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  • SEPS1基因对内毒素所致脓毒症小鼠的肝脏保护作用

    作者:苏茂生;何蕾;姚咏明;于燕;吴瑶

    目的 研究SEPS1基因对内毒素所致脓毒症小鼠的肝脏保护作用.方法 30只小鼠随机分为脓毒症组、非特异干扰组、特异干扰组,每组各10只.实验前12 h非特异干扰组静脉转染scrambled siRNA,特异干扰组转染SEPS1 siRNA.实验当天3组动物腹腔内注射内毒素10 mg/ks制作脓毒症模型.分别于12 h、24 h留取标本检测血ALT、AST,肝组织细胞因子TNF-α、IL-6含量,肝组织SEPS1蛋白表达及病理学改变.结果 脓毒症小鼠肝脏有不同程度的损伤,表现为ALT、AST含量升高,24 h时特异干扰组高于脓毒症组(P<0.05);细胞因子IL-6和TNF-α水平明显升高,24 h时特异干扰组高于脓毒症组(p<0.05);Western Blot检测肝组织SEPS1蛋白表达显示:特异干扰组12 h时和24 h时表达均较脓毒症组减弱.免疫组化法显示:SEPS1蛋白12 h和24 h时表达均较脓毒症组减弱.病理显示:12 h和24 h时均为特异干扰组肝细胞病变严重.结论 SEPS1基因表达的下调与脓毒症小鼠肝脏功能损害加重相关,推测SEPS1基因对内毒素攻击所致脓毒症小鼠肝脏具有保护作用.

  • GRP78在蛋白酶体抑制剂诱导卵巢癌细胞凋亡中的作用

    作者:唐隽;刘川;都伟;王军

    目的:探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在蛋白酶体抑制剂诱导卵巢癌细胞凋亡中的作用.方法:对3种卵巢癌细胞系SKOV3、A2870和CAOV3分别设空白对照组和不同蛋白酶体抑制剂处理组;对SKOV3细胞分别转染GRP78小干扰RNA(siRNA)和随机序列核酸siRNA组.利用蛋白酶体抑制剂MG132(5 μmol/L)、PSI(20 nmol/L)和EPOX(10 nmol/L)作用3种细胞系,实时定量PCR和Western blot检测各组细胞GRP78 mRNA和蛋白表达.MTT和流式细胞术检测细胞活力和凋亡率.结果:各种蛋白酶体抑制剂均增加卵巢癌细胞中GRP78 mRNA和蛋白表达水平.当GRP78 siRNA靶向沉默GRP78表达后,蛋白酶体抑制剂作用后SKOV3细胞活力明显降低.结论:GRP78诱导表达干扰蛋白酶体抑制剂抗卵巢癌活性;沉默GRP78基因表达可提高蛋白酶体抑制剂对卵巢癌细胞的杀伤作用.

  • siRNA治疗原发性肝癌研究进展

    作者:高红强

    原发性肝细胞癌(PHCC)在世界范围内居常见肿瘤的第五位.近年来,随着分子生物学、免疫学、基因治疗学的发展,小干扰RNA(siRNA)以其特有的生物学特性及潜在的生物医学应用价值在PHCC治疗研究中成为热点.本文从siRNA的分子机制、原发性肝癌基因治疗原理及siRNA治疗肝癌的问题与展望几个方面做一阐述.

  • 基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

    作者:郑玉玲;田力

    目的:构建基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)小干扰RNA慢病毒表达载体并转染肝星形细胞T6观测其转染效率及对TIMP-1 mRNA的沉默效应.方法:用PCR扩增在线确定的TIMP-1特异性小干扰RNA序列,与T载体连接,用BamHI和XhoI分别双酶切并将其粘末端亚克隆入pRNAT-U6.2,用pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR鉴定并测序;包装产生TIMP-1 pRNAT-U6.2/lenti siRNA的慢病毒表达载体,将其转染T6细胞,荧光照相及FQ-PCR检测转染效果及TIMP-1 mRNA表达.结果:TIMP-1pRNAT-U6.2/Lenti siRNA慢病毒表达载体可显著抑制T6 TIMP-1 mRNA表达.结论:成功构建能高效转染真核细胞的TIMP-1 pRNAT-U6.2/Lenti siRNA病毒表达载体,为进一步研究其在体抑制TIMP-1 mRNA表达提供了实验工具.

