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应用sheⅡ脚本批量分析肠道病毒Sanger测序结果
目的 编写shell脚本,批量完成柯萨奇病毒等肠道病毒Sanger测序结果的数据处理和比对分析,并为后续工作准备数据文件.方法 选择已完成手工分析的柯萨奇病毒等肠道病毒VP1基因测序文件,编写shell脚本模拟手工分析程序,顺序使用phred、phd2fasta和phrap等三个软件和单机版NCBI-BLAST软件可完成从碱基识别至序列比对的全部工作.比对结束后使用Linux命令筛选信息,生成样本和匹配的序列名称文件、基因型以及用于后续分析的序列文件.使用MEGA 6.0软件比较手工分析得到的序列与shel脚本计算得到的序列之间的相似性,评价shell脚本分析的可靠性.结果 使用shell脚本可完成所有功能.Shell脚本计算和手工分析的比对结果完全符合.结论 shell脚本分析缩短了测序结果分析中重复工作耗费的时间,使研究人员可更加专注于序列后续分析.
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转录组测序技术在癫痫中的应用
转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术作为一种新兴的测序方法,利用高通量测序平台,对特定状态下的细胞内全部RNA进行测序分析,揭示不同物种的基因表达情况以及转录调控的规律.癫痫发病原因复杂,即使具有相同突变基因的癫痫患者,临床表现严重程度不同,提示存在额外的影响因素,RNA-seq技术通过对差异表达基因的分析,在癫痫病因的研究中发挥重要的作用.文章主要介绍RNA-seq技术与其他测序技术的比较以及不同的RNA-seq技术平台特点,并叙述RNA-seq技术在癫痫中的应用.
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肝豆状核变性中医证型与ATP7B基因突变的相关性研究
目的 探讨肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)不同中医证型与ATP7B基因突变位点之间的关系.方法 101例HLD患者中医辨证分型为痰瘀互结证、湿热内蕴证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证、肝气郁结证及其他证型,采用Sanger测序法行基因突变位点检测,并分析中医证型与突变位点的关系.结果 101例HLD患者中,痰瘀互结证是常见中医证型;ATP7B基因突变常见的外显子为8,1 3,2,ATP7B基因的基因型及等位基因在HLD不同中医证型的分布中无差异(P＞0.05),性别不能造成遗传差异(P＞0.05),而不同中医证型与突变外显子之间存在差异(x2 =29.57,P＜0.05);痰瘀互结证与外显子2呈正相关(P＜0.05),湿热内蕴证与外显子8,2呈负相关(P ＜0.05,P＜0.01).结论 HLD患者中医证型与突变外显子有一定的相关性,可为HLD患者的中医辨证提供客观化依据.
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BRAFV600E突变型胃肠间质瘤10例临床病理特征
目的 探讨BRAF突变型胃肠间质瘤(GIST)分子特征的临床意义.方法 用免疫组化测序方法对10例BRAF突变GIST的临床资料、组织学形态、免疫组化及分子遗传学进行分析.结果 BRAF突变型GIST多发生于中老年人(平均年龄54.9岁),男女之比为3:7.其中7例发生于胃,3例发生于小肠;除1例高风险外,其余为低风险或极低风险.获得随访资料的7例中只有1例术后确诊肠癌,其余均无瘤生存.所有病例的组织形态以梭形细胞结构为主.免疫组化:10例肿瘤细胞CD117、DOG-1大都弥漫强(+),且SMA、desmin和S-100均为(-).测序检测10例样本C-KIT基因9、11、13、17外显子,PDGFRA基因12、18外显子,均为野生型;BRAF基因均为V600E突变.结论 BRAF突变型GIST是一类具有特殊分子遗传学改变和良好临床预后的特殊肿瘤.
