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结直肠癌KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因联合突变分析及临床意义
目的:探讨结直肠癌组织KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变情况及与临床病理特征的关系.方法:采用荧光定量PCR法检测结直肠癌58例组织中KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变情况.结果:检测到结直肠癌组织基因突变33例(56.90％),其中KRAS基因突变17例(29.31％),突变类型6种;NRAS基因突变1例(1.72％),为G12D突变;PIK3CA基因突变9例(15.52％),皆为H1047R突变;BRAF基因突变6例(10.34％),皆为V600E突变.PIK3CA仅与KRAS基因发生双突变4例.KRAS野生型患者中PIK3CA基因突变4例.KRAS基因突变与病理分期有关.结论:结直肠癌临床检测中对KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF多基因突变进行分子检测,能更准确地预测患者耐药情况,可正确指导临床用药和科学选择治疗方案.
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上海地区BRAF基因突变检测室间质量评价
目的 通过开展B-rapidly accelerated fibrosarcoma(BRAF)基因突变检测项目室间质量评价(external quality assessment,EQA),分析和探讨临床实验室存在的问题,并提出改进措施.方法 上海市临床检验中心(以下简称"中心")2017年发送两次EQA样品盘至45家实验室,每次均包含5份样本,要求各参评实验室在1周内将检测结果 上传至中心数据库.然后,中心依据回报结果汇总各实验室EQA成绩,并计算每份检测样本的符合率.结果2017年两次BRAF基因突变检测EQA活动分别收到42和41家实验室的有效回报结果,两次10份样本检测总符合率为76.2％～100％,其中:野生型、p.V600K、p.V600R和p.V600E样本符合率分别为99.2％(123/124份),79.8％(67/84份),87.8％(36/41份)和95.2％(119/125份).分别有73.8％(31/42家)和75.6％(31/41家)的实验室检测结果完全正确;其中:使用注册试剂检测结果完全正确的实验室分别为79.8％(27/34家)和81.3％(26/32家),使用实验室自建方法(laboratory-developed tests,LDTs)结果完全正确的实验室分别为50％(4/8家)和55.6％(5/9家).结论 上海市临床实验室BRAF基因突变检测项目EQA总符合率较高,商品化试剂检测结果符合率高于LDTs;部分实验室检测能力有待提高,应加强BRAF基因突变检测项目质量控制,以确保检测结果的准确性.
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CK19、Galectin-3、BRAF在甲状腺乳头状癌中的表达及意义研究进展
甲状腺乳头状癌起源于滤泡上皮细胞,是分化较好的恶性肿瘤.占原发性甲状腺恶性肿瘤的55%～65%,可发生在任何年龄,但以40岁以下多见,男女的比例为1:(2～4).甲状腺乳头状癌恶性度较低,5年生存率为73%～93%;10年生存率为60%～83%;有的病程可长达35年[1-3].
关键词： CK19 Galectin-3 BRAF 甲状腺乳头状癌 -
43例中国人眼部恶性黑色素瘤cKit和BRAF基因突变分析
目的 分析中国人眼部恶性黑色素瘤中cKit和BRAF基因突变情况.方法 收集43例中国眼部恶性黑色素瘤患者组织标本(脉络膜恶性黑色素瘤30例,结膜恶性黑色素瘤13例),采用巢式PCR扩增和基因测序的方法检测cKit基因第9、11、13、17和18外显子以及BRAF基因第15外显子突变情况.结果 cKit基因在脉络膜恶性黑色素瘤患者中突变率达16.7％ (5/30),而在结膜恶性黑色素瘤中突变率仅为7.7％ (1/13)；在结膜恶性黑色素瘤中检测到1例BRAF基因突变(1/13),在脉络膜恶性黑色素瘤中未检测到BRAF基因突变.结论 cKit基因在中国脉络膜恶性黑色素瘤患者中突变率较高,提示以cKit为靶标的靶向药物未来有可能为中国脉络膜恶性黑色素瘤患者带来新的希望.
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一种BRAF基因突变检测方法的建立
目的 建立一种适用于临床样品检测的BRAF基因V600E突变的检测方法.方法 利用已知BRAF基因野生型、突变型样品,以BRAF基因15外显子V600E突变为靶位点设计特异性扩增引物和测序引物,建立BRAF基因V600E突变的SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,并对该方法进行方法学评价和21例结直肠癌临床样品检测.结果 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB GreenPCR-Sanger测序检测方法,该方法的灵敏度达5.0×101拷贝/ul,检测线性范围5×101～ 5×107拷贝/ul,且检测的重复性好.检测21例结直肠癌临床样品,突变率为9.5％(2/21).结论 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,该方法可用于临床样品的检测.