  • 柑橘类黄酮对Neuromedin U2受体的激活效应及siRNA干扰分析

    作者:王道庆;郑旭煦;殷钟意;郭莉霞;邓小红;陈刚

    目的:利用NMU2R稳定细胞株和阴性细胞株并通过siRNA干扰分析筛选柑橘类黄酮中对NMU2R有激活效应的物质.方法:利用NMU2R细胞考察9种柑橘黄酮对NMU2R的激活效应,然后针对激活效应较高的柑橘类黄酮,分别用阴性细胞和NMU2R的siRNA干扰分析来排除假阳性干扰.结果:柑橘类黄酮中的橙皮苷和川陈皮素能有效激活NMU2R,橙皮苷和川陈皮素的效能、半效浓度、效价强度分别为4.688,318.970 μmol·L-1,200.933 μmol·L-1和4.758,5.832 μmol·L-1,3.124μmol·L-1.结论:柑橘类黄酮中的橙皮苷和川陈皮素都对NMU2R有激活效应.川陈皮素的半效浓度较低,具有药用开发价值.

  • Survivin特异小干扰RNA表达载体构建及对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

    作者:刘黎明;陈昌杰;陈正徐;段光军;胡华成

    目的 测定Survivin特异小干扰RNA(siRRA)表达载体对肺腺癌细胞A549 Survivin基因表达的抑制及对增殖和凋亡的影响.方法 构建Survivin特异性小干扰RNA表达载体,转染A549细胞,筛选出稳定表达的细胞株.用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法、Western blot和免疫组化法检测Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 经测序鉴定证实成功构建Survivin-siRRA表达载体.Survivin基因mRNA表达量下降76.4%,Western blot显示蛋白表达下降84.5%,免疫组化法也显示Survivin蛋白表达下降.MTT法测定细胞增殖较对照组减慢(P<0.01),细胞凋亡率较对照组增加8.95%(P<0.01).结论 Survivin特异siRRA表达载体下调Survivin基因表达,抑制A549细胞的增殖,促进凋亡.

  • PKCα siRNAs有效序列的筛选及其对肺癌A549细胞的作用

    作者:严玉霞;蒋建伟;黄志宏;林春兰;张小鹰;吴风云

    目的 探讨人蛋白激酶Cα(PKCα)小干扰RNA(siRNA)对肺癌A549细胞生长增殖及凋亡的影响.方法 设计并化学合成6条PKCα siRNAs,转染A549细胞,通过改良MTY法及RT-PCR筛选;对3条效果较好的PKCαsiRNAs,进一步采用克隆形成抑制实验、Hoechst 33258染色、PI单染和Annexin V/PI双染以及Western blot检测.结果 6条PKCa siRNAs均显著下调了PKCα mRNA水平;除No.5 siRNA外,其他5条siRNA均显著地抑制了A549细胞增殖(P<0.05).3条效果较好的PKCα siRNAs转染组PKCα蛋白的表达显著下调,克隆形成抑制率、亚二倍体百分率和早期凋亡细胞比例均显著高于对照组(P<0.05),并出现了核固缩、边聚和裂解等凋亡形态学变化.结论 本实验发现3条能显著抑制A549细胞增殖并诱导其凋亡的PKCα siRNAs.

  • siRNA沉默EGFR表达减轻大鼠脑出血后脑损伤

    作者:钱红;刘理静;谢明;武衡;刘双喜;武斌;向海

    目的 探讨siRNA沉默表皮生长因子受体(EGFR)表达对大鼠脑出血后脑损伤的影响及相关机制.方法 以Ⅶ型胶原酶注入苍白球构建大鼠脑出血模型,予10 μL空病毒载体或EGFR siRNA慢病毒表达载体侧脑室注射,进行神经功能评分,应用HE染色观察脑组织病理改变,干湿重法测定脑组织含水量,免疫组织化学染色测定脑组织中EGFR表达,荧光实时定量PCR分析神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) mRNA水平,Western blot检测EGFR、GFAP、信号传导蛋白和转录激活物3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达.结果 随着脑出血时间的延长,血肿周围脑组织EGFR表达逐渐上调,第7天达到高峰(P<0.01).与模型组比较,EGFR siRNA缓解脑组织病理损害,减少神经功能评分、脑组织含水量,并降低血肿周围脑组织EGFR、GFAP及p-STAT3表达水平(P<0.01).结论 EGFR基因沉默通过阻碍STAT3磷酸化抑制星形胶质细胞活化,进而减轻大鼠脑出血后脑损伤.

