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吲哚胺2，3双加氧酶对免疫的调节作用
1963年，Shimizu 等［1］分离出 IDO，发现其在哺乳动物体内分布广泛，在各种肝外组织中都有 IDO 的存在，尤以胎盘和肺中表达多。IDO 与肝内的 L-色氨酸2，3-双加氧酶（TDO）催化的反应相同。IDO 以超氧阴离子（O2-）作为辅助因子，酶解吡咯环，生成 N-甲酰犬尿氨酸和犬尿氨酸。其底物主要包括D-色氨酸、5-羟色氨、5-羟-L-色氨酸和 L-色氨酸，动力学研究表明其适底物是 L-色氨酸。TDO 仅表达在哺乳动物肝脏，底物仅限于色氨酸［2］。人类 IDO 分子量约42kD，pI ＝69，由403个氨基酸残基组成［3］。IDO 基因启动子长1245bp，含有2个干扰素刺激反应元件（ISRE），这2个 ISRE 阳序列间隔1kb 它们在 IFN-γ诱导 IDO 基因转录中必不可少。
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色氨酸-犬尿氨酸代谢中间产物对结核病患者T细胞免疫的影响
目的 明确结核病患者T细胞亚群的失衡状况,以期发现色氨酸(TRP)-犬尿氨酸(KYN)代谢中间产物对T细胞亚群的影响,以解释结核病患者T细胞亚群发生变化的可能机制.方法 结核病患者来源于首都医科大学附属北京胸科医院2012年9月至2012年12月期间,经细菌学、病理学和影像学检查明确诊断为肺结核的患者,无合并糖尿病等其他合并疾病,共104例,经数字表法随机抽样选取45例作为试验组;健康对照患者来源于同期北京市昌平区结核病防治所的健康体检志愿者,共100名,经数字表法随机选取其中39名作为健康对照组.采用流式细胞分析方法检测试验组和健康对照组的血细胞中调节性T细胞(Treg细胞)和T辅助细胞17(Th17)的水平;进一步通过体外添加TRP及其代谢中间产物KYN和喹啉酸(QA)来刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞,观察其对细胞凋亡的影响,分析TRP及其代谢中间产物对T细胞分化的影响.采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,流式细胞分析结果所获数据符合方差齐性和正态分布,以“-x±s”表示,采用t检验进行统计学分析,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 与健康对照组[(0.41±0.26)％]相比,试验组的Treg细胞的比率[(1.49±0.82)％]显著上升(t=33.64,P=0.000),而Th17的比率[健康对照组(0.73±0.43)％、试验组(1.04±0.72)％]虽有所上升,但差异无统计学意义(t=44.46,P=0.071).体外细胞刺激试验发现:高浓度的KYN(2.0 mmol/L)对CD4+T淋巴细胞[健康对照组(8.40±3.28)％、试验组(30.07±7.37)％;t=7.49,P=0.000]和CD8+T淋巴细胞[健康对照组(15.31±1.88)％、试验组(26.36±1.09)％;t=4.89,P=0.003]具有明显的诱导凋亡作用.对CD4+T淋巴细胞而言,添加高浓度的TRP(2.0 mmol/L)和QA(2.0 mmol/L)后,试验组TRP和QA的细胞凋亡比率分别为(6.66±0.96)％和(6.85±0.43)％,与健康对照组(8.40±3.28)％和(8.40±3.28)％相比略有减少,但差异无统计学意义(t=6.42,P=0.189;t=8.21,P=0.107);对CD8+T淋巴细胞而言,添加高浓度的TRP(2.0 mmol/L)和QA(2.0 mmol/L)后试验组的细胞凋亡比率分别为(16.48±4.75)％和(17.18±2.07)％,与健康对照组(15.31±1.88)％和(15.31±1.88)％相比,凋亡比率略有增加,但差异无统计学意义(TRP:t=7.41,P=0.238;QA:t=8.02,P=0.121).结论 Treg细胞的含量在结核病患者中有明显的升高.TRP-KYN途径代谢中间产物KYN能够影响CD4+T和CD8+T淋巴细胞凋亡,推测通过这种细胞凋亡的途径促进了T细胞分化.