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大前庭水管综合征家系特征与SLC26A4基因分析
目的：分析一个大前庭水管综合征家系的临床特征和SLC26A4基因检测特点。方法对一个大前庭水管综合征家系进行病史采集和听力学检测，绘制耳聋家系系谱图，提取受检者的基因组DNA，对所有家系成员进行耳聋基因芯片分析和SLC26A4基因全外显子及外显子侧翼序列的检测。结果该家系共5代合计30人（男17人，女13人），现存26人，其中第四代7人为耳聋患者，6人均为语前感音神经性聋。1人为语后感音神经性聋，颞骨CT显示均为前庭水管扩大，第五代1人为耳聋患者，表现为前庭水管扩大合并语前感音神经性聋。在家系中共发现SLC26A4基因c.754C>T、c.919-2A>G、c.1264-12T>A和c.1548_1549insC四种已知致病突变类型。耳聋患者均为复合杂合突变。10人为SLC26A4基因携带者。结论该家系的8例耳聋患者由SLC26A4基因复合杂合突变导致前庭水管扩大，病因学分析可为患者提供预见性的临床措施，并为该家系的后代遗传咨询与婚育指导提供理论依据及科学手段，有效地防止聋儿后代出生。
关键词： 前庭导水管扩大综合征 SLC26A4基因 基因芯片 Sanger测序 基因突变 -
Usher综合征患者致病突变基因的研究
目的 研究1例Usher综合征患者的致病突变基因.方法 选取解放军总医院院2015年4月眼科门诊1例临床诊断Usher综合征的39岁女性患者及其家系内所有成员(包括患者及非患者)为研究对象,提取其外周静脉血DNA,建立基因组DNA标本库,针对目前已知的Usher综合征致病基因,对患者基因组DNA进行目标区域捕获高通量测序,锁定该患者致病基因,并进一步对该家系中的其他成员(包括患者及非患者)进行相关突变位点的验证,终确定该患者的致病基因突变.结果 该患者致病突变定位于10q22.1的CDH23基因,由c.6253+1G＞A和c.287_288insG两个位点组成的复合杂合突变致病.在患者家系中,与患者有血缘关系的成员均具有符合Usher综合征这一单基因遗传病规律的基因型,而与患者无血缘关系的家庭成员均无上述两处基因位点的突变.结论 运用目标区域捕获高通量测序技术,可以在Usher综合征患者中实现致病基因的突变筛查,结合其他家庭成员的基因位点验证,可明确Usher综合征患者的具体致病基因突变.
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Sanger和Pyrosequencing测序法分析健康成人口腔菌群
目的 对比Sanger和Pyrosequencing测序法分析健康人口腔菌群组成.方法 收集6例健康成人唾液、舌背、黏膜、龈上及龈下菌斑并构建16S rRNA基因文库,分别用Sanger和Pyrosequencing测序法分析.结果 Sanger测序所得已知的序列有5,794条(占6,535总序列数88.7％)、75个属,396个序列划分操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs,占总OTUs的61.4％).Pyrosequencing测序所得已知的序列有10,771条(占11,103总序列数97.0％)、66个属,322个OTUs(占总OTUs的68.0％).Sanger和Pyrosequencing测序法所得口腔菌群在门、属的水平分布趋势基本一致,但在种的水平分布差异显著.Sanger和Pyrosequencing测序法构建的口腔菌群文库均匀度值分别为0.016和0.007,说明Pyrosequencing分析口腔菌群物种数量分布比Sanger测序方法的文库均匀性稍差,但优势种更显著.结论 Pyrosequencing测序时所构建基因文库能代表口腔菌群的多样性且经济、省时,可以应用于口腔细菌物种的分析.
关键词： 口腔菌群 Sanger测序 Pyrosequencing测序 -
原发性免疫缺陷病分子诊断及新发原发性免疫缺陷病
原发性免疫缺陷病(PID)是免疫系统1个或多个要素缺陷所致的一类罕见病,大多数PID为单基因遗传病.由于遗传的多效性与异质性,明确的分子诊断对PID精准诊治非常重要.Sanger测序和下一代测序(NGS)是PID分子诊断的主要工具.前者是检测单个基因以及验证NGS结果的金标准.NGS越来越多地应用于临床,但对生物信息分析的要求较高.二者各有优势与不足,需合理结合、扬长避短,才能发挥优作用.PID分子诊断的4步法策略值得借鉴.另外,对NGS的临床应用和PID分子诊断发展的一些建议也值得学习.
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应用全外显子测序对有汗性外胚叶发育不良家系致病基因突变筛查
目的 筛查外胚叶发育不良(HED)家系的致病基因.方法 收集HED家系的临床资料及DNA标本,通过全外显子测序及Sanger测序,筛查HED家系的致病基因.结果 家系中患儿为完全表型,具有典型HED三联症表现,其母亲及舅舅为非完全表型.患儿行全外显子测序发现其GBJ 2基因发生突变,而既往报道的H ED致病基因GBJ6的四个位点(G11R、V37E、D50N、A88V)均无突变;GJA1基因的V41L位点,以及GJB2的R127H、F191L位点未发现突变.Sanger测序进一步确认,GBJ2在患儿、母亲、外婆中发生突变,突变位点均为rs80338943,又名235delC,而舅舅未发现突变.结论 该结果提示GJB6并不是HED必需的或者唯一致病基因.而GJB2基因235delC位点的突变与HED的关系有待进一步确认.本研究为探明HED疾病的相关基因及分子机制提供新的线索.
