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广东口岸结核分枝杆菌复合群分子流行病学特征分析
目的 了解广东口岸结核分枝杆菌复合群(MTBC)主要流行菌株及输入性菌株的分子流行病学特征.方法 采用熔解曲线间隔区寡核苷酸分型(melting curve spoligotyping,McSpoligotyping)技术对广东口岸558株MTBC菌株进行基因分型,将分型结果与SITVITWEB数据库进行比对,获取间隔区寡核苷酸国际型别(spoligotype international type,SIT)编号,并用BioNumerics 7.6进行聚类分析.结果 558株MTBC菌株共分为107种基因型,其中66种归属于8种基因家族及4种家系.家系2和家系4共占菌株总数的86.38％(482/558).6个主要流行簇分别为SIT1、SIT53、SIT52、SIT50、SIT190和SIT19,其中SIT1为大流行簇.17株输入性MTBC包含北京、拉丁美洲和地中海(Latin American and Mediterranean,LAM)、East African Indian (EAI)、T、Africanum(AFRI)及未定义的基因家族,其中包含23.53％(4/17)的新基因型.北京家族菌株耐药率为27.25％(106/389),非北京家族菌株耐药率为23.81％(40/168),差异无统计学意义(x2=0.72,P=0.40).典型北京家族菌株耐药率为26.03％(95/365),非典型北京家族菌株耐药率为45.83％(11/24),差异有统计学意义(x2=4.46,P=0.03).结论 广东口岸以家系2和家系4 MTBC为主要流行菌株,输人性菌株以来源地区流行的基因家族和新基因型为主,应加强对主要流行菌株及输入性菌株的分子流行病学监测.非典型北京家族菌株与耐药性具有相关性.
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基因芯片技术在结核分枝杆菌耐药检测及菌种鉴定中的应用
目的 应用基因芯片技术快速检测结核分枝杆菌的耐药基因型以及分枝杆菌菌种基因型,探讨基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性和基因型的临床价值.方法 应用菌种分型基因芯片技术和间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)技术对长沙市中心医院2011年1月至2012年12月的临床标本分离菌株137株进行菌种鉴定.对鉴定为结核分枝杆菌的菌株应用绝对浓度法进行利福平和异烟肼药物敏感性检测.并进一步对结核分枝杆菌临床分离株(利福平耐药、异烟肼耐药、敏感株)应用耐药基因芯片技术对rpoB、katG、inhA基因的野生型位点及各突变位点进行检测.即rpoB基因中1个或多个位点的碱基突变为利福平耐药,katG、inhA基因任何基因中的1个或多个位点的碱基突变为异烟肼耐药.Spoligotyping法和基因芯片法菌种鉴定比较应用Kappa检验,绝对浓度法和基因芯片法药物敏感性比较采用x2检验和Kappa检验,均以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 (1)与绝对浓度法比较,对利福平敏感和异烟肼敏感的菌株45株,耐药基因芯片法检测鉴定为敏感株、即野生型的rpoB基因42株,符合率为93.3％(42/45)(不符合的1株为511T-C突变,1株为531C-T突变,1株为516A-T突变);katG基因45株,符合率为100.0％ (45/45);inhA基因43株,符合率为95.6％(43/45)(不符合的2株为inhA-15C-T突变).(2)与绝对浓度法比较,对利福平轻度耐药的耐药菌株18株,耐药基因芯片检测鉴定为rpoB基因突变型的16株,符合率为88.9％(16/18),且与531、516、526、511位点突变相关.对利福平高度耐药的耐药菌株19株,耐药基因芯片检测全部鉴定为rpoB基因突变型,符合率为100.0％(19/19),且与531、516、526、511位点突变相关.(3)与绝对浓度法比较,对异烟肼轻度耐药的耐药菌株13株,耐药基因芯片检测鉴定为katG基因突变型的12株,符合率为92.3％(12/13),与315G-C和315G-A位点突变相关.inhA基因突变型0株.对异烟肼高度耐药的耐药菌株9株,耐药基因芯片检测鉴定为katG基因全部为突变型,符合率为100.0％(9/9),与315G-C和315G-A位点突变相关.inhA基因突变型0株.(4)与Spoligotyping法比较,137株临床分离株中104株分离株基因芯片法检测鉴定为结核分枝杆菌复合群,33株基因芯片法检测出7株鸟分枝杆菌、15株胞内分枝杆菌、1株偶然分枝杆菌、10株龟或脓肿分枝杆菌,与Spoligotyping法比较,结核分枝杆菌复合群一致性为100.0％(104/104),鸟分枝杆菌一致性为77.8％(7/9),胞内分枝杆菌一致性为93.8％(15/16),偶然分枝杆菌一致性为0.0％(0/0),龟或脓肿分枝杆菌一致性为100.0％(8/8).经Kappa检验,Kappa=0.95,U=30.6,P＜0.05.结论 耐药基因芯片检测法与绝对浓度法有高度的一致性,且利福平耐药与rpoB基因的531、516、526、511位点突变相关.异烟肼耐药与katG基因的315位点突变相关,没有发现inhA相关的耐药位点突变.基因芯片方法可快速、准确地检测临床分离株的菌种基因型和耐药性.