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脑出血患者犬尿氨酸代谢产物与超敏C反应蛋白的关系
色氨酸(TRP)作为人体的必需氨基酸之一,在体内可在吲哚氨2,3-双加氧酶(IDO)的作用下降解为犬尿氨酸(KYN),KYN可在犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)作用下生成犬尿喹啉酸(KYNA),或在犬尿氨酸羟化酶作用下生成喹啉酸(QA).QA可产生神经毒性作用,而KYNA可有效地拮抗兴奋性氨基酸对脑组织的损伤.脑出血患者体内KYN与KYNA的代谢情况国内未见报道,本研究旨在探讨脑出血患者体内犬尿氨酸代谢变化情况及其与炎性标志物超敏C反应蛋白(hsCRP)之间的相互联系.
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犬尿酸代谢途径异常与中枢神经系统疾病
犬尿氨酸代谢途径（kynurenine pathway，KP）是脑内色氨酸代谢的重要通路。该通路由不同代谢产物及酶系构成，受促炎介质和激素等影响，通过激活或改变通路中代谢产物的合成，调控神经递质释放与功能执行。近些年研究发现，多种中枢神经系统疾病的理化改变与该通路代谢紊乱相关。本文将重点介绍 KP 组成及其代谢产物的生理功能，并就 KP 与部分中枢神经系统疾病的研究进展作一综述。
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色氨酰tRNA合成酶(TTS)的免疫调节作用
近年来,在自身免疫性疾病、移植排斥和抗肿瘤免疫中,免疫系统的过度激活和免疫耐受逐渐成为研究关注的热点.大量研究证实,吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)是催化色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶,其高表达在抑制T细胞免疫、诱导肿瘤免疫耐受中发挥重要的调节作用[1-2].研究显示,另一种色氨酸代谢酶——色氨酰tRNA合成酶(tryptophanyl-tRNA synthetase,TTS,TrpRS)能够催化色氨酸与其对应的tRNA结合,增加细胞内色氨酰tRNA储备,对抗IDO介导的色氨酸消耗,参与机体的免疫调节过程,与多种自身免疫性疾病及恶性肿瘤的发生、发展和预后密切相关,但其具体的调控机制尚未完全阐明.现就TTS参与的色氨酸代谢过程及其免疫调节作用作一综述.
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液相色谱-质谱联用技术同时定量检测结核病患者中多种色氨酸代谢产物及其临床意义
目的建立液相色谱-质谱联用（ LC-MS）同时测定血清中色氨酸及其代谢产物---犬尿氨酸、喹啉酸、吡啶酸、邻氨基苯甲酸浓度的定量的方法，并探讨结核分枝杆菌感染的患者体内色氨酸代谢的变化及其与机体免疫之间的关系。方法先利用标准化合物摸索测定条件并建立标准化合物浓度与峰面积的线性关系，再对100例健康体检者和104例结核病患者血清进行色氨酸、犬尿氨酸、吡啶酸、喹啉酸、邻氨基苯甲酸定量检测，并通过犬尿氨酸/色氨酸比值来评估代谢过程中的酶活性。结果色氨酸及其代谢产物的血清浓度和性别、年龄因素均无明显相关性。结核病患者组色氨酸浓度为（41.810±16.539）μmol/L，显著低于健康对照组[（47.898±10.821）μmol/L，P＜0.01]。结核病患者血清犬尿氨酸浓度为（2.341±0.934）μmol/L，显著高于健康组（1.699±0.352）μmol/L；结核病患者血清的喹啉酸含量为（9.141±8.747）μmol/L，较对照组（2.364±1.369）μmol/L显著上升（P＜0.01）；与健康对照组吡啶酸[（0.121±0.070）μmol/L]和邻氨基苯甲酸[（0.147±0.023）μmol/L]相比，结核病患者组血清吡啶酸、邻氨基苯甲酸浓度并没有明显变化；结核病患者犬尿氨酸/色氨酸比值为（6.28±3.36）％，相比健康人[（3.65±0.83）％]有显著提高（P ＜0.01）。结论体内色氨酸-犬尿氨酸途径代谢活性的显著增强和结核分枝杆菌的感染有关，并且结核感染还造成色氨酸下游代谢产物犬尿氨酸、喹啉酸的蓄积现象，由此可能影响结核病患者机体的免疫功能。
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氨基酸分析仪测定血清中犬尿氨酸和色氨酸的应用价值
Trp是机体必需的氨基酸之一,Kyn是Trp为重要的中间代谢产物之一.研究发现,Kyn代谢异常与多种疾病,包括抑郁症、帕金森综合征等神经精神疾病、免疫失调、异常妊娠等的发生和发展密切相关~[1-2].血液和组织液中Trp和Kyn的检测将为这些疾病诊断治疗、病情监测及发生机制研究提供有效的试验支持~[3].目前尚鲜见用氨基酸自动分析仪检测Kyn的报道,这可能与氨基酸自动分析仪标准分析程序~[4]不能将Kyn和Trp分开有关.本研究通过改进日立L-8800型氨基酸自动分析仪缓冲液洗脱程序,建立同时测定人血清中Kyn和Trp的检测方法.
