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2005～2007年中国食品中疑似O157大肠埃希菌的鉴定及毒素基因的检测
目的 对中国2005-2007年食源性疾病监测网分离疑似0157大肠埃希菌进行鉴定,了解各种不同类型监测食品中大肠埃希菌0157的分布及毒力基因的携带情况.方法 运用API20E生化试剂条进行初步鉴定,使用血清分型和PCR方法确定菌株,并检测毒力基因.结果 (1)通过API20E生化初步鉴定共获得154株疑似0157大肠埃希菌.(2)通过血清学方法和特异基因的检测.共确定89株大肠埃希菌0157,其中42株是0157:H7(47%),其余的菌株为0157:NM和0157:hund(未确定型).(3)毒力基因的检测:42株0157:H7和6株0157:NM携带eaeA+hlyA基因;共29株菌携带stx基因,主要分布在不发酵山梨醇0157:H7菌株中.(4)监测的生羊肉、生牛肉、生猪肉、生鸡肉、蔬菜沙拉等食品中均检出了携带stx基因的0157:H7.结论 鉴定结果显示中国部分监测食品中均分离到有一定程度致病力的大肠埃希菌0157.
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我国食品中大肠埃希菌O157耐药及PFGE分子分型特征分析
目的 了解我国食品中分离的110株大肠埃希菌O157的耐药及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型特征,完善我国食品中大肠埃希菌O157菌株特征的基础信息,为该菌的风险评估提供依据.方法 使用琼脂稀释法对确认的110株大肠埃希菌O157进行药敏试验,完成耐药特征的分析.参照美国疾病预防控制中心PulseNet试验方法,对110株大肠埃希菌O157,运用XbaⅠ酶进行酶切并完成PFGE分析,利用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析.结果 ①110株菌中,43株菌至少对一种抗生素有抗性.耐药率多的前三种抗生素依次是四环素(30.0％,33/110),磺胺甲恶唑(29.1％,32/110),萘啶酸(26.4％,29/110);②一共有24个耐药谱,耐两种以上抗生素的菌株有34株,耐3种以上抗生素的多重耐药菌株有32株.常见的三种耐药谱依次是SMX(6),AMP-NAL-SMX-SXT-TET(6),AMP-CHL-NAL-SMX-SXT-TET(4)/AMP-SMX-SXT-TET(4)/TET(4);③大肠埃希菌O157非H7(O157∶ hund)对所测试的抗生素的耐药率明显高于大肠埃希菌O157∶ H7(x2 =72.010 P ＜0.05).其中37株携带了志贺毒素基因的大肠埃希菌O157∶H7仅对磺胺甲恶唑(2.7％,1/37)、萘碇酸(2.7％,1/37)有耐药,没有多重耐药菌株;④通过不同种类食品中大肠埃希菌O157菌株耐药率比较发现,从生猪肉、生禽肉中分离的菌株耐药率相对高于其他食品种类;⑤PFGE分子分型研究显示菌株具有基因多态性,且可以很好将大肠埃希菌O157非H7和大肠埃希菌O157∶H7菌株区分开.结论 我国食品中分离的大肠埃希菌O157耐药现象严重.我们应加强养殖环节和零售环节食源性致病菌,特别是大肠埃希菌O157(包括产志贺毒素大肠埃希菌O157)菌株药敏特征的监测,探明食品与养殖环节菌株耐药的传播关系,并为国家制定科学的养殖业抗生素用药提供依据.
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2005-2007年我国食品中大肠埃希菌O157分离株tccP1基因的分布研究
目的 了解我国2005-2007年食源性疾病监测网分离的大肠埃希菌O157分离株中tccP1基因的分布情况及特点.方法 对89株食源性大肠埃希菌O157分离株运用PCR方法进行检测.结果 tccP1基因的阳性率为55.1%.结论 tccP1基因广泛存在于O157:H7大肠埃希菌中,在O157:非H7中检出率很低.其分布与eaeA基因的携带情况具有一定的相关性,与志贺毒素基因携带没有相关性.