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县级运送痰标本到地市开展基因芯片耐药检测的成本分析
目的 分析区县级结核病防治机构(简称“结防机构”)运送痰标本到地市开展基因芯片耐药检测的成本,为完善耐多药结核病患者发现策略提供数据基础.方法 选取中国不同地区3个具有代表性的项目点,包括江苏连云港,河南开封和重庆永川,收集2011年1月至2012年2月期间数据,采用简单法,根据运送次数、单次运输成本及运输标本数计算单位患者标本运输成本;采用简单法和时间-观察法对3个项目地区基因芯片检测成本进行分析.结果 自2011年1月至2012年2月,连云港、开封和永川三地单位患者运输成本分别为72.47元、84.67元和117.00元,其中运输成本与单次运输患者例数相关,其中单次运输患者例数较少的永川(1.71例/次,552/323)单位患者运输成本高,而单次运输患者较多的连云港(2.76例/次,712/258)单位患者运输成本低.此外,完成基因芯片检测的单位成本为141.56元,其中扩增占全过程总成本的69.0％(97.63元);其次为杂交,占总成本的11.9％(16.79元).在各试验过程中均以试剂、耗材及管理成本所占比例较高,分别占总成本的60.2％(85.26元)、17.5％(24.78元)和12.7％(18.00元).考虑到标本运输和基因芯片检测,完成1例患者检测的总成本约为230.84元,运输频次从每2周4次减少至每2周1次时,标本运输成本占总成本由33.5％降低为11.2％.结论 本研究表明,影响县级机构运送痰标本开展耐药结核病快速检测成本的主要因素包括单次标本运输例数和基因芯片价格.综合考虑运输成本和检测效果,运输频次为2周1次为宜.此外,标本转运开展结核病快速检测模式更适合于人口稠密的中东部地区.
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PCR测序和基因芯片快速鉴定分枝杆菌菌种的应用研究
目的 评价2种分枝杆菌菌种快速鉴定方法的临床应用价值.方法 分别用16S～23S rDNA转录间隔序列(ITS) PCR-直接测序和基于16S rRNA基因的基因芯片检测21株分枝杆菌标准菌株和50株临床分离株.结果 21株分枝杆菌标准株中,ITS PCR测序法将18株准确鉴定到种,结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌菌株只能鉴定到结核分枝杆菌复合群,海分枝杆菌无法鉴别是海分枝杆菌还是溃疡分枝杆菌；芯片法正确鉴定16株,1株胃分枝杆菌鉴定为堪萨斯分枝杆菌,3株不在芯片检测范围内.50株临床菌株中,47株2种方法结果一致,1株不在芯片检测范围内.结论 基因芯片鉴定分枝杆菌快速、特异,准确性高,临床常规开展应用需要进一步研究.