关键词： 有汗性外胚叶发育不良 全外显子测序 Sanger测序 GBJ2 GBJ6 -
家族性帕金森病相关遗传基因LRRK2的差异性研究
目的 研究汉族人群家族性帕金森病的LRRK2基因的突变情况,并考察其存在的遗传差异性.方法 收集21例家族性帕金森病患者,其中有3例来源于同一家族.采集外周血,提取基因组DNA作为模板,扩增LRRK2基因上的p.K616R、p.R1441G、p.R1441C、p.Y1699C、p.G2019S、p.I2020T及p.G2385R 7种突变位点的目标区域,扩增产物经电泳验证后进行Sanger测序,分析LRRK2基因的7种突变类型在样本中的分布情况.采用123I-IMP SPECT分析来自同一家族的3例帕金森病患者的脑缺血情况.结果 Sanger测序结果显示,p.G2385R突变型有5例(23.8％),p.R1441G突变型有3例(14.3％),p.K616R突变型有2例(4.76％),而其他突变型如p.G2019S、p.R1441C、p.Y1699C及p.I2020T则未检出(0％).123I-IMP SPECT结果显示,对于来源于同一家族的3例帕金森病患者,患者2d的123I123I-IMP SPECT结果未见异常;患者1h的123I-IMP SPECT结果则显示患者双侧额叶区血流量明显下降;患者2b的123I-IMP SPECT结果则显示患者右侧基底节区血流量明显下降.结论 首次在中国人群中发现来自一个家族的3例携带p.R1441G突变基因的帕金森患者,其他基因突变型的分布频率也与以往其他地区和种族的研究结果存在明显差异,证实家族性帕金森病携带的LRRK2基因突变型及突变频率均存在区域和种族的差异性.携带p.R1441G突变基因的帕金森患者与先天性帕金森病特征存在差异,原因尚不明确.
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焦磷酸测序在帕金森病患者载脂蛋白E基因型检测中的应用
目的 基于焦磷酸测序平台建立符合临床检验要求的载脂蛋白E(ApoE)分型检测方法,使用该方法分析中国汉族人群中帕金森病(PD)与ApoE基因型的相关性.方法 扩增同时包含rs429358和rs7412位点的区段,设计两条测序引物,在同一反应体系中完成两个位点的测序反应.与Sanger测序结果进行比较,分析焦磷酸测序法的准确性.共纳入晚发散发PD患者208例和健康对照235名为受试者,分析两组受试者ApoE基因型和基因频率.结果 焦磷酸测序法可准确检测ApoE基因分型,能准确分析所有6种ApoE基因型.ApoE基因ε3/ε3型在两组受试者中为常见,其次为ε2/ε3型和ε3/ε4型,两组受试者6种基因型比较和3种等位基因比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 焦磷酸测序法是符合临床检验要求的ApoE基因分型检测方法,且ApoE基因型不是PD发病风险因素.
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武汉地区丙型肝炎病毒基因型分布及其少见基因亚型系统进化树分析
目的 研究武汉地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况,构建HCV少见基因亚型系统进化树.方法 收集武汉地区258例慢性丙型肝炎患者血浆样本,采用基于HCV非结构蛋白5B(NS5B)区的Sanger测序法对患者HCV进行基因分型,将HCV NS5B区测序结果与NCBI Genotyping tool中HCV基因型数据库进行比对,得到受检患者的HCV基因亚型,采用MEGA5.0软件对武汉地区HCV少见基因亚型进行系统进化树分析.结果 258例丙型肝炎患者样本均被成功分型,共检出6种基因亚型:1b型(71.32％)、2a型(20.16％)、6a型(3.49％)、3b型(2.71％)、3a型(1.16％)、1a型(1.16％).武汉地区HCV少见基因亚型系统进化树被成功构建.结论 武汉地区HCV优势基因亚型为1b型和2a型,6a型、3a型、3b型、1a型较少见.武汉地区3例3a型HCV可能由日本传入;大部分3b型HCV可能由越南传入,NO.379样本出现较大变异;6a型HCV可能由越南传入.
