLSCs体外成骨诱导7d，实时定量PCR检测细胞Runx2、 ALP、 OCN的基因表达水平， Western Blot检测p-GSK3β， GSK3β的蛋白表达情况。在成骨诱导时使用GSK3β特异性抑制剂LiCl刺激PDLSCs， ALP染色、 RealTime PCR检测PDLSCs成骨分化的情况。结果： P-PDLSCs的成骨化能力显著低于H-PDLSCs。 P-PDLSCs组p-GSK3β表达较H-PDLSCs组增高，成骨诱导后，两种PDLSCs中p-GSK3β表达降低，但GSK3β总蛋白表达水平增高。 LiCl抑制GSK3β后PDLSCs的ALP活性、 Runx2和OCN表达水平显著降低。结论：在慢性炎症微环境中， GSK3β的磷酸化可影响Wnt信号通路，抑制牙周膜干细胞的成骨分化。
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牙周膜干细胞向成骨细胞方向分化实验
目的:探讨人牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cell,PDLSCs)向成骨细胞定向分化潜能,从细胞、分子和基因水平分析矿化诱导过程中细胞形态、功能变化.方法:将免疫磁珠分离的人PDLSCs矿化诱导,通过倒置显微镜观察诱导细胞形态变化,ELISA法检测诱导细胞碱性磷酸酶活性(ALPase)、RT-PCR、Western blot及免疫化学染色分析其成骨相关基因、蛋白表达变化,茜素红染色法检测其矿化结节形成情况来诱导细胞做对照.结果:矿化诱导14d,细胞形态呈成骨样短突起、多角形改变,诱导7d、14d ALPase活性显著增强.21d,诱导细胞高丰度表达骨桥素(OPN)、骨钙素(OCN)、牙骨质附着蛋白(CAP)及Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)mRNA,而对照组只有COL Ⅰ mRNA弱表达.同时,Western blot及免疫化学染色均显示诱导细胞分泌骨涎蛋白(BSP).21d,仅诱导组形成大量矿化结节.结论:人PDLSCs在矿化液诱导下可向成骨细胞分化,具有成骨细胞的形态、表型和功能特点,有望成为牙周及种植体周围骨缺损修复再生的理想的种子细胞.
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炎症微环境作用下非经典Wnt/Ca2+信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响
目的:探讨非经典Wnt钙离子信号通路在慢性牙周炎组织来源的牙周膜干细胞中的表达及其对炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响.方法:收集解放军总医院口腔科因治疗需要拔除的无龋前磨牙、第三磨牙及慢性牙周炎牙齿,培养正常及炎症微环境下的牙周膜干细胞(H-PDLSCs,P-PDLSCs).成骨诱导3d后采用免疫荧光检测CaMKⅡ在细胞内的表达.H-PDLSCs,P-PDLSCs成骨诱导7d后实时定量PCR检测CaMKⅡ、NLK和Runx2 mRNA表达水平,同时采用Western blot检测两种细胞成骨诱导7d后Runx2、ALP、CaMKⅡ、和NLK的表达.结果:免疫荧光结果显示在H-PDLSCs及P-PDLSCs的对照组中CaMKⅡ均有弱阳性表达,成骨诱导3d后两组细胞中CaMKⅡ的表达增强.实时定量PCR结果显示常规培养条件下CaMKⅡ、Runx2在H-PDLSCs与P-PDLSCs中的表达不存在显著性差异,当成骨诱导后其在两组中的表达量显著增高,但H-PDLSCs组显著高于P-PDLSCs组.P-PDLSCs中NLK的表达水平显著高于H-PDLSCs,成骨诱导后两种组织来源细胞中NLK mRNA的表达水平均有显著性升高但H-PDLSCs组显著高于P-PDLSCs组.非经典信号通路的关键蛋白CaMKⅡ、NLK在成骨诱导7d后其表达水平升高,成骨关键蛋白Runx2及ALP的表达趋势与之一致,但P-PDLSCs低于H-PDLSCs.结论:在慢性炎症微环境中非经典Wnt信号通路参与牙周膜干细胞的成骨分化,Wnt/Ca2+通路中CaMKⅡ、NLK蛋白与干细胞成骨分化正相关.
关键词： 牙周膜干细胞 炎症 成骨分化 Wnt非经典信号通路 -
Wnt5a在炎症微环境下的牙周膜干细胞中的作用研究
目的:研究Wnt5a在炎症微环境作用下的牙周膜干细胞(periodontal stem cells,PDLSCs)中的作用.方法:有限稀释法分离获取PDLSCs并进行干细胞鉴定;实时定量qPCR检测正常PDLSCs组及炎症因子组(10ng/ml TNFα预刺激24h)炎症因子TNFα及IL-1β的mRNA表达水平;实时定量qDCR检测两组成骨诱导前后成骨基因Runx2、ALP的mRNA表达水平、Wnt5a的mRNA表达水平;Western Blot检测两组成骨诱导前后Wnt5a的蛋白表达水平.结果:炎症因子组与正常组的克隆形成率无显著性差异、炎症因子组TNFα mRNA表达水平IL-1β mRNA表达水平显著高于正常组(P＜0.05);常规培养条件下,炎症因子组Runx2、ALPmRNA表达水平与正常组无显著性差异,成骨诱导后成骨基因表达水平正常组显著高于炎症组,(P＜0.05);常规培养条件下,炎症因子组Wnt5a mRNA表达水平高于正常组(P＜0.05),成骨诱导后正常组及炎症因子组Wnt5a mRNA表达水平均显著高于常规培养条件;Western Blot结果示,Wnt5a蛋白表达量正常组diff(成骨诱导后)、炎症因子组undiff(成骨诱导前)、炎症因子组diff分别为正常组undiff的1.2709倍、1.8246倍、2.2176倍.炎症因子组Wnt5a蛋白表达水平增加,成骨诱导后两组Wnt5a蛋白表达水平均增加,炎症因子组高于正常组.结论:在炎症微环境下,PDLSCs的炎症因子表达增加,成骨能力降低,Wnt5a mRNA及蛋白表达水平均增加,Wnt5a非经典通路可能通过与经典Wnt通路的交通等参与PDLSCs炎症及破骨的过程.