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应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性
目的 应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)对利福平和异烟肼的耐受性,评价其临床应用价值.方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增一基因芯片杂交的方法检测经常规药敏实验证实的30株Mtb利福平和异烟肼敏感株和5.株耐利福平和异烟肼分离株的堆rB基因及katG和inhA基因突变,同时以PCR-直接测序法为对照.结果 应用PCR-基因芯片与基因测序方法检测30株Mtb利福平敏感株咖B基因和异烟肼敏感株katG基因和inhA基因均为野生型.50株Mtb利福平耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析3株rpoB基因均为野生型,41株均为突变型;6株PCR-基因芯片与基因测序结果不一致.50株Mtb异烟肼耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析16株katG基因和30株inhA基因均为野生型,31株katG基因均为315位密码子突变,7株inhA基因均为-15位突变型,其中2株为katG和inhA双重突变,3株katG和13株inhA PCR-基因芯片与基因测序结果不一致.结论 应用PCR-基因芯片方法可快速、有效地检出大多数Mtb耐多药分离株,指导临床用药.
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基因芯片结核分枝杆菌耐多药检测在地市级实验室的应用性评估
目的 评估基因芯片耐多药检测利福平、异烟肼和耐多药肺结核(MDR-TB)的效能,探讨在地(市)级实验室应用基因芯片的可行性.方法 对2011年1月1日至2012年3月31日在江苏省连云港市涂片阳性的745例患者痰标本进行基因芯片检查,去除传统培养和非结核分枝杆菌等原因的111例,以传统药敏为金标准,在634例患者中分析对利福平、异烟肼和MDR诊断的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值.结果 评估结果表明基因芯片对于利福平检测的敏感度和特异度为84.4％ (65/77)和97.7％ (544/557);对于异烟肼的敏感度和特异度分别为80.9％ (76/94)和97.4％(526/540);对于MDR的敏感度和特异度分别为70.0％ (42/60)和98.3％(564/574).基因芯片和传统药敏检测一例涂阳患者的成本分别为165.65元和374.07元.结论 基因芯片检测方法是一种在中国基层实验室值得推广的更高效、快捷、安全,以及更符合成本-效益的耐药结核病诊断方法.
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萎蔫酸铜离子络合物、镉离子络合物的抗结核活性及对结核分枝杆菌基因表达的影响
目的 研究海洋微生物代谢产物萎蔫酸金属铜离子络合物与镉离子络合物体外抗结核活性,以及对Mtb H37Rv基因表达的影响.方法 应用纸片扩散法(Kind-Bauer,K-B法)初步鉴定萎蔫酸铜离子络合物、萎蔫酸镉离子络合物的抗结核活性,重复实验3次；绝对浓度间接法测定萎蔫酸铜离子络合物、萎蔫酸镉离子络合物的低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),重复实验确定更准确的MIC; Mtb cDNA芯片检测萎蔫酸铜离子络合物、萎蔫酸镉离子络合物处理Mtb组与溶剂对照处理Mtb组表达差异的基因,重复实验一次.结果 萎蔫酸铜离子络合物、萎蔫酸镉离子络合物在卡介苗(BCG)平板抑菌圈直径分别为(30.4±0.6) mm、(30.0±0.8) mm.萎蔫酸铜离子络合物抗Mtb H37Rv的MIC为10μg/ml;对耐多药结核分枝杆菌,萎蔫酸镉离子络合物MIC为7.5μtg/ml,低于S(MIC=25 μg/rnl)和RFP(MIC=25 μtg/ml)；对Mtb临床分离株(0907961,耐S和EMB),萎蔫酸铜离子络合物的MIC(10 μg/ml)低于S(S的MIC为20 μg/ml),萎蔫酸镉离子络合物的MIC(5 μg/ml)均低于S(MIC=20μg/ml)、EMB(MIC=6.4 μg/ml).Mtb cDNA芯片检测发现萎蔫酸铜离子络合物处理组与溶剂对照组比较,有差异表达的基因总数为23条,其中已知功能基因有10条；萎蔫酸镉离子络合物处理组与溶剂对照组比较,有差异表达的基因总数为28条,其中已知功能基因有11条.这些存在差异的基因功能涉及核苷酸、脂质、能量、辅酶、氨基酸代谢,DNA的复制、转录、翻译、翻译后修饰以及细胞膜的生物合成等.结论 萎蔫酸铜离子络合物与萎蔫酸镉离子络合物具有较好的体外抗结核活性,尤其对部分耐药菌株的抑制作用甚至优于抗结核一线用药,可作为抗结核药物的前导化合物；运用基因芯片所探究出的差异表达的基因为进一步深入研究其抗菌作用机制提供了一定的实验依据.