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健康国人血清犬尿氨酸和犬尿氨酸/色氨酸含量比值参考值范围的建立
目的 建立我国正常人血清犬尿氨酸(KYN)及犬尿氨酸/色氨酸含量(KT)比值参考值范围.方法 采用高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)检测86名健康成人血清KYN和色氨酸 (TRP)含量,并计算KT比值.结果 正常成人血清KYN为0.364～3.022 μmol/L,平均(1.426±0.542) μmol/L, KT比值为11.008～47.528 mmol·L-1·M-1,平均(29.271±9.315) mmol·L-1·M-1.不同年龄组之间,血清KYN、TRP含量及KT比值差异均无统计学意义(P＞0.05);性别之间,血清KYN、TRP含量及KT比值差异均有统计学意义(P＜0.05) .结论 建立了健康国人KYN及KT比值参考范围,为相关疾病的辅助诊断、疗效观测及发病机制等研究提供相应参数.
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HPLC-UV检测法同时测定血浆色氨酸和犬尿氨酸的方法学研究
目的 建立一种同时测定血浆中Trp和Kyn浓度的HPLC-UV检测法.方法 以3-硝基酪氨酸(3-N-Tyr)为内标,采用Agilent Hypersil ODS色谱柱进行分离.流动相中醋酸缓冲液( 15 mmol/L,pH 5.5):乙腈为94∶ 6(v/v)；流速为0.8 ml/min；柱温:25℃；紫外程序化检测波长:0～4 min,360 nm；4～5 min,302 nm.选取2010年9-12月重庆市九龙坡区第一人民医院15例慢性乙型肝炎患者、8例慢性肾炎患者、10例血小板减少性紫癜患者以及15名健康体检者,用该方法检测其血浆Trp、Kyn水平并计算Kyn/Tp比值；各指标在上述4组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK法.结果 Kyn与Trp的保留时间分别为2.9 min和4.4 min,线性范围分别为0.44～18.30μmol/L和3.67～470.00 μmol/L,检测限分别为0.014 μmol/L和0.122 μmol/L.Kyn与Trp的日内变异均小于3％,日间变异均小于4％.平均回收率均在92.29％～104.40％之间.用该方法测定临床标本,健康对照组、慢性肾炎组、血小板减少性紫癜组以及慢性乙型肝炎组血浆中Kyn浓度分别为(1.59±0.28)、(2.73±0.56)、(2.69±0.44)和(1.54±0.48) μmol/L,Trp浓度分别为(59.8±10.0)、(46.1±11.7)、(58.5±8.0)和(41.4±13.1)μmol/L,Kyn/Trp比值分别为(0.027 4±0.007 5)、(0.061 6±0.0165)、(0.0467±0.0091)和(0.038 3±0.007 5),差异均有统计学意义(F值分别为23.734,8.463和20.921,P均＜0.01).结论 所建立HPLC-UV检测法可同时测定血浆中Kyn和Trp浓度,适合于临床检测.