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东台市肠出血性大肠埃希菌O157感染监测
目的为掌握肠出血性大肠埃希菌O157在东台市家禽、家畜中的带菌,腹泻病人中的感染和自来水厂水源水中的污染情况.方法2000-2002年,分别在流行季节采集家禽、家畜和腹泻病人粪便及自来水厂水源水,应用免疫磁珠浓集、山梨醇麦康凯平板分离、生化和血清学反应进行鉴定.结果3年间东台市采集的6种动物粪便有4种中检出肠出血性大肠埃希菌O157,其阳性率牛为11.32%、羊为10.58%、猪为9.35%、鸡为7.73%.腹泻病人的阳性率为1.57%.采集的178份自来水厂水源水、60只苍蝇标本中均未分离出肠出血性大肠埃希菌O157.3株自动物粪便分离株具有至少2种混合型毒力基因.75株肠出血性大肠埃希菌O157菌株对15种抗生素存在不同的耐药率.结论东台市家禽、家畜和腹泻病人中存在肠出血性大肠埃希菌O157感染,且存在流行的潜在危险.
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中国部分地区大肠埃希菌O157的分子分型及变异研究
目的 了解出血性大肠埃希菌(EHEC)O157的分子流行特征和遗传变异关系并完善EHEC O157:H7感染性腹泻监测制度.方法 采用聚合酶链反应分析毒力基因的分布情况;用脉冲场凝胶电泳技术对1988-2005年部分地区分离到的249株EHEC O157:H7(其中产志贺毒素的245株,不产志贺毒素的4株)和51株O157非H7进行分子流行病学分析.结果 stx2基因在我国的EHEC O157:H7菌株中有着很高的分布率,部分菌株携带stx2基因变种.300株O157共分为161种带型,其中51株O157非H7菌株共有42种带型,4株O157:H7非产毒株分别为4种带型,245株EHEC O157:H7共有115种带型.结论 EHEC O157间的基因变异较大;产stx2原毒素的菌株和stx2毒素发生变异的菌株带型相差较大.部分菌株之间存在着一定的交叉,说明虽然这两大类菌株有其特有的流行克隆系,但是它们的克隆系之间亲缘关系较近.
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大肠埃希菌O157∶H7的pO157-cured突变株构建
目的建立从肠出血性大肠埃希菌O157∶H7中去除pO157的方法,构建pO157-cured突变株(O157Cu).方法分别将mini-R100系质粒pKP2368和mini-F系质粒pIndigoBAC-5通过电穿孔转化入O157∶H7 Sakai、EDL933、85-170、China2364、Arami505和Mida2684菌株中,筛选转化子,进行质粒图谱分析,PCR检测转化子中pKP2368和pIndigoBAC-5基因;并扩增pO157中的复制不相容区incB、incC和incD序列,DNA测序验证PCR结果.结果采用mini-F系质粒pIndigoBAC-5转化,菌株Sakai、EDL933、China2364、Arami505、Mida2684的pO157丢失率(分别为94.44%、52.08%、91.67%、96.67%和63.33%)明显高于采用mini-R100系质粒pKP2368转化时其pO157丢失率(分别为15.22%、9.26%、0、0、0),差异有显著性(P值分别为0.001);对于菌株85-170,无论采用pKP2368还是采用pIndigoBAC-5转化,其pO157丢失率均为0.菌株Sakai、China2364、Arami505、Mida2684的pO157中均含有incB、incC和incD序列,EDL933的pO157中含有incC和incD序列,而85-170的pO157中只含有incC序列.结论用携带与pO157相同活性复制子的R100系质粒pKP2368构建pO157-cured突变株,结果并不理想;但携带RepFIA区、含有incB、incC和incD序列的mini-F系质粒pIndigoBAC-5却适用于构建多种菌株的pO157-cured突变株,成功率高、重复性好.pO157中所含mini-F序列incB、incC和incD的存在情况可能与pO157丢失率有关.
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食品标本处理方法对大肠埃希菌检出限影响
目的研究快速、敏感、低成本的食品标本处理方法.方法在牛肉馅中接种不同浓度的大肠埃希菌O157:H7,经离心、过滤,去除PCR抑制剂,浓缩菌株,用煮沸法和酶/冻融法裂解菌株,制备模板DNA,通过PCR检测大肠埃希菌O157:H7志贺毒素基因以评价该处理方法的可行性.结果在未增菌条件下,PCR低能检测到103 CFU/g牛肉馅,增菌6h,低能检测1 CFU/g牛肉馅,整个检测过程只需要12 h.结论所采用的标本处理方法是一种灵敏、省时、低成本的方法,能显著地提高PCR检测食品标本中的大肠埃希菌O157:H7的灵敏度.