  • CXCR4-siRNA表达载体的构建及其对体外乳腺癌细胞侵袭能力的影响

    作者:冯俊飞;董坚;洪敏;高嫦娥

    目的 构建趋化因子受体(CXCR4)小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,研究其对体外乳腺癌细胞侵袭能力的影响.方法 选择CXCR4高表达的乳腺癌MDA-MB-231细胞系,设计合成人CXCR4基因不同靶点的能编码siRNA的2条双链DNA序列,克隆到真核表达载体pGE-1-U6/kna中构建siRNA表达载体,体外脂质体介导转染MDA-MB-231细胞,用Western blot分析CXCR4蛋白表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力.结果 成功构建了CXCR4-siRNA表达载体,瞬时转染乳腺癌细胞后能显著降低CXCR4的蛋白表达,可有效抑制人类乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力.结论 CXCR4-siRNA表达载体通过降低CXCR4基因的蛋白表达能显著抑制人类乳腺癌细胞的侵袭能力,有望为乳腺癌转移的基因治疗开辟新途径.

  • 重组siRARγ腺病毒构建及其对小鼠肝脏祖细胞分化的影响

    作者:周建武;何昀;龚梦嘉;毕杨

    目的 构建并筛选小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒载体,并探讨抑制RARγ表达对小鼠肝脏祖细胞分化的影响.方法 设计3对特异性针对小鼠RARγ基因的siRNA序列,体外退火形成双链,与SfiⅠ酶切后的pSES-HUS质粒连接,随后在BJ5183中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组获得pAd-siRARγ重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装腺病毒Ad-siRARγ.腺病毒感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot检测RARγ的表达,1 μmol/L ATRA诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色检测肝脏细胞分化的状态.结果 PCR、酶切鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,测序结果与设计的siRNA序列一致.腺病毒在HEK293细胞中包装10 d可见红色荧光细胞的云雾状扩增,HP14.5d细胞的48 h腺病毒感染率为60%.其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑制小鼠HP14.5d细胞中RARγ的表达(P<0.05).ATRA可诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色阳性细胞明显高于对照组,Ad-siRARγ2,3可显著抑制ATRA诱导的小鼠HP14.5d细胞的ALB表达和糖原合成能力(P<0.05).结论 成功构建并筛选出能有效抑制RARγ表达的siRNA腺病毒,感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d能显著抑制ATRA诱导的肝细胞成熟分化.

  • Haxl基因及其特异性小干扰RNA对人胚肾293细胞凋亡的影响

    作者:龙琳;刘力

    目的 构建Haxl基因特异性小干扰RNA(sihax),检测sihax对Haxl基因的表达抑制,在293细胞中研究Haxl和Haxl siRNAs对细胞凋亡的影响.方法 设计Haxl siRNA序列构建真核表达载体并转染到293细胞,倒置荧光显微镜下观察、流式细胞仪、AnnexinV-EGFP/PI双染法及RT-PCR检测靶基因Haxl的表达,以及293细胞的凋亡.结果 成功构建了Haxl siRNA干扰质粒pBS/U6-sihaxA和pBS/U6-sihaxB,并且sihaxB对Haxl抑制效应明显强于sihaxA.过量表达Haxl可显著抑制293细胞的早期凋亡比例.用sihaxA和sihaxB抑制内源性Haxl表达,可使晚期细胞凋亡比例从对照的9.03%±0.473%分别增加到10.8%±0.513%(P<0.05)和16.6%±0.858%(P<0.01).与此同时,sihaxB还可使早期细胞凋亡比例由37.3%±0.5%降低到32%±1.77%(P<0.01).结论 HaM siRNA对靶基因Haxl的抑制作用与靶序列的保守性有一定相关性.Haxl基因在细胞中参与凋亡相关的多种调节过程.本研究为进一步探讨Haxl功能奠定了基础.

