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结核分枝杆菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表达、纯化与鉴定
目的 克隆结核分枝杆菌Rv3803c和Rv846基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中进行表达和纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组 DNA为模板,应用PCR方法扩增出Rv803c和R73846基因片段,克隆至pGEX-6P-1表达载体中,测序正确后,在E.coli Rosetta中诱导表达,GST标签亲和层析法纯化蛋白,考马斯亮蓝染色及Western-blot分析鉴定.结果 重组质粒pGEX- Rv3803c、pGEX-R v3846测序表明核苷酸序列与设计完全一致.其在E.coli Rosetta中的存在形式均为可溶部分约50％、包涵体约50％,相对分子质量约为56000和45000,纯化的GST-Rv3803c、GST-Rv3846样品纯度90％以上.完整的GST-Rv3803c的浓度大约为0.1 mg/ml,完整的GST-Rv3846的浓度大约为0.5 mg/ml.即相当于每升E.coli Rasetta培养物中,GST-Rv3803c产量为:0.25mg/L、GST-Rv3846产量为1.25 mg/L.结论 成功获得了纯化蛋白Rv3803c(MPT51)和Rv3846(SodA),为进一步研究MPT-51和SodA蛋白的辅助诊断价值、构建保护性疫苗提供了实验依据.
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结核分枝杆菌ESAT6-RpfE亚单位疫苗的构建与免疫原性研究
目的 构建Mtb ESAT6-RpfE(早期分泌抗原靶6-复活促进因子E)的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究.方法 分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表达纯化ESAT6-RpfE蛋白.采用完全随机的方法将C57BL/6小鼠分组,每组6只,共进行了两次实验,第一次实验分为ESAT6、RpfE、ESAT6-RpfE、PBS、BCG五组,佐剂为二甲基三十六烷基胺(dimethyl-dioctyldecyl ammonium bromide,DDA)；第二次实验有ESAT6-RpfE、PBS、BCG三组,佐剂为DPG[DDA+ poly(I:C)+明胶].分别于0、3、6周皮下免疫C57BL/6小鼠.末次免疫8周后,用特异性抗原ESAT6及RpfE刺激,检测其分泌IFN-γ的水平；ELISA检测血清特异性抗体IgG2b、IgG1.结果 PCR扩增的esat6、rp/E基因序列与GenBank报道一致；融合蛋白主要以包涵体形式表达；亚单位疫苗免疫动物能够分泌RpfE特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量[(427.13±100.46)]显著高于PBS组(26.13±22.34;q=7.924,P＜0.001)；分泌ESAT6刺激特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量[(506.50±140.40)]明显高于PBS组(19.25±14.75；q=11.36,P＜0.001)和BCG组(125.5±46.41；q=8.882,P＜0.001).FSAT6-RpfE免疫组能诱导产生特异性抗体.结论 成功构建并表达ESAT6-RpfE融合蛋白.此融合蛋白可在C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究.
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结核分枝杆菌Rv1419蛋白抗原表位的预测
目的 预测结核分枝杆菌Rv1419蛋白的抗原表位.方法 利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv1419氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、可及性、柔韧性、电荷分布等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位.结果 Rv1419蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,含有少数潜在的B细胞抗原肽表位(可能在67～70、72～82、142～154、131～137位氨基酸残基或其附近),这些表位抗原性较好,都含有β转角和无规则卷曲结构,呈现在表面的可能性和柔韧性都较大.该蛋白含有较多潜在的T细胞抗原肽表位(可能在5～15、18～22、29～32、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、110～114、117～123,126～128、136～140位氨基酸残基或其附近).结论 结核分枝杆菌Rv1419蛋白是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原,也存在B细胞抗原表位,本研究结果为该蛋白抗原表位的进一步研究、应用奠定了基础.