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高效液相色谱法在类风湿关节炎患者血清TRP和KYN检测中的应用与临床价值
目的 探讨高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FLD)同时测定血清色氨酸(TRP)和犬尿氨酸(KYN)对诊断类风湿关节炎(RA)的临床意义.方法 血清标本加等量5%(V/V)高氯酸溶液去除蛋白,离心取上清液20 μl,直接进样分析.色谱柱为HpemilC_8柱(300 mm×6.0 mm i.d,10 μm);流动相为0.25 mol/L醋酸锌和50 mmol/L醋酸溶液(含3%乙腈),流速为1.5 ml/min;0～10 min荧光检测器的激发波长和发射波长分别为365 nm和480 nm,10 min后激发波长和发射波长分别变换为254 nm和404 nm.同时,用该方法测定120名健康成人和110例RA患者血清TRP、KYN和TRP/KYN比值(K/T),并评价其诊断RA的敏感度、特异度和方法学效能.结果 血清标本的KYN和TRP保留时间分别为8.1和11.5 min,两者分离良好.KYN线性范围为0.098 ～19.600 μmol/L,低检测浓度为0.04 μmol/L;回收率为90.8%～96.2%,日内变异系数为3.68%,日间变异率为4.97%.TRP的线性范围为4.9～196.0μmol/L.低检测限为0.005 μmol/L,回收率为92.6～106.9%,13内变异系数为3.63%,日间变异系数为4.44%.在本试验的色谱条件下测定苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、犬尿喹啉酸(KYNA)、5-羟色胺(5-HT)和Cr均无干扰.RA组患者血清KYN含量和K/T比值[(2.06±0.38) μmol/L和(55.46±5.81)×10~(-3)]与健康对照组[(1.51±0.35)μmol/L和(32.54 ±9.00)×~(-3)]比较,均显著升高(U=3 251.0,t=10 741,P均为0.000),而RA组TRP含量[(38.24±5.27)μmol/L]与健康对照组[(47.52±5.79)μmol/L]比较,则显著降低(t=10.399,P=0.000).K/T比值诊断RA的敏感度、特异度分别为83.6%(92/110)、85.8%(103/120).结论 HPLC-FLD同时测定血清TRP和KYN的方法精密度、回收率、抗干扰能力、线性范围等均符合临床检测要求.K/T比值可作为RA的辅助性诊断指标.
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犬尿氨酸代谢与血压调节
色氨酸犬尿氨酸代谢通路涉及一系列酶促反应,生成多种具有生物活性的化合物,参与许多病理生理过程.近年来发现其代谢途径中犬尿氨酸酶、犬尿氨酸氨基转移酶的催化反应产物可能与血压的调节有关.本文就目前色氨酸犬尿氨酸代谢通路与血压调节关系的相关研究进行论述.
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犬尿氨酸通路相关物质在大鼠慢性脑低灌注致认知障碍中的作用
目的：观察慢性脑低灌注大鼠海马组织中干扰素-γ、TNF-α、诱导型 NO合酶（iNOS）、吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸（KYN）的表达，探讨慢性脑低灌注致认知功能损害大鼠海马组织中KYN通路相关代谢产物的变化特点。方法选择Wistar大鼠30只，随机分为假手术组15只和双侧颈总动脉永久性结扎组（2VO组）15只。制作慢性脑低灌注大鼠模型，Morris水迷宫检测2VO大鼠空间学习与记忆能力变化，免疫组织化学检测大鼠海马CA1区iNOS、干扰素-γ和TNF-α的表达，ELISA法检测IDO及KYN的水平。结果与假手术组比较，2VO组大鼠第3天开始逃避潜伏期明显延长，平台象限游泳距离百分比明显减少，iNOS、干扰素-γ及TNF-α阳性表达，IDO和KYN水平明显升高[（4．73±0．21）ng/ml vs （0．89±0．06）ng/ml和（1．55±0．12）ng/ml vs （0．19±0．02） ng/ml ，P＜0．05]。结论慢性脑灌注大鼠的病理生理过程包含着炎性反应，而炎性反应的发生很可能刺激了IDO和KYN的高表达，KYN和IDO的蓄积有可能参与其导致认知障碍的过程。
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吲哚胺2,3-二加氧酶抑制剂对慢性脑低灌注大鼠认知功能损害的行为学改善
目的 观察使用吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)抑制剂后慢性脑低灌注大鼠认知功能损害的行为学改善,及血犬尿氨酸(KYN)、犬尿喹啉酸(KYNA)水平的变化.方法 雄性Wistar大鼠30只,随机分为假手术组,对照组和IDO抑制剂组,各10只,后2组采用改良的永久性双侧颈总动脉结扎术制作慢性脑低灌注大鼠模型.Morris水迷宫检测大鼠空间学习与记忆能力变化,高效液相色谱-荧光检测法检测血KYN、KYNA的水平,免疫组织化学检测大鼠海马CA1区IFN-γ、TNF-α表达.结果 与假手术组比较,对照组IFN-γ、TNF-α表达明显升高(P＜0.05);与对照组比较,IDO抑制剂组大鼠第4、5天逃避潜伏期缩短,平台象限游泳距离百分比增加,KYN[(15.33±0.90)μmol/L vs(1.69±0.94)μmol/L]及KYNA[(39.51±3.81)μmol/L vs (25.66±6.80)μmol/L]水平明显降低(P＜0.05),但IFN-γ、TNF-α表达无显著差异(P＞0.05).结论 IDO抑制剂不影响炎性因子表达,但可减少血KYN及KYNA表达,可改善慢性脑低灌注所致的认知功能损害的空间学习及记忆能力.