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Ion Torrent测序技术检测Ⅰ型神经纤维瘤病患者NF1基因突变
目的 评价Ion Torrent测序技术检测Ⅰ型神经纤维瘤(NF1)基因及其突变类型的可行性.方法 提取12例NF1患者的外周血DNA,用Ion Torrent个体化基因测序仪(PGM)对患者NF1基因进行测序,用Sanger测序法验证NF1基因相应的突变位点,Ion Torrent PGM检测后覆盖缺失的外显子样本用Sanger测序法重新检测.结果 检测到10例患者存在NF1基因致病突变,其中2种无义突变,5种小缺失或插入突变,1种错义突变,2种剪接突变.2例患者未检测到致病突变.结论 Ion Torrent测序技术检测舍有大量外显子的NF1基因快速、准确;NF1基因突变可导致氨基酸密码子提前终止.
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Sanger测序法和突变扩增阻滞系统法检测非小细胞肺癌EGFR基因19、21号外显子突变的临床价值比较
目的 比较Sanger测序法和突变扩增阻滞系统(ARMS)法检测非小细胞肺癌(NSCLC)EGFR基因19、21号外显子突变的临床价值.方法 收集经病理组织学确诊的NSCLC患者肺部原发或转移癌标本102例,其中石蜡包埋组织75例,病理活检标本27例;采用Sanger测序法和ARMS法检测上述标本EGFR基因19、21号外显子突变情况,分析其与患者临床病理学特征的关系.结果 ARMS法突变检出率为48.0％(49/102),高于Sanger测序法的32.3％(31/96),两者比较差异有统计学意义(P＜0.05).病理活检组织ARMS法突变检出率为57.1％(12/21),明显高于Sanger测序法的23.8％(5/21),差异有统计学意义(P＜0.05);石蜡包埋组织ARMS法和Sanger测序法突变检出率分别为49.3％(37/75)和34.7％(26/75),两者比较差异无统计学意义(P ＞0.05).女性患者EGFR基因突变检出率68.0％高于男性患者的28.8％,未吸烟患者突变检出率65.5％高于吸烟患者的27.7％,腺癌患者突变检出率62.3％高于鳞癌患者的26.8％,差异均有统计学意义(均P＜0.05);但EGFR基因突变检出率和有无淋巴结转移及年龄比较差异均无统计学意义(均P ＞0.05).结论 EGFR基因19、21号外显子突变好发于女性、未吸烟患者和腺癌患者,Sanger测序法对大组织样本及未知突变检测更有优势,ARMS法对病理活检、微小样本及要求灵敏度高的样本检测更为适合,结合2种方法检测结果更为全面可靠.
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252例结直肠癌组织中KRAS、NRAS、 BRAF、PIK3CA的基因突变分析
目的 分析结直肠癌(colorectal cancer,CRC)组织中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的常见突变类型及其与临床病理指标的关系.方法 对252例CRC石蜡包埋组织进行DNA提取,采用Sanger测序法对KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因进行检测,分析各个基因的突变率与临床病理特征的关系,并统计各个基因的突变类型.结果 252例CRC中,KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA突变发生率在性别、年龄、肿瘤部位、病理分期和有无淋巴结转移上差异均无统计学意义(P＞0.05);检测阳性突变共140例(55.5％),其中KRAS 113例(44.8％),NRAS 1例(0.4％),BRAF 19例(7.5％),PIK3CA 28例(11.1％),包括PIK3 CA与KRAS、NRAS、BRAF基因发生双突变21例(8.3％);KRAS的主要突变类型包括G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、T20M、A59T、Q61H、Q61L、Q61P;NRAS仅有1例突变为G12D;BRAF的主要突变类型为V600E、D594G、K601E;PIK3CA的主要突变类型包括E542K、E545K、Q546K、Q546P、Q546R、M1043I、H1047R.PIK3CA与KRAS、NRAS、BRAF之间会发生交叉突变,但KRAS、NRAS、BRAF三者之间基本不存在交叉突变.结论 CRC中KRAS阳性突变率居高,PIK3CA次之,BRAF、NRAS突变率低,且PIK3CA常与KRAS、NRAS、BRAF发生交叉突变.对CRC患者行KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基因检测,可正确指导并选择抗EGFR单抗药,从而实现真正意义上的个体化靶向治疗.