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培养滤液MPT64抗原检测结核分枝杆菌复合群生长的效能分析
目的 评价以培养滤液MPT64抗原作为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)生长指示实验(简称“MPT64检测法”)的检测效能,为建立新型结核分枝杆菌培养方法提供科学依据.方法对799例应用BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养仪器法(简称“仪器法”)进行分枝杆菌培养的培养液在培养的第42天进行MPT64检测,对1265例每隔7 d(即培养第1～6周末)进行1次MPT64检测,以出现阳性检测结果或第42天为检测终点,并和仪器法比较.应用x2检验统计分析所有样本(2064例)的检测结果,分析MPT64检测法的准确度；对1265例临测样本应用t检验分析MPT64检测法的快速性.结果 (1)在2064例分枝杆菌培养的临床样本中,仪器法报告298例MTBC、108例非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)、1521例培养阴性及137例污染(后三者即无MTBC生长),其中分别有279、6、0、2例MPT64检测阳性(即有MTBC生长),两者间差异无统计学意义(x2 =0.12,P=0.742):与仪器法的总体一致性为98.69％(2037/2064)；对仪器法报告为MTBC者MPT64检测法的阳性率为93.62％(279/298),具有较高的阳性符合水平.(2)在每周进行MPT64监测的1265例培养液样本中,两种方法均检测到MTBC者168例.其中:仪器法在培养1～6周报告阳性率分别为25.60％(43/168)、66.67％(112/168)、92.26％(155/168)、98.21％(165/168)、98.81％ (166/168)和100.00％( 168/168)；MPT64检测法的阳性检出率则分别为17.26％ (29/168)、61.90％(104/168)、89.88％(151/168)、95.24％(160/168)、98.81％(166/168)和100.00％(168/168).两者阳性报告时间差异无统计学意义(t=1.68,P=0.366).结论 MPT64检测法具有准确、快速、简便的特点,值得在临床中推广应用.
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结核抗原诱导的人外周血细胞因子调控网络在结核病诊断中的价值
目的 γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(IGRA)是目前广泛运用的结核病筛查和诊断技术,但其无法区分活动性结核病和潜伏性结核感染(LTBI).本研究旨在发现更加合适的血清标志物(细胞因子)可以替换IGRA,用于活动性结核病的诊断和LTBI者的筛查,以及这些细胞因子之间的相互调控网络关系.方法 40份健康人(简称“健康组”)血液样本,40份确诊为活动性肺结核患者(简称“肺结核组”)的血液样本,40份LTBI者(简称“LTBI组”)的血液样本;通过结核分枝杆菌特异性抗原[早期分泌抗原靶6(ESAT6)和培养滤液蛋白10(CFP10)]进行刺激;通过人细胞因子芯片对刺激后的细胞因子表达变化进行检测;并筛选显著变化的因子,进行细胞因子调控网络构建.结果 在肺结核组患者的外周血中嗜酸粒细胞趋化蛋白(CCL)1 (I-309)、趋化因子CXCL9[又称为Mig,即monokine induced by IFN-γ(IFN-γ诱导的单核因子)]、白细胞介素(IL) 10、IL6、集落刺激因子(CSF)2、CSF3、IL8、IL1α、IL7、转化生长因子(TGF)-β1、CCL2、IL2、IL13、肿瘤坏死因子(TNF)α等因子在结核特异性抗原刺激后显著上调(2.06倍至3.18倍);而在健康组和LTBI组当中却没有显著上调.在肺结核组和LTBI组患者的外周血中CCL3、IL1b、CCL8、IFN-γ、CXCL10因子在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后明显上调(2.44倍至11.56倍);而在健康组中这些因子没有明显的上调.趋化因子CCL4和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α因子在健康组、LTBI组和肺结核组外周血中,经过结核分枝杆菌特异性抗原刺激后,表达都明显上调.细胞因子调控网络显示,这些表达上调的因子,主要集中于IFN-γ和IL1α因子调控网络中.结论 CXCL10(IP-10)、CCL3、CCL8和IL1β因子可能比IFN-γ更适合用于结核病或LTBI者的筛查.