  • 下调人高迁移率族蛋白1对人前列腺癌细胞PC-3的影响

    作者:宋登新;陈安民;郭风劲;谢柏臻;廖晖;朱波;陈超

    目的 研究小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对PC-3侵袭和转移的影响.方法 构建真核表达载体Pgenesil-1/HMGB1 siRNA,转染PC-3细胞系,通过RT-PCR和Westem blot检测HMGB1的mRNA及蛋白;通过细胞划痕、transwell 和明胶酶谱分析检测PC-3体外侵袭能力.结果 成功构建siRNA表达载体Pgene-sil-1/HMGB1 siRNA,可使PC-3细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),并能有效抑制PC-3体外侵袭和转移活性(P<0.05).结论 应用siRNA技术能有效的抑制基因的表达,同时也能有效抑制PC-3细胞的体外侵袭和转移,为肿瘤的生物学治疗提供了新思路.

  • FAK基因的RNA干扰对肝星状细胞生物活性的影响

    作者:安君艳;张晓岚;姚冬梅;敦志娜;解淑蕊;郝礼森

    目的 探讨靶向黏着斑激酶(FAK)基因的短发卡状RNA(shRNA)对大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化与增殖的影响.方法 分别设计2对有小发卡结构的DNA序列及1对非特异对照序列,构建重组质粒载体,经阳离子聚合物介导转染HSC-T6细胞.通过real-time PCR与Western blot进行筛选鉴定,改良MTr法观察细胞增殖,Westernblot检测HSC活化的标志物α-SMA的表达.结果 shRNA1、shRNA2均能抑制FAK mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中shRNA2对FAK基因抑制率达76.82%,且可明显抑制HSC-T6细胞α-SMA的表达及细胞增殖.结论 靶向FAK基因的shRNA可以抑制HSC-T6细胞的活化与增殖.

  • 哺乳动物中介导RNA干扰的载体研究进展

    作者:龙香娥;龚朝辉

    RNA干扰是指利用双链RNA诱导同源靶基因的mRNA降解,从而抑制特异基因表达的过程.近年来,RNA干扰技术作为一种工具在哺乳动物基因功能研究方面发展十分迅速.本文综述了有关在哺乳动物中介导RNA干扰的载体研究新进展及其应用.

  • RNA干扰的体内应用研究进展

    作者:安君艳;张晓岚

    RNA干扰是由双链RNA引发的序列特异性基因沉默现象,目前已成为体外实验中抑制基因表达的首选方法 .在体内实验中,近年也已经发表了上百篇将siRNA运用于哺乳动物的研究,说明RNA干扰同样可成为体内实验的强有力工具,并有望成为一种有效的疾病治疗手段.本文就RNA干扰体内实验中的影响因素、实验设计及近年研究进展等进行综述.

  • 小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究

    作者:马鹏鹏;葛晔华;郭睿;马静;陈平;薛社普;韩代书

    目的研究siRNA表达载体在体外培养细胞中对目的基因的干扰作用,建立利用RNA干扰技术研究基因功能的平台.方法构建针对β-actin基因的表达siRNA载体,转染HeLa细胞,然后在mRNA水平、蛋白水平和细胞形态水平评价siRNA表达载体对β-actin基因表达的抑制作用.结果siRNA表达载体可以有效的抑制体外培养细胞β-actin基因的表达,使β-actin基因的mRNA和蛋白表达量显著下降,细胞形态发生显著变化.结论siRNA表达载体可以在体外培养细胞中有效的沉默β-actin基因,为研究基因功能提供了一个快速、有效的系统.

  • 应用表达载体介导siRNA抑制乳腺癌细胞MCF-7血管内皮生长因子-C基因的表达

    作者:孙平;刘艳丽;赵毅玲;李丽;刘执玉

    目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌细胞系MCF-7血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达的抑制作用. 方法 设计合成一对编码后可形成小发夹结构针对VEGF-C基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建VEGF-CsiRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染MCF-7细胞,半定量RT-PCR和免疫组织化学技术检测转染前后MCF-7细胞VEGF-C基因表达的变化. 结果 PCR和DNA测序证实,携带VEGF-CsiRNA表达载体构建成功,VEGF-C基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P<0.05),在mRNA水平其表达抑制率为61.8%;在蛋白表达水平其表达抑制率为78.3%. 结论 本研究构建的VEGF-CsiRNA表达载体可有效抑制MCF-7细胞VEGF-C的mRNA和蛋白表达,为进一步以VEGF-C为靶点的乳腺癌治疗实验研究奠定了基础.