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BRAFV600E突变型胃肠间质瘤10例临床病理特征
目的 探讨BRAF突变型胃肠间质瘤(GIST)分子特征的临床意义.方法 用免疫组化测序方法对10例BRAF突变GIST的临床资料、组织学形态、免疫组化及分子遗传学进行分析.结果 BRAF突变型GIST多发生于中老年人(平均年龄54.9岁),男女之比为3:7.其中7例发生于胃,3例发生于小肠;除1例高风险外,其余为低风险或极低风险.获得随访资料的7例中只有1例术后确诊肠癌,其余均无瘤生存.所有病例的组织形态以梭形细胞结构为主.免疫组化:10例肿瘤细胞CD117、DOG-1大都弥漫强(+),且SMA、desmin和S-100均为(-).测序检测10例样本C-KIT基因9、11、13、17外显子,PDGFRA基因12、18外显子,均为野生型;BRAF基因均为V600E突变.结论 BRAF突变型GIST是一类具有特殊分子遗传学改变和良好临床预后的特殊肿瘤.
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ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对慢性高原病患者骨髓有核红细胞中Ras、BRaf、MEK、ERK1/2表达的影响
目的:探讨ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对Ras、B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1/2 (ERK1/2)表达的影响,以期为慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)的基础研究和临床治疗探讨新的途径.方法:选取CMS患者16例,取骨髓液分离单个核细胞,以CD71与CD235a抗体磁珠分选阳性细胞,将细胞分为5组:空白对照组、DMSO溶剂组及PD98059 5、10和20 μmol/L组.在低氧条件下培养72 h,应用ELISA法测定培养骨髓有核红细胞上清液中Ras-GTP水平,RT-PCR法测定骨髓有核红细胞中BRaf、MEK、ERK1/2 mRNA的表达,Western blot方法检测骨髓有核红细胞中p-BRaf、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表达.结果:PD98059对各组Ras-GTP的水平无明显影响(P=0.798).溶剂组与空白对照组相比,BRaf、MEK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P =0.826、P=0.298).与PD98059 20 mol/L比较,其余4组ERK1/2 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P =0.001、P=0.002).溶剂组与空白对照组相比,p-BRaf、p-MEK蛋白的表达差异无统计学意义(P =0.370、P=0.351).与PD98059 20 mol/L比较,其余4组p-ERK1/2蛋白水平差异有统计学意义(P ＜0.001、P＜0.007).结论:PD98059能下调骨髓有核红细胞ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白的表达.Ras/Raf/MEK/ERK 1/2通路是调控CMS骨髓有核红细胞的主要信号传导途径,可能参与了慢性高原病的发病过程.
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甲状腺腺瘤患者miR-146b的表达及与BRAF突变的相关性研究
目的：检测miRNA-146在甲状腺癌（ TC）组织中的表达水平，并分析其与BRAF基因突变及临床病理特征的关系。方法采用免疫组化法，对40例甲状腺癌组织、40例正常组织中miRNA-146表达水平进行检测，并根据染色程度和阳性细胞数进行综合评分；采用聚合酶链式反应（ PCR）对甲状腺癌中BRAF突变进行检测，同时分析miRNA-146表达水平与BRAF突变之间的相关性。对TC患者作1～2年的随访，以观察其生存期。结果40例TC患者中，13例患者miRNA-146呈阳性（32.5％），27例患者呈阴性（67.5％）；30例正常受试者miRNA-146呈阳性（90.0％），10例患者呈阴性（10.0％）；两组比较，差异具有统计学意义（χ2＝136.708，P＝0.000）；TC患者miRNA-146的阳性表达与TC患者的临床分期、肿瘤直径及是否发生肿瘤包膜侵犯、淋巴结转移、BRAF突变等因素密切相关（ P＜0.05）；miRNA-146阴性与阳性患者中，总体生存期未发现显著差异（ P＝0.425）。结论 miRNA-146在TC组织中呈低表达，与BRAF突变、TC的发生发展及侵袭转移关系密切。
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基因突变与结直肠癌靶向治疗的新进展
KRAS基因突变作为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)单抗疗效预测指标的发现,给转移性结直肠癌(metastaticcolorectal cancer,mCRC)的治疗带来了巨大的改变.然而,结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发生涉及到多个癌基因、抑癌基因和信号传导通路的改变,而不同的信号传导通路之间存在着千丝万缕的联系,形成了复杂的信号传导网络,如何寻找使用抗EGFR单抗的适合人群,从而避免不必要的不良反应和无效治疗是目前研究的热点.本文就目前国内外研究较多的预测抗EGFR单抗疗效的生物靶标及相应对策进行综述.