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芳香烃受体在色氨酸代谢调节免疫中的作用
芳香烃受体(AhR)是一种配体依赖性胞内受体,配体种类多样,根据来源可分为外源性和内源性配体.不同配体结合并激活AhR,可使AhR转位至核上,调节下游基因如细胞色素P450家族基因CYP1转录活动,在介导病理过程和维持机体正常发育与生理功能中发挥着重要作用.色氨酸(Trp)代谢产物是一类主要的内源性配体.犬尿氨酸(Kyn)作为Trp代谢的主要产物,与AhR相互作用后可影响免疫细胞分化与活性,调节机体适应性免疫应答,发挥抑制抗肿瘤免疫的作用.近年来Kyn在移植免疫中的作用也越来越引人瞩目.本文将对AhR在Trp代谢调节免疫中作用的研究进展进行综述.
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芳香烃受体在肿瘤发生及免疫治疗中的作用
目的 芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)是配体激活型的转录因子,是在研究致癌物二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)的毒性和致癌作用过程中发现的一种蛋白.本文总结AhR在肿瘤发生、进展等过程的作用以及调控IDO1/TDO2-KYN-AhR信号转导通路在肿瘤治疗中的潜力.方法 应用澳大利亚昆士兰大学图书馆英文数据库、PubMed数据库及CNKI中文期刊全文数据库,以“aryl hydrocarbon receptor”、“tryptophan 2,3 dioxy-genase”、“indoleamine 2,3 dioxygenase 1”和“tumor therapy”等作为英文关键词,以“芳香烃受体”、“犬尿氨酸”、“色氨酸2,3-二加氧酶”、“吲哚胺2,3-二加氧酶1”和“肿瘤治疗”等作为中文关键词,检索2000-01-01-2018-1-01的相关文献.纳入标准:(1)芳香烃受体与肿瘤发生、进展关系的研究性文献;(2) IDO1/TDO2-KYN-AhR通路与肿瘤治疗的文献.排除标准:(1)中文非核心期刊的文献和英文非SCI收录的文献;(2)结果重复且相对陈旧的实验研究.终选择47篇文献纳入分析.结果 AhR可以被内源性激活促进肿瘤的发生和进展;临床试验和动物试验结果表明,以IDO1/TDO1-KYN-AhR信号通路为靶点,通过应用IDO1抑制剂和犬尿氨酸酶可以激活免疫应答、抑制肿瘤的生长,通过应用拮抗剂可以抑制AhR的激活发挥抗癌作用.结论 AhR在肿瘤发生、进展过程中具有重要的作用,调控AHR通路可能成为肿瘤治疗的新靶点.
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3-羟基犬尿氨酸对白内障发展的影响
3-羟基犬尿氨酸具有神经毒性和致膀胱癌作用，近发现其在白内障的发生、发展中起重要作用，导致对3-羟基犬尿氨酸及其一系列化合物的研究近逐渐盛行。3-羟基犬尿氨酸可以放大氧化应激反应，修饰晶状体蛋白，改变细胞膜的流动性，其进一步代谢物具有黄色荧光使晶状体染色；同时其形成的紫外线滤过膜可以滤过紫外线保护视网膜，但滤过过程中造成的氧化压力和对晶状体蛋白的修饰与白内障的发病和发展密切相关。本文就其研究现状和前景作扼要综述。
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液相色谱串联质谱法测定人血清色氨酸及其代谢产物的浓度
目的 建立人血清中色氨酸、犬尿氨酸、喹啉酸浓度测定的液相色谱串联质谱法.方法 以甲醇为提取剂,用蛋白沉淀法.色氨酸、犬尿氨酸以犬尿氨酸-13C4,15N为内标,色谱柱:Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为甲醇-水(45∶55,均含5 mmol· L-1甲酸铵-0.1％甲酸);喹啉酸以喹啉酸-d3为内标,色谱柱:Eclipse plus C8柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm),流动相:甲醇-水(15∶85,0.75 mmol·L-1甲酸铵-0.4％甲酸);流速:0.5 mL·min-1,柱温:35℃;电喷雾离子源,以正离子多反应监测.考察该方法的专属性、标准曲线和定量下限、精密度与回收率、基质效应和稳定性.结果 色氨酸、犬尿氨酸、喹啉酸的线性范围分别为1000～3×104,100 ～ 3000,10～300 ng·mL-1;定量下限分别为1000,100,10 ng·mL-1;平均回收率均在80％以上,日内、日间精密度RSD均小于15％.结论 本方法操作简便,灵敏度高,分析快速,符合生物样品分析要求,适用于人血清中色氨酸及其代谢产物的浓度测定.