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结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究
目的 评价Mtb复苏因子DNA疫苗(resuscitation-promoting factor DNA,Rpf-DNA)对Mtb感染宿主的免疫保护作用.方法 构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗,180只BALB/c 小鼠(4周龄)分为6组,每组30只,分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫,H37Rv标准株气溶胶感染.检测血清复苏因子(Rpf)抗体、IFN-γ; RpfD、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验；检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2;对肺组织进行病理学检测和细菌负荷(CFU)计数.结果 (1)疫苗免疫组血清Rpf D、Rpf E抗体水平；Rpf D组0.32±0.1,Rpf E组0.39±0.1,BCG组0.02±0.01,空质粒组0.01±0.0,生理盐水组0.09±0.04,空白对照组0.03±0.01,RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D:45.6,43.2,45.1,45.7；Rpf E:51.6,53.6,51.0,52.2;P值均＜0.01.血清IFN-γ:Rpf D组(43.9±24.8)pg/ml,Rpf E组(45.9±21.0)pg/ml,BCG组(21.0±11.0)pg/ml,空质粒组(7.9±4.9) pg/ml,生理盐水组(4.7±2.1) pg/ml,空白对照组(5.8±4.7)pg/ml,RpfD、RpfE质粒组与BCG组比较差异有统计学意义(F值分别为Rpf D:10.2；Rpf E:12.4;P值均＜0.05),与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D:15.6,17.8,17.3;Rpf E:17.5,21.1,20.7;P值均＜0.01.(2)淋巴细胞增殖实验CCK-8:Rpf D组176.0±4.2,Rpf E组183.0±4.3,BCG组101.0±1.1,空质粒组100.0±6.8,生理盐水组104.0±8.4,空白对照组116.0±2.2,RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:9.5,10.1,10.0,9.0;Rpf E:11.2,12.9,11.7,10.3;P值均＜0.05.细胞杀伤实验:Rpf D组32.0±3.2,Rpf E组30.0±4.2,BCG组16.0±5.9,空质粒组3.3±1.5,生理盐水组6.7±0.5,空白对照组7.3±3.5,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:8.8,14.5,13.7,11.9;Rpf E:8.1,12.5,11.6,11.1;P值均＜0.05.(3) Rpf D、Rpf E蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测:IL-2:Rpf D组9.5±2.4,RpfE组9.2±1.2,BCG组2.4±2.1,空质粒组1.2±0.3,生理盐水组1.8±1.0,空白对照组1.5±0.7,Rpf D、Rpf E质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:12.5,14.6,13.5,13.9；Rpf E:12.0,13.6,13.1,13.2;P值均＜0.05.IFN-γ:Rpf D组22.2±5.7,Rpf E组28.7± 14.4,BCG组16.1±10.1,空质粒组9.8±1.6,生理盐水组13.2±2.1,空白对照组15.7±2.9,RpffD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:7.8,12.6,8.7,8.3;Rpf E:11.3,16.4,14.7,14.2;P值均＜0.05.结论 实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫,有希望成为结核病候选疫苗之一.
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结核分枝杆菌三种蛋白在结核病血清学诊断中的评价研究
目的 对结核分枝杆菌相对分子质量为38 000(以下采用38 kD表示)、线粒体通透性转换蛋白64 (mitochondrial permeability transition 64,MPT-64)和肝素结合血凝素(heparin-binding haemagglutinin,HBHA)蛋白在外周血中抗体的表达水平进行检测和比较,并对它们在结核病血清学方面的诊断价值进行评估.方法 选取2012年7月至2013年10月北京胸科医院收治的肺结核患者作为活动性肺结核(ATB)组,共78例;选取同期36例潜伏结核感染(LTBI)患者作为LTBI组;同期在北京胸科医院进行体检的31名健康人群(HC)作为HC组.将本实验室前期纯化的38 kD、MPT64和HBHA作为抗原应用于免疫学的检测,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中三种蛋白抗体的表达水平,经过统计学处理后,分别比较ATB、LTBI和HC三组之间的差异,并结合受试者工作特征曲线计算各蛋白抗原的敏感度和特异度,评价三种蛋白血清抗体的临床诊断价值.结果 ELISA检测ATB组38 kD蛋白抗体的吸光度(A)450 nm处的A值(0.343±0.120)高于LTBI组(0.221±0.102)和HC组(0.143±0.097),差异有统计学意义(t=3.07, P<0.05);MPT64抗体的A450值(0.234±0.102)高于LTBI组(0.198±0.087)和HC组(0.123±0.075),差异有统计学意义(t=3.79, P<0.05);HBHA抗体的A450值(0.263±0.113)高于LTBI组(0.188±0.091)和HC组(0.148±0.078),差异有统计学意义(t=2.70, P<0.05).以38 kD、MPT64和HBHA蛋白抗体表达水平从LTBI组鉴别ATB组时的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.78、0.61和0.62,敏感度分别为71.79%、62.82%和52.56%,特异度为72.22%、58.33%和69.44%;从HC组鉴别ATB组时的AUC分别为0.91、0.81和0.79,敏感度分别为87.17%、69.23%和73.08%,特异度为80.65%、74.19%和74.19%;从HC组鉴别LTBI组AUC分别为0.63、0.75和0.69,敏感度分别为58.33%、77.78%和63.89%,特异度为64.52%、51.61%和74.19%.结论 MTB 38 kD、MPT64和HBHA蛋白都有较好的免疫反应性,3种蛋白抗体在不同患者人群血清中的表达水平有差异,对肺结核诊断价值的评估结果表明采用ELISA对外周血中MTB蛋白抗体进行检测可作为结核病临床检测诊断的辅助方法.