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人BRAF野生型及V600E突变型真核表达载体的构建及表达
目的:构建BRAF野生型和V600E突变型真核表达载体;转染并筛选稳定表达BRAF的胰腺癌细胞株,为探讨BRAF V600E突变在胰腺癌发生发展中的作用提供合适的细胞模型.方法:将BRAF野生型及V600E突变型cDNA克隆于真核表达载体pCMV-Myc中,构建pCMV-Myc-BRAFW)及pCMV-Myc-BRAFV600E重组质粒,酶切鉴定、测序证实序列正确后,利用脂质体将重组质粒转染胰腺癌细胞Panc-1,经G418培养筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR和Western blot鉴定野生型和V600E突变型BRAF基因在Panc-1细胞中的表达.结果.酶切鉴定和序列分析证实,重组克隆pCMV-Myc—和pCMV-Myc—BRAFV600E序列正确,RT-PCR和Western blot结果显示G418筛选获得的转基因Panc-1细胞稳定表达BRAF和BRAF V600E.结论:成功构建了pCMV-Myc-BRAFW和pCMV-Myc-BRAFV600E真核表达载体,建立了稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.
关键词： BRAF 胰腺癌 逆转录聚合酶链式反应 Western blot 克隆 真核表达 -
多发性甲状腺乳头状癌伴桥本甲状腺炎中肿瘤克隆起源的分析
目的 分析多发性甲状腺乳头状癌伴桥本甲状腺炎中,同一病例不同肿瘤灶的BRAF、RAS基因突变的表达.方法 使用一代测序和扩增阻碍突变系统(ARMS)检测37例多发性甲状腺乳头状癌伴桥本甲状腺炎中BRAF V600E突变和N-/H-/K-RAS基因密码子12、13、61突变的表达以及在患者多病灶之间表达的差异.结果 37例患者的80份肿瘤样本中共检出BRAF V600E突变51例,检出RAS基因突变3例.37例病例中有20例(54.1％)的多发病灶为不同的克隆起源,与文献结果(37/60)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 半数以上多发性甲状腺乳头状癌伴桥本甲状腺炎病例中,肿瘤细胞来自不同的克隆起源,桥本甲状腺炎更可能是伴随甲状腺乳头状癌的肿瘤免疫反应的一部分.
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癌基因BRAF突变在黑色素细胞痣与黑色素瘤中的作用
BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogenehomolog B1)是一种癌基因,位于RAS/RAF/MEK/ERK信号传导通路上.2002年以来,学者们相继发现在黑色素瘤中存在高频率的BRAF突变,这种T到A的突变发生在第15号外显子激酶结构域的单个位点,导致第600个密码子编码的氨基酸发生错义突变(BRAF~(V600E)),从而激活RAS/RAF/MEK/ERK通路,揭示可能与肿瘤发生相关~([1]).
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BRAF基因突变及其对分化型甲状腺癌钠碘同向转运体功能影响的研究进展
目的:总结分化型甲状腺癌中鼠类肉瘤滤过性毒菌(V-raf)致癌同源体B1 (BRAF)基因突变与钠碘同向转运体(NIS)国内外研究进展,阐述BRAF和NIS基因结构表达与调控及BRAF基因突变对NIS功能的影响.方法:应用PubMed、Sciencedirect和万方检索系统,以“分化型甲状腺癌、钠碘同向转运体、BRAF、131I”为关键词,检索1998-2010年相关文献95篇.纳入标准:1)NIS结构与功能；2)NIS与分化型甲状腺癌的关系；3)BRAF结构与功能；4)BRAF突变与分化型甲状腺癌的关系；5)BRAF突变与NIS表达在分化型甲状腺癌中的关系.根据纳入标准分析文献23篇.结果:甲状腺癌131I治疗通过NIS介导.NIS的表达可以预测复发DTC131I的聚集和131I疗效评价.BRAF突变在PTC中可作为不良影响因子,影响PTC的发生、侵袭及预后.BRAF基因突变能引起NIS表达下降(20％～80％),病灶摄碘能力降低.NIS的表达水平在含有BRAF V600E突变的PTC中明显降低.结论:BRAF基因突变能引起NIS表达下降,降低病灶碘治疗疗效.因此,BRAF基因突变有望成为预测甲状腺癌放射性碘治疗疗效的指标.