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基因芯片技术在结核分枝杆菌耐药检测中的效果分析
目的 比较基因芯片和比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)在检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性中的应用效果.方法 选取2013年9月至2016年12月海南医学院第二附属医院598例涂阳肺结核住院患者的痰标本,具有传统药敏结果和基因芯片结果的484例患者纳入分析.采用基因芯片法检测rpoB、katG及inhA基因耐药突变位点及频率,以比例法药敏试验结果为金标准,比较两种方法的符合率.结果 基因芯片和比例法药敏试验检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性符合率为93.8％ (454/484),对异烟肼的耐药性符合率为89.0％(431/484),对耐多药的符合率为95.5％(462/484).118株检测到rpoB基因发生突变,优势突变位点为531,占56.8％(67/118);其次突变位点是526,占19.5％(23/118);516突变位点占12.7％(15/118).97株检测到katG和inhA基因突变,常见的突变位点是katG315,占82.5％(80/97),inhA均为-15突变类型,占14.4％(14/97).结论 基因芯片法与比例法具有很好的一致性,可成为筛查结核分枝杆菌对利福平和异烟肼是否耐药的快速有效的方法.
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基因芯片检测耐利福平结核分枝杆菌准确性的Meta分析
目的 对基因芯片方法在检测耐利福平结核分枝杆菌的准确性进行系统评价,为基因芯片技术应用于临床检测耐药结核分枝杆菌的必要性提供证据.方法 计算机检索The Cochrane Library(2014年第1期)、PubMed、EMbase、Wanfang Data、CNKI数据库,检索时限均为建库至2014年2月.由2位研究者根据纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料,采用评价诊断准确性质量研究(quality assessment of diagnostic accuracy studies, QUADAS)条目评价纳入研究论文的方法学质量,检出相关文献223篇,按照标准纳入22篇文献.采用Meta-DiSc1.4软件对其敏感度(SEN)、特异度(SPE)、阳性似然比(十LR)、阴性似然比(-LR)、诊断比值比(DOR)进行异质性检验和合并分析,绘制汇总受试者工作特征(SROC)曲线,计算曲线下面积(AUC).结果 共纳入22篇文献(包括一篇多中心研究文献),25个研究,包括4879株经传统药敏试验鉴定结核分枝杆菌菌株,其中耐RFP菌株(1314株)、敏感菌株(3565株).基因芯片技术检测Mtb对RFP耐药的SEN合并为0.89[95 ％CI (0.87～0.91)]、SPE合并为0.98[95％ CI(0.97～0.98)]、+LR为30.89[95％CI (22.15～43.06)]、-LR为0.10[95％ CI (0.07～0.15)]、DOR合并为354.06[95％CI (212.09～591.07)]、AUC为0.9833.结论 基因芯片方法具有较好的诊断价值;以传统药敏法为金标准,基因芯片方法特异度、敏感度,诊断OR值均较高,说明其在Mtb对RFP耐药检出率较高,可作为临床结核分枝杆菌耐药检测的辅助手段.