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应用受试者工作特征曲线评价犬尿氨酸诊断子痫前期重度的价值
目的：探讨犬尿氨酸对子痫前期重度的诊断价值。方法：选择2010年11月~2011年10月在我院产科住院的子痫前期重度患者30例为研究对象，以同期住院的正常妊娠妇女90例为对照组。采用高效液相色谱-紫外法检测孕妇外周血犬尿氨酸含量，应用受试者工作特征曲线分析犬尿氨酸对子痫前期重度的诊断价值，以灵敏度与特异度之和大化原则计算出诊断的佳临界值。并以灵敏度，特异度，阳性预测值，阴性预测值等指标评价此界值。结果：正常妊娠组孕妇外周血犬尿氨酸浓度为1.15±0.31μg/ml，而子痫前期重度组为0.63±0.14μg/ml，两者比较有显著差异（P＜0.05）。通过绘制受试者工作特征曲线显示犬尿氨酸诊断子痫前期重度的曲线下面积为0.923，诊断的佳临界值0.98μg/ml以此界值诊断的灵敏度100%，特异度75.6%，阳性预测值0.577，阴性预测值1.0。结论：犬尿氨酸是诊断子痫前期重度的一项良好指标。
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吲哚胺2,3-双加氧酶对免疫系统双向调节作用的研究进展
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是一种含铁血红素单体蛋白,是肝脏外唯一可以催化色氨酸(Tryptophan,TRP)中的吲哚环氧化裂解,并沿犬尿氨酸(L-kynurenine,KYN)途径代谢的限速酶.目前的研究认为,IDO不仅可以介导色氨酸的代谢,而且还具有免疫调控作用.这种调控早发现于妊娠时的胎盘合体滋养层细胞,通过抑制母体T淋巴细胞的反应[1],提高母胎免疫耐受,有利于妊娠维持.
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基于吲哚胺2,3-双加氧酶1活性评价人间充质干细胞免疫调控功能的吸光光度法的建立及优化
目的 建立一种基于吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)的活性快速评价人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)免疫调控功能的吸光光度法,并进行优化.方法 以含干扰素γ(interferon γ,IFNγ)的完全培养基激活hMSCs,收集hMSCs培养上清,与三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)和对二甲氨基苯甲醛(paradimethylaminobenzaldehyde,PDAB)反应,检测A492值,通过标准曲线计算样品中色氨酸代谢产物犬尿氨酸(kynurenine)的含量,以反映hMSCs所分泌IDO1的酶代谢活性,并对方法中的培养体系(6、12、24、48、96孔板)、IFNγ处理时间(4、8、12、24 h)、培养基使用量(150、200、250、300、350、400、450及500μl)及IFNγ作用浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、5.0及10.0 ng/ml)进行优化.同时验证方法的特异性,并检测样品保存条件及液氮冻存后不同复苏时间对kynurenine浓度的影响.采用优化后的方法分析不同来源、不同代次的hMSCs分泌IDO1的能力.结果 确定佳检测条件为:培养体系为48孔体系,IFNγ处理时间为24 h,培养基使用体积为200μl,IFNγ作用浓度为10.0 ng/ml.该方法可特异性检测IDO1的活性;除常温外,其他样品保存条件对检测结果影响较小;液氮冻存后复苏24 h可检测到与冻存前水平相当的kynurenine.该方法可有效判断不同供体来源的hMSCs在分泌IDO1功能上的差异.结论 该方法可快速、特异、稳定地检测hMSCs分泌IDO1的水平,且操作简便,可用于快速评价hMSCs的免疫调控功能.