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北京地区对卷曲霉素和阿米卡星耐药结核分枝杆菌的rrs和tlyA基因突变研究
目的 探讨北京地区结核分枝杆菌卷曲霉素(Cm)和阿米卡星(Am)耐药与rrs基因和tlyA基因突变相关性.方法 采用比例法对保存的临床菌株进行Cm和Am药敏试验测定,并对其中的临床菌株rrs基因和tlyA基因进行PCR、测序分析.筛选得到了10株Am耐药菌株、25株Cm耐药菌株、15株Am和Cm交叉耐药菌株,并选择了30株敏感菌株作为对照分析.数据采用SPSS 17.0进行统计分析,组间率的比较采用Fisher精确概率法检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 tlyA基因突变结果显示,Cm耐药菌株有6株突变(24.0％,6/25),与敏感菌株相比差异有统计学意义(P＜0.05),Am耐药菌株、Am和Cm交叉耐药菌株与敏感菌株相比差异无统计学意义(P＞0.05);在m基因检测中,Am耐药、Cm耐药、Am和Cm交叉耐药突变率分别有30.0％(3/10)、8.0％(2/25)和26.7％(4/15),敏感菌株中也有10.0％(3/30)突变株,3组耐药菌株与敏感菌株比较,差异均无统计学意义(F=2.353、0.06、1.161,P值均＞0.05).在3组中,rrs基因A1401G突变位点突变比例分别是10.0％(1/10)、8.0％(2/25)和13.3％(2/15),1株在Am和Cm交叉耐药双位点突变,共计6株A1401G位点突变菌株,与敏感菌株比较无统计学意义(P＞0.05).另一突变位点C1402T在Am、Am和Cm交叉耐药中各1株.结论 结核分枝杆菌tlyA基因可能与Cm耐药相关,与Am耐药不相关;rrs基因A1401G和C1402T突变可能与Am和Cm交叉耐药有关.
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复苏促生长因子结构域及其突变体重组蛋白诱导小鼠免疫应答的研究
目的 评价复苏促生长因子结构域蛋白(Rpfd)及其突变体蛋白(Rpfd1、Rpfd2)等3种重组蛋白的免疫效能.方法 2011年11月至2012年2月间,分别以本实验前期制备的重组蛋白Rpfd(A组)、Rpfd1(A1组)、Rpfd2(A2组)分别于0、2、4周免疫无特定病原体(SPF)级BALB/c小鼠,每组14只,并分别以BCG(B组)和生理盐水(C组)同期免疫同种小鼠各14只作为对照.第5周,每组取7只小鼠摘眼球取血,ELISA法检测血清特异性抗体、血清IFN-γ和IL-2表达水平；第8周,每组剩余7只小鼠用1×105 CFU结核分枝杆菌标准株H37Rv感染小鼠,第9周检测感染后小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-2水平.结果 (1)抗体水平:①Rpfd抗原包被.A1组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(0.990±0.272)高于B组(0.631±0.180) (t=4.635,P＜0.05)；A2组(1.470±0.455)高于B组(t=6.634,P＜0.05).②Rpfd1抗原包被.A组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(1.030±0.304)高于B组(0.573±0.004)(t=5.276,P＜0.05)；A1组(1.368±0.171)高于B组(t＝17.20,P＜0.05)；A2组(2.766±0.245)高于B组(t＝31.643,P＜0.05)；③Rpfd2抗原包被.A1组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(1.055±0.202)高于B组(0.538±0.100)(t＝8.009,P＜0.05)；A2组(1.605±0.544)高于B组(t=8.192,P＜0.05).(2) IFN-γ水平:①感染前.A组刺激小鼠产生IFN-γ水平[(553.47±132.00) pg/ml]高于B组[(385.28±129.07) pg/ml](t=3.150,P＜0.05)；②感染后.A1蛋白组刺激小鼠产生IFN-γ水平[(492.41±211.74) pg/ml]高于B组[(335.36±207.72) pg/ml](t＝2.874,P＜0.05)；A2组[(543.09±223.07) pg/ml]高于B组(t=3.15,P＜0.05).(3) IL-2水平:①感染前.A组刺激小鼠产生IL-2水平[(1490.05±215.35) pg/ml]高于B组[(718.70±269.29) pg/ml](t=7.763,P＜0.05)；A1组[(1738.91±358.40) pg/ml]高于B组(t=7.903,P＜0.05)；A2组[(2270.74±193.40) pg/ml]高于B组(t=16.308,P＜0.05)；②感染后.A组刺激小鼠产生IL-2水平[(806.81±306.39) pg/ml]高于B组[(335.26±176.81) pg/ml](t=4.627,P＜0.05)；A1组[(1373.22±143.75) pg/ml]高于B组(t=15.90,P＜0.05).结论 Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具有启动宿主体液免疫功能及增强宿主细胞免疫功能的双重作用,可能成为预防及治疗Mtb感染的免疫新策略.