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中国人Burkitt淋巴瘤中ID3、TCF3及MYC基因突变分析
目的 观察中国人Burkitt淋巴瘤中ID3、TCF3和MYC基因突变情况,并探讨其意义.方法 提取32例Burkitt淋巴瘤组织DNA,经PCR扩增部分DNA片段,并采用Sanger测序法对PCR产物进行DNA序列测定.结果 ID3、TCF3的突变率分别为35.5％(11/31)、18.8％ (6/32).MYC的突变率为50％,MYC exon1的突变率为3.3％ (1/30),MYC exon2的突变率为50％ (15/30),MYC exon3的突变率为7.7％ (2/26).结论 通过Sanger测序证实在中国人Burkitt淋巴瘤组织中存在ID3、TCF3、MYC基因的重现性突变.3例中发现新的TCF3基因突变位点c.2202G＞C p.L569V.2例发现新的MYC基因突变位点c.1070A＞G p.G182D.
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比较实时荧光 PCR 法与 Sanger 测序法检测甲状腺乳头状癌BRAF基因突变
目的：分析实时荧光PCR(real-time PCR)法与Sanger测序法检测甲状腺乳头状癌患者BRAF V600E基因突变的阳性率及符合率。方法收集312例甲状腺乳头状癌手术切除标本，分别采用real-time PCR法和Sanger测序法检测甲状腺乳头状癌中BRAF V600E基因突变情况。结果312例甲状腺乳头状癌标本real-time PCR法和Sanger测序法检出BRAF基因突变的阳性率分别为65．4%(204/312)、63．8%(199/312)。 BRAF基因突变与患者性别无关，与患者年龄相关；两种方法检测结果总符合率为98．4%。结论 real-time PCR法适用于BRAF基因突变的检测。
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xTAG液相芯片技术用于肺癌 EGFR基因突变检测的临床适用性
目的：分析肺癌EGFR基因第18~21号外显子突变,以Sanger测序法为参照,探讨xTAG液相芯片用于临床样本检测的适用性。方法随机选择1139例Ⅰ~Ⅳ期肺癌组织标本,提取DNA,分别采用xTAG液相芯片法和Sanger测序法检测EG-FR基因第18~21号外显子突变情况,评价xTAG液相芯片法检测的敏感性和特异性。结果液相芯片法：共1134例患者获得基因突变检测结果,Sanger测序法：共1105例患者获得基因突变检测结果,检测成功率分别为99．56%和97．01%。以San-ger测序法为参照,xTAG液相芯片法检测的敏感性和特异性分别为99．59%和94．54%,两种方法均检出少数样本存在双外显子突变。两种方法检测出的突变型别完全吻合。结论采用xTAG液相芯片法可有效检测肺癌EGFR基因突变,实现突变分型,且相对测序法更方便、高效,适合临床推广应用。
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V HL 基因突变与肾透明细胞癌CT 影像学特点的相关性研究
目的：探讨（von hippel‐lindau ，VHL）基因与肾透明细胞癌CT影像学特点的关系。方法本研究以中国肾透明细胞癌患者为研究对象，提取基因组DNA、应用聚合酶链反应扩增 VHL基因片段后进行Sanger测序，结合CT 影像学表现进行相关分析。结果98例肾透明细胞癌患者纳入本研究，其中53例（54．1％）患者存在 V H L 基因突变。VHL基因突变在肿瘤边缘清晰（ P ＝0．041）与否及肿瘤内是否有新生血管形成（ P ＝0．006）有显著差异。结论 VHL基因突变可影响肾透明细胞癌CT影像学表现。
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经典进行性骨化性纤维发育不良症临床及ACVR1基因突变分析
目的 报道3例具有经典临床特征的骨化性纤维发育不良的患儿,对其致病基因ACVR1变异和变异来源进行分析.方法 整理3例病例的临床、影像学和随访资料.采用Sanger测序的方法对致病性热点变异位点ACVR1基因R206H位点进行检测,设计长片段PCR避免同源序列非特异扩增,利用实时定量PCR技术分析是否存在拷贝数变异,通过高通量测序检测变异来源.结果 3例患儿明确有先天性大拇趾缩短畸形、进行性异位骨化的临床特征,影像学显示双足拇指短缩畸形,多发不规则骨化影.均无家族史.3例患儿存在相同的ACVR1基因杂合错义变异(c.617G＞ A;R206H).实时定量PCR显示3例患儿及其父母不存在拷贝数变异.同时高通量测序显示其父母不存在嵌合变异,且患儿的变异频率在50％左右.结论 3例患儿具有典型骨化性纤维发育不良的临床及影像学表现,利用Sanger测序确诊.通过高通量测序的新方法、实时定量PCR技术证实患儿有新生杂合变异.