  • 鞘内注射突触后致密蛋白95siRNA对神经病理性疼痛大鼠脊髓CaMKⅡα活性的影响

    作者:许力;喻洁;申乐;李旭;黄宇光

    目的 探讨突触后致密蛋白95(PSD-95)基因沉默对神经病理性疼痛模型大鼠脊髓Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)表达及活性的影响.方法 用化学合成针对大鼠PSD-95基因的siRNA转染神经母细胞瘤/大鼠神经胶质细胞瘤杂交瘤细胞(NG108-15细胞),并观察干扰效果.选取91只成年SD大鼠随机分为3组:Naive组、假手术组(sham)与坐骨神经慢性缩窄损伤(CCI)手术组.CCI组大鼠进一步被分为4个亚组,分别于CCI术后第5天开始鞘内注射生理盐水(Control组)、转染试剂(Vehicle组)、阴性对照(mmRNA组)和PSD-95基因特异siRNA(siRNA组).连续给药3d,各组大鼠分别于鞘内给药后第1、3、7天评估机械缩足反射阈值(MWT)的改变,并留取腰4~6脊髓节段标本,以Western blotting方法观察脊髓背角PSD-95、CaMKⅡα蛋白表达水平及活性的变化.结果 大鼠PSD-95基因特异的siRNA可以有效地沉默NG108-15细胞中PSD-95基因表达.与生理盐水治疗组相比,鞘内注射PSD-95特异siRNA 3d后,大鼠脊髓背角PSD-95蛋白水平明显降低(P<0.05),CCI大鼠神经病理性疼痛得到明显缓解(P<0.05),同时脊髓背角pThr286 CaMKⅡα蛋白水平受到明显抑制(P<0.05),而总CaMKⅡα蛋白水平无明显变化(P>0.05).结论 PSD-95基因特异的siRNA可被成功导入大鼠中枢神经系统,引起脊髓PSD-95基因沉默,在缓解病理性疼痛的同时可抑制神经损伤导致的脊髓CaMKⅡα磷酸化水平的增加,阻断中枢敏化相关的信号通路.

  • 脑脂结合蛋白基因沉默抑制体外大鼠星形胶质细胞增殖

    作者:李浩明;杨清清;彭敏;秦建兵;韩笑;成翔;金国华

    目的 探讨脑脂结合蛋白(BLBP)对体外培养的星形胶质细胞增殖能力的影响.方法 在体外培养大鼠星形胶质细胞的基础上,应用小干扰RNA(siRNA)沉默细胞内源性BLBP的表达后,Real-time PCR和Western blotting分别检测BLBP及c-Myc基因和蛋白的表达变化;随后采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)试剂检测细胞活力,Ki67免疫荧光标记增殖状态的细胞,并用流式细胞术检测细胞周期的变化.结果 应用siRNA沉默星形胶质细胞内源性BLBP的表达后,BLBP基因和蛋白的表达量明显下降,原癌基因c-Myc的表达水平也显著下调;BLBP基因沉默能够抑制细胞的活力并减少Ki67阳性细胞的数量;流式细胞术检测后发现,BLBP表达不足能够减少S期细胞的比例.结论 BLBP基因沉默能够抑制体外培养的星形胶质细胞的增殖能力,BLBP在星形胶质细胞的增殖过程中发挥调控作用.

  • 应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究

    作者:郝冉;杨雅平;杨静;王少华;诸欣平

    为研究旋毛虫Ts87基因的功能,通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达.针对Ts87基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达.此外,测定RNA干扰作用下的肌幼虫体外存活率的变化.根据实时荧光定量P(=R结果,dsRNA及siRNA均能有效抑制Ts87基因mRNA的表达.此外,两种RNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率.实验表明,RNA干扰技术能够有效抑制旋毛虫功能基因Ts87表达,从而为研究旋毛虫基因的功能提供一种新的有效途径.

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