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利福平和异烟肼结核分枝杆菌药敏表型和基因型的关系
目的 对利福平(RFP)和异烟肼(INH)进行药敏检测,分析相应的结核分枝杆菌药敏表型与基因型的关系.方法 对2009年至2012年深圳市第三人民医院结核病门诊和住院的137例结核病患者晨痰标本进行结核分枝杆菌培养,利用膜基因芯片法检测结核分枝杆菌耐药基因的突变情况(基因型检测),同时以绝对浓度法进行异烟肼和利福平药敏试验(表型检测),计算两种方法检测结果间的符合率,验证膜基因芯片方法的准确性,用Kappa检验分析两种方法的一致性.结果 137株结核分枝杆菌标本,表型检测利福平和异烟肼耐药率分别为27.01％(37/137)和22.63％(31/137);基因型检测利福平和异烟肼耐药率分别为26.28％(36/137)和23.36％(32/137);以绝对浓度法药敏结果为金标准,膜基因芯片检测利福平耐药的敏感度为83.78％(31/37),特异度为94.06％(95/101),符合率为91.97％ (126/137),Kappa值为0.79,P＜0.05;异烟肼耐药的敏感度为80.65％(25/31),特异度为94.29％(99/105),符合率为90.51％(124/137),Kappa值为0.73,P＜0.05;两种药物药敏结果总符合率为91.24％(250/274).结论 结核分枝杆菌耐药性基因型检测和表型检测结果高度一致,且基因型的检测方法能快速准确地检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性,有望在临床治疗中广泛应用.
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结核分枝杆菌基因突变检测方法研究进展
结核分枝杆菌全基因组测序工作的完成,为开展结核病基因研究提供了理论基础,对结核分枝杆菌基因突变的研究也成为当前结核病研究领域的热点之一.高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)、基因芯片、DNA直接测序等分子生物学新技术的发展和应用,为结核分枝杆菌基因突变研究提供了更有效的方法.现综合国内外近年来的文献,分类介绍应用于结核分枝杆菌基因突变检测的各种方法的原理、应用情况等,同时也对GeneXpert、结核分枝杆菌线性探针(1ine probe assay,LiPA)、基因芯片等当前比较成熟并有望得到广泛应用的商品化基因突变检测技术进行介绍.
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转基因大豆低密度基因芯片的检测方法研究
目的 建立Roundup Ready转基因大豆(简称RRS)的基因芯片检测方法,探讨其在转基因大豆检测中的应用.方法 根据大豆中所转入的外源基因,选择camv35s启动子、nos终止子和cp4epsps基因,以大豆内源基因lectin基因为内参照基因设计了引物和探针,并制备了核苷酸芯片;通过多重PCR对样品核酸进行扩增和荧光标记后,将PCR产物与芯片杂交,检测大豆样品中所含的外源基因,并评价方法的灵敏度.结果 检测转基因含量不同的RRS标准参考物,结果显示:camv35s启动子、nos终止子、外源基因cp4epsps检测灵敏度均可达0.45%.结论 本研究所建立的基因芯片检测方法有良好的灵敏度及可重复性,有助于实现转基因大豆的高通量、高灵敏的检测.
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染矽尘大鼠早期肺组织差异基因表达谱的研究
目的 研究染矽尘大鼠早期肺组织与正常肺组织的差异基因表达谱.方法 应用气管暴露法建立雄性Wistar大鼠染矽尘模型和对照组,每组3只,应用Illumina激光共聚焦光纤微珠基因芯片技术,研究建模后14 d时的大鼠肺组织差异基因表达谱,并采用DAVID生物信息学分析工具,进行Fisher精确概率检验,对差异基因的基因功能和生物学通路进行富集统计学分析.结果 检测出的有效基因共22 107个,筛选出染矽尘组与对照组的差异基因共1567个,其中上调基因为765个,下调基因为802个.在KEGG生物学通路数据库中,共406个差异基因获得注释,上调基因为204个,其中11个生物学通路相关基因显著上调;下调的基因有202个,其中3个生物学通路相关基因显著下调.Real-time PCR实验验证了血红素加氧酶1(HMOXl)、超氧化物歧化酶2(SOD2)基因上调的趋势和基因芯片结果是一致的.结论 本次实验筛选出了染矽尘早期大鼠肺组织差异基因,提示矽尘致肺纤维化过程中可能存在相互作用的基因簇.