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肠出血性大肠埃希菌(O157:H7)的基因同源性的分析
目的对江苏省徐州地区O157:H7的病原学进行分析.方法采用聚合酶链反应对O157:H7菌株毒力基因谱进行检测,同时用脉冲凝胶电泳(PFGE)和随机扩增多态性DNA(RAPD)方法对O157:H7菌株的同源性分析比较.结果流行地区分离的O1 57:H7菌株,100%携带Hly、eaeA基因,95.35%携带SLT2基因,11.63%携带SLT1基因.脉冲凝胶电泳图谱表明流行地区分离的O157:H7菌株与日本分离的O157:H7菌株有明显差异,为不相关菌株;与国内标准菌株882364为近似型(相似,但不相同).流行地区患者分离菌株与外环境家畜家禽粪便及昆虫肠道分离菌株的脉冲凝胶电泳图谱完全相同.结论携带O157:H7菌株的家畜家禽可能是导致疫情发生的传染源.脉冲凝胶电泳方法用于O157:H7病原学分析,对流行病学研究有重要意义.随机扩增多态性DNA方法用于O157:H7病原学分析,技术简便、省时.
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大肠埃希菌O157:H7脂肪酸组分及DNA特征研究
目的探讨大肠埃希菌O157:H7脂肪酸组分及DNA指纹图谱特征.方法用气相色谱(Gas chromatography,GC)及随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphyic DNA,RAPD)对2株大肠埃希菌O157:H7和其他6株大肠埃希菌全细胞脂肪酸组分及DNA指纹图谱特征进行分析.结果大肠埃希菌O157:H7不仅含有15:0和17:0脂肪酸组分,不含或仅含微量14:0 2OH和19:0ω8c脂肪酸,而且sum4和sum7脂肪酸峰值也明显高于其他菌株,DNA指纹谱也显示了其独有特征.结论大肠埃希菌O157:H7脂肪酸组分及相对含量和DNA指纹图谱特征与O26:H11及其他大肠埃希菌显著不同,与大肠埃希菌O26:H11等在遗传进化关系上存在一定距离.
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基因芯片检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7
目的设计和制备快速、特异、灵敏的检测大肠埃希菌O157:H7基因芯片.方法选择O157:H7特异的rfbE、fliC、SLT1和SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次聚合酶链反应(PCR)扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157:H7菌株和非O157病原体.结果O157:H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高.结论基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157:H7,为建立快速灵敏的检测细菌病原体和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法.
关键词： 大肠埃希菌O157 寡核苷酸序列分析 大肠埃希菌感染/诊断 -
江苏省肠出血性大肠埃希菌O157的基因PCR-RFLP分型研究
目的 对历年从江苏省不同地区分离的肠出血性大肠埃希菌O157(以下简称:O157)进行分型分析.方法 采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法对108株O157分子分型,比较不同地区、不同年份菌型差异.结果 根据EcoRV限制性酶切图谱可将菌株分成JS01-JS10十个不同的型别.主要菌型JS01占64.9％,JS02型与JS01型菌株酶切图谱相似度很高,JS03和JS04型菌株数目较少(12株),但近一半属于人源菌株.从时间方面看,1999年分离的菌型多；从地区方面看,铜山县分离到的菌株型别为多样化.结论 不同菌型之间的致病性存在差异,菌株与地理来源的关系密切.PCR-RFLP方法操作简便、重复性好,为O157的流行病学研究提供了一条全新途径.