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甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变与钠碘同向转运体表达的研究
目的:探讨甲状腺乳头状癌(PTC)患者中BRAFV600E基因突变及钠碘同向转运体(NIS)蛋白的表达及两者间的相关性.方法:收集2008-01-01—2011-01-01青岛大学医学院附属医院病理科PTC石蜡包埋组织30例,其中癌旁组织为正常组织(G正常组)15例,癌旁组织为结节性甲状腺肿组织(G结甲组)15例.对PTC组织行DNA提取、PCR扩增、基因测序检测BRAFV600E基因突变,同时采用免疫组化的方法分析NIS蛋白表达,结果以免疫组化评分(IHS)表示.结果:30例PTC均无BRAFV600E基因突变；30例PTC组织中NIS蛋白表达,从0～12分,G正常组IHS=(7.92±3.01)分,G结甲组IHS=(6.58±2.71)分,两组NIS差异无统计学1意义,t=1.11,P=0.95；BRAFV600E突变与NIS蛋白表达无相关性.结论:尚未发现癌旁不同的PTCBRAFV600E基因有突变及NIS蛋白表达的差异.BRAFV600E基因突变与NIS表达在PTC中的关系有待进一步研究.
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甲状腺乳头状癌中CD44v6 BRAF和Rasp21的表达
目的 探讨甲状腺乳头状癌中CD44v6、BRAF和Pasp21的表达,及其与淋巴结转移的关系.方法 应用免疫组化SP法,对38例有颈淋巴结转移的甲状腺乳头状癌(PTC+ LNM)患者、22例甲状腺乳头状癌但无颈部淋巴结转移患者和50例甲状腺腺瘤(TA)患者组织中的CD44v6、BRAF和Rasp21进行检测.结果 有淋巴结转移组(PTC +LNM)的CD44v6、BRAF和Rasp21阳性率显著高于无淋巴结转移组(PTC)和甲状腺腺瘤(TA)组(P＜0.05).结论 CD44v6、BRAF和Rasp21的阳性表达与甲状腺乳头状癌的颈淋巴结转移密切相关,可作为甲状腺乳头状癌较好的转移及预后评估指标.
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BRAF基因V600E突变在甲状腺病变中的表达
目的 分析BRAF基因V600E突变在中国汉族人群甲状腺病变中的表达情况.方法 240例甲状腺病变中,乳头状癌(PTC)129例(其中经典型PTC 121例,滤泡型PTC 8例).滤泡癌12例,髓样癌4例,甲状腺隙瘤30例,结节性甲状腺肿30例,Lp状腺乳头状增生35例.采用常规酚.氯仿法抽提87例新鲜组织样本的总DNA,改良试剂盒法抽提153例石蜡组织样本的总DNA,经过PCR、测序,检测BRAF V600E突变.结果 在240例甲状腺病变中,BRAF V6OOE突变61例,发生率为25.4%.61例BRAF V600E突,变患者均为PTC,占PTC的47.3%.BRAF V600E突变在经典型PTC中的表达率(49.6%)与在滤泡型PTC中的表达率(12.5%)比较,差异有统计学意义(P<0.05).BRAF V600E突变与PTC患者临床病理参数间的差异无统计学意义(P>0.05).结论 BRAFV600E突变与PTC的发生、发展可能有着重要联系,BRAF V600E突变可以作为PTC诊断的特异性标记;改良的试剂盒法抽提石蜡组织DNA具有高效、简便、价格栩对低廉的优点.