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微波致人视网膜色素上皮细胞应激基因转录变化的芯片研究
目的研究微波辐射与采用水浴加热,模拟微波辐射的人视网膜色素上皮细胞在细胞应激和凋亡相关基因转录的差异,探讨微波对培养的人视网膜色素上皮细胞基因转录的影响.方法应用基因芯片技术对2 450 MHz微波辐射、模拟微波辐射的人视网膜色素上皮细胞的mRNA进行检测.结果在97条有关应激和凋亡的目的基因中发现有7条基因转录上调,M31166基因上调2.52倍, L24123基因上调2.66倍,AF039704基因上调2.22倍,U67156基因上调2.07倍,AF040958基因上调2.13倍,NM-001423基因上调2.63倍,NM-005346基因上调3.68倍,未检测到转录显著下调的基因.结论微波辐射可引起培养的人视网膜色素上皮细胞中多个与应激和凋亡有关基因转录上调,微波辐射除了辐射引起的热作用外还存在微波辐射本身的作用.
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亚砷酸钠对生长发育影响的分子遗传机制研究
目的利用基因芯片技术研究亚砷酸钠对生长发育相关基因表达的影响,探讨砷的分子遗传学机制.方法将正常肝细胞cDNA克隆库的基因点在芯片上(每个克隆是什么基因尚未知),然后与暴露于不同亚砷酸钠浓度肝细胞中得到的cDNA第一链杂交,对表达有差异的克隆进行基因测序,明确是什么基因,后筛选出与生长发育相关的基因.结果两个染毒组人甲状腺激素结合蛋白基因(p55)的表达水平分别是对照组的2.21和2.93倍,说明亚砷酸钠增强了p55基因的表达.两个染毒组与对照组基因表达水平相比,胎盘催乳素基因(PL)分别是0.13和0.27,同源框基因(HOXA10)分别是0.22和0.35,表明亚砷酸钠抑制PL基因和HOXA10基因的表达.结论亚砷酸钠对生长发育相关基因表达有影响,初步揭示了砷对生长发育影响的分子遗传学机制.
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鲑鱼鱼白DNA对小鼠胸腺作用的差异表达基因筛选
目的探讨鲑鱼鱼白DNA(salmon milt DNA,SMD)对小鼠胸腺增龄性萎缩的作用及作用机制.方法 10月龄雌性BALB/C小鼠按体重随机分为高剂量组(333.33 mg*kg-1*d-1)、低剂量组(166.67 mg*kg-1*d-1 )和对照组(0 mg*kg-1*d-1 ).喂饲5周后,测定胸腺脏器指数;组织切片后以Image-Pro Plus专业图像分析系统(4.0版)进行胸腺细胞计数和皮质厚度测量,所得数据经SAS统计软件分析.应用基因芯片技术在对照组和高剂量组胸腺组织中筛选差异表达的基因片段、RT-PCR鉴定部分片段.结果 SMD对小鼠的体重、胸腺重量和胸腺指数均无影响;高剂量组小鼠的胸腺皮、髓质细胞数量与对照组经统计学分析相比均显著增多;低剂量组的胸腺皮、髓质细胞数量与对照组相比经统计学分析差异均不显著;高、低剂量组的胸腺皮质平均厚度经统计学分析均显著高于对照组;经基因芯片技术初筛出112条差异表达的基因片段;Genebank登录号为Aw209102、U23789、X80232的3条上调表达的基因片段,经RT-PCR鉴定,在高剂量组确实存在上调表达.结论 SMD有通过促进细胞增殖相关基因的表达并同时促进发育、分化相关基因表达而逆转胸腺增龄性萎缩的可能.
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检测黄曲霉毒素生物合成相关基因芯片的研制
目的 建立比较成熟的可用于分析黄曲霉毒素生物合成相关基因的芯片技术.方法 采用反转录PCR和芯片检测对比的方法.实验所用探针来源于寄生曲霉,待测样品选择黄曲霉菌株.结果 芯片点阵后依次通过温浴2 h,650 mJ/cm<'2>紫外交联30 S,80℃烘烤2 h,预杂交45 min,清洗,干燥等步骤,后与待测样品在42℃杂交16 h,获得了低背景高质量的芯片.芯片扫描显示荧光信号稳定,与反转录PCR扩增结果一致,并且无背景干扰.结论 探针设计合理,实验方法可靠.初步建立了用芯片检测与黄曲霉毒素生物合成相关基因的技术平台.