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3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究
目的 建立一种能同时检测志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157的多重PCR方法.方法 根据志贺菌IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]、大肠埃希菌O157 eaeA基因[3,4]设计特异性引物,采用LB对志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157进行振荡培养,通过多重PCR扩增3种病原菌的目的基因,通过优化反应体系,提高反应的检测效率和特异性.结果 对志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157振荡培10h,经过PCR反应扩增出目的基因,把志贺菌,副溶血性弧菌、大肠埃希菌O157、肠道致病性大肠埃希菌,产肠毒素性大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌8种菌混在一起提取核酸进行PCR扩增,结果表明此PCR方法具有良好的特异性.结论 本研究建立的多重PCR检测方法能快速检测志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157,具有快速,灵敏,特异的特点,能广泛应用于食源性疾病检测,食物中毒检测等领域.
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上海地区分离的大肠埃希菌O157的分子分型研究
目的 对2006年-2014年在上海地区分离的大肠埃希菌O157进行分子分型研究.方法 通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)技术的联合应用,对来自中国上海地区的16株大肠埃希菌O157分离株和4株标准株进行分子分型研究.结果 PFGE方法可将20株菌株分为12种型别,分辨力为0.921 1.其中14株O157:H7菌株处于同一聚类,其与6株O157:H?菌株为不相关菌株.MLST方法可将20株菌株分为6种ST型,分辨力为0.726 3.7个管家基因的核苷酸多态性范围为0.000 784 ～0.009 449.其中14株O157:H7菌株分为ST2966型和ST11型,属于同一克隆群.6株O157:H?分离株分为4种ST型,包括3种新的ST型,且与本研究中的O157:H7菌株间的管家基因型别相差至少6个.结论 上海地区从动物和患者粪便中分离的大肠埃希菌O157:H7分离株间的遗传谱系接近,与本实验研究中的大肠埃希菌O157:H?菌株间亲缘关系较远.需加强对上海地区大肠埃希菌O157的病原学监测,并进一步比较2种分型技术对大肠埃希菌O157的分型效果.
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方阵式PCR在大肠埃希菌O157检测中的成本效益分析
目的:探讨一种检测O157的经济适用的检测方法.方法:把100个待检样品排成10×10方阵,对方阵中的每排,每列样品混合为一个新的样品,对混合样品进行O157的PCR检测.结果:PCR与方阵相结合,比传统检测方式节省约80%的检测成本,而且能快速准确定位目的菌.结论:PCR与方阵相结合是一种经济有效的检测方法,值得在大样本量的检测工作中推广.
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多重PCR方法快速检测E.coli O157毒力及rfbEO157基因
[目的] 探索一种快速、特异的检测大肠埃希菌O157的多重PCR(multiplex PCR)方法.[方法] 选用针对大肠埃希菌O157志贺样毒素1、2(stx1、stx2)基因、溶血素(hlyA)基因、粘附抹平因子(eae)基因和O157特异性基因(rfbEO157)的5对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测9株不同来源的O157和其他大肠埃希菌21株.[结果] 通过优化多重PCR反应条件和循环参数,5对特异性引物只扩增相应的基因片段,检测结果与应用常规PCR获得的结果一致.[结论] 该多重PCR方法能够在一次扩增中同时反应待测菌株是否为大肠埃希菌O157及其携带毒力基因的情况,可为大肠埃希菌O157的诊断及流行病学调查提供一种简便、经济、快速的检测手段.
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Stxl-A亚单位的原核表达、复性及抗原性鉴定
目的 构建志贺毒素1-A亚单位(Stxl-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以大肠埃希菌0157 DNA为模板扩增Stxl-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌B121(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶协鉴定和测序分析后证实构建成功.重组蛋白经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stxl-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带.结论 成功构建了pET32a(+)/Stxl-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stxl-A蛋白,为进一步制备抗Stxl-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础.
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与志贺菌和大肠埃希菌O157诊断血清交叉凝集反应细菌的分离和鉴定
目的 了解食品中能与志贺菌、大肠埃希菌O157发生交叉凝集的细菌,为防止误诊提供参考.方法 采用染色形态鉴别、血清学及生化等方法进行检测.结果 对食品风险监测205件样品中检出2种(3株)肠道杆菌能与志贺菌、大肠埃希菌O157诊断血清交叉凝集.结论 肠杆菌科、弧菌科某些种属细菌可携带与志贺菌、大肠埃希菌O157相同或相关抗原,故在鉴定这些杆菌时除依血清学外,还应加用生化试验等检测作出后判定.