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表皮生长因子受体、KRAS及BRAF基因突变与非小细胞肺癌临床病理特征的关系
目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织表皮生长因子受体(EGFR)、KRAS和BRAF基因突变与临床病理特征的关系.方法 采用基因测序的方法检测143例NSCLC患者肿瘤组织中EGFR基因第18、19、20、21外显子,KRAS基因第12、13密码子和BRAF基因第600密码子突变情况.采用SPSS 16.0软件分析各突变与临床病理特征的关系.结果 143例受检样本中,EGFR突变57例(39.9％),其中第18外显子突变2例,第19外显子突变25例,第20外显子突变3例,第21外显子突变24例,多位点突变3例;KRAS突变25例(17.5％),其中第12密码子突变23例,第13密码子突变2例;BRAF第600密码子突变2例(1.4％).未发现EGFR、KRAS和BRAF任意两者同时突变的病例.EGFR基因突变与患者的性别、吸烟史、组织学类型、分化程度和肿瘤直径具有相关性(均P＜0.05),与淋巴结转移及pTNM分期无相关性(均P＞ 0.05).KRAS基因突变与患者的性别、吸烟史、组织学类型、分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移及pTNM分期均无相关性(均P＞0.05).结论 NSCLC患者EGFR基因突变率较高,且较常发生于女性、不吸烟、肿瘤组织较小、分化程度较患者好的腺癌组织中.KRAS基因突变率与患者性别、组织学类型等临床病理特征无关.NSCLC患者中BRAF基因突变率很低,且EGFR、KRAS和BRAF三种基因突变一般不会同时发生,为NSCLC的靶向治疗提供了客观依据.
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基于靶标BRAF的抗肿瘤研究进展
BRAF是人类重要的原癌基因之一,大约8％的人类肿瘤发生BRAF突变.BRAF绝大部分突变形式为BRAFV600E突变,主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中.该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活,对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要,是抗黑色素瘤等V600E突变肿瘤的有效作用靶标之一.2011年,首个BRAFV600E靶向抑制剂威罗菲尼被FDA批准上市,用于治疗BRAFV600E突变的晚期黑色素瘤患者,有效延长了患者无进展生存期及总生存期,取得了突破性的治疗效果,也是典型的基于基因诊断选择用药的靶向治疗药物.但是耐药性的出现使得药物治疗效果受到限制,其耐药机制、新药物开发以及预防或延缓耐药的研究成为目前需要解决的关键问题.本文介绍了BRAFV600E突变体作为抗肿瘤靶标的依据以及其抑制剂的研究状况,分析了BRAFV600E靶向药物的耐药机制,并指出了目前解决耐药性问题的方向.
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甲状腺乳头状癌中 BRAF 基因突变与中央区淋巴结转移的关系及临床意义
目的：阐明 BRAF 基因突变在甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移中的作用。方法：采集整理2012年至2014年间于北京大学肿瘤医院头颈外科行手术治疗的275例甲状腺乳头状癌患者，对其肿瘤组织进行 BRAF 基因检测并通过单因素、多因素 Logistic 回归模型探索中央区（Ⅵ区）淋巴结转移的危险因素。结果：275例患者中，女性224例（81．5％），男性51例（18．5％）。有57．8％（159／275）的患者发生中央区淋巴结转移，BRAF 的突变率为53．8％（148／275），其中，超声下有无钙化（ORadjusted ＝1．47，95％CI：1．10～1．98，P ＝0．01）、肿瘤的长径（ORadjusted ＝1．48，95％CI：1．04～2．30，P ＝0．048）及患者的年龄（ORadjusted ＝1．48，95％CI：1．04～2．30，P ＝0．048）与淋巴结转移显著相关。分层分析后，BRAF 突变在超声下边界尚清组（ORadjusted ＝3．19，95％CI：1．18～9．43，P ＝0．023）和超声下无钙化组（ORadjusted ＝4．84，95％CI：1．68～13．84，P ＝0．003）均与淋巴结转移正相关。结论：甲状腺乳头状癌患者具有一定比例的中央区淋巴结转移率，BRAF 突变是甲状腺乳头状癌的特征性分子事件，钙化、低年龄组及肿瘤长径较长的患者更易发生中央区淋巴结转移。尽管超声下边界尚清或无钙化，但一旦合并 BRAF 突变则更易发生淋巴结转移，中央区淋巴结清扫术是有效的治疗方法。
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BRAF基因突变检测在甲状腺乳头状病变中的临床意义
目的：探讨BRAF基因在甲状腺乳头状病变中的突变情况及临床意义。方法提取石蜡肿瘤组织中DNA，采用直接测序法分析24例甲状腺乳头状癌和30例甲状腺不典型乳头状腺瘤石蜡组织中BRAF基因突变的情况。结合临床资料进一步分析。结果24例甲状腺乳头状癌，16例发现BRAF基因15外显子第600位密码子A/T杂合（V600E），突变率为66.7%（16/24）。而30例甲状腺不典型腺瘤中未发现V600E病理性突变（0/30）。结论 BRAF V600E位点突变仅见于甲状腺乳头状癌，具有一定的特异性，可以用于帮助临床甲状腺乳头状增生良恶性的鉴别。