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清胰汤对急性坏死性胰腺炎大鼠基因表达谱的影响
目的 探讨清胰汤(QYD)对牛磺胆酸钠诱导的急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺基因表达谱的影响.方法 60只SD大鼠按随机数字法分为假手术组(SO组)、ANP组和QYD组,每组20只.4％牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射复制ANP模型,SO组注射生理盐水,QYD组3次灌胃治疗(0.75 ml/100 g).观测大鼠存活率、血清淀粉酶和C-反应蛋白(CRP)变化;HE染色观察胰腺、肺组织病理改变;Illumina大鼠全基因组表达谱基因芯片分析胰腺表达谱变化;荧光定量RT-PCR验证部分基因(热休克蛋白A8和热休克蛋白b1).结果 QYD组存活率较ANP组高(80％比65％,P=0.031),而血清淀粉酶、CRP明显下降[(5789±798)比(7256± 1221) U/L,P=0.001;(78.6±18.5)比(126.4±24.3) mg/L,P=0.012],Schmidt胰腺病理评分好转.与ANP组比较,QYD组筛选出575个差异基因,其中上调92个,下调483个.基因本体论(GO)功能分析涉及到转录调节因子活性负调节、氧化还原酶类活性、酶抑制剂活性等.KEGG生物学通路主要涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、NOD受体样信号通路、细胞周期、代谢通路、氧化还原酶类活性等.定量RT-PCR(热休克蛋白A8和热休克蛋白b1 mRNA)验证了基因芯片结果.结论 QYD可有效治疗实验性ANP,其机制涉及到MAPK信号通路、NOD受体样信号通路、细胞周期、代谢通路、氧化还原酶类活性等.
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腹泻相关致病菌基因芯片的制备及应用
目的 确定引起人类感染性腹泻的11种病原微生物,并制备芯片用于检测门诊腹泻患者人粪便标本中的致病菌.方法 根据本院2009年1月至2012年12月期间腹泻门诊的粪便病原菌检测数据,采用生物信息学的方法,收集11种病原菌的所有基因序列,设计引物及探针,优化并制备芯片,PCR扩增杂交并对杂交结果进行分析.用该芯片对本院保存的163个肠道致病菌临床分离株进行鉴定来评价芯片的特异性,用芯片来检测掺有不同浓度沙门氏菌的粪便标本评价芯片的灵敏度.同时收集2010年6月至2013年3月在本院就诊的1 052份腹泻患者粪便标本,平行进行PCR扩增、细菌培养、基因芯片检测,比较不同检测方法的阳性率.结果 成功制备了腹泻相关11种致病菌检测芯片.应用制备的芯片检测了163个临床分离株,准确率达100％.与PCR方法比较,基因芯片检测沙门氏菌的灵敏度达102 CFU/ml,比PCR法检测灵敏度高10倍.用该芯片对临床1 052份腹泻患者腹泻标本进行检测,与传统的培养法及PCR法比较,有较高的阳性检出率,达36％,比常规细菌培养阳性率高13％(x2=2.28,P＜0.05),比PCR检出率高4％(x2=5.16,P＞0.05).结论 成功制备11种腹泻相关致病菌基因芯片,能同时对11种腹泻致病菌进行检测,有较好的特异性和灵敏度,有更高的阳性率,可以用于临床检测.
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一种BRAF基因突变检测方法的建立
目的 建立一种适用于临床样品检测的BRAF基因V600E突变的检测方法.方法 利用已知BRAF基因野生型、突变型样品,以BRAF基因15外显子V600E突变为靶位点设计特异性扩增引物和测序引物,建立BRAF基因V600E突变的SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,并对该方法进行方法学评价和21例结直肠癌临床样品检测.结果 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB GreenPCR-Sanger测序检测方法,该方法的灵敏度达5.0×101拷贝/ul,检测线性范围5×101～ 5×107拷贝/ul,且检测的重复性好.检测21例结直肠癌临床样品,突变率为9.5％(2/21).结论 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,该方法可用于临床样品的检测.