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结核分枝杆菌利福平依赖性的初步研究
目的 从耐利福平(RFP)结核分枝杆菌临床分离株中筛选RFP依赖的菌株,并在小鼠模型中验证RFP依赖现象,同时分析RFP依赖菌株的特征.方法 采用7H11培养基绝对浓度法对46例临床分离菌株进行RFP依赖菌株筛选.以筛选得到的体外具有典型的RFP依赖现象的05116菌株建立气溶胶感染的小鼠模型,小鼠按照给药的种类和给药单位剂量分成对照组0.5％羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose sodium,CMC)、10 mg/kg Rfb(Rfb10)组、10 mg/kg RFP(RFP10)组、20 mg/kgRFP(RFP20)组,每组各10只,观察给药4、8周的体质量、肺荷菌量及组织病理学改变在各组之间差异,以验证小鼠体内是否存在RFP依赖现象.比较RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点,以鉴定RFP依赖株的特征.数据以(-x±s)表示,采用SPSS 11.0软件,组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.01为差异有统计学意义.结果 从46例RFP耐药的结核分枝杆菌临床分离株中筛选到18例RFP耐药伴依赖的菌株和28例RFP耐药非依赖的菌株.感染小鼠模型给药8周,各组小鼠的活菌计数从高到低依次为:RFP20组(lgCFU为6.60±0.82)、RFP10组(lgCFU为6.44±0.36)、Rfb10组(lgCFU为6.32±0.55)、对照组(lgCFU为6.20±0.28),接近于初感染的菌量(lgCFU为5.93±0.14),但与对照组相比差异无统计学意义(F值分别为0.68、2.21、2.45,各组P值均大于0.05).RFP耐药株8例和依赖株11例,分别有3/8和4/11的菌株在rpoB基因526位发生突变,2/8和6/11的菌株在rpoB基因531位发生突变.结论 RFP临床耐药株中RFP依赖菌的检出率高,其RFP依赖现象在小鼠体内得到初步验证.RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点基本相同,因此RFP依赖的原因是表型变异还是其他因素尚有待进一步的实验证实.
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免疫层析法试剂盒快速鉴别结核与非结核分枝杆菌临床菌株的应用价值
目的 评估免疫层析法试剂盒快速鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌临床菌株的试剂 盒应用价值.方法用免疫层析法试剂盒检测240株分枝杆菌菌株和50株其他微生物菌株,包括38株细菌、12株真菌、65株NTM,175株结核分枝杆菌临床菌株.结果 结核分枝杆菌株检测阳性为173株,灵敏度为98.9%;115株其他微生物菌株检测结果 均为阴性,特异性100%.结论 免疫层析法试剂盒能快速、准确鉴别结核与非结核分枝杆菌临床菌株,无需其他设备.
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结核分枝杆菌特异性蛋白(TB-SA)抗体检测试剂在结核病诊断中的应用研究
目的 评价结核分枝杆菌特异性蛋白(tuberculosis specific antigen,TB-SA)抗体检测试剂在结核病中的应用价值.方法 以天津市和平区结核病控制中心、山东省烟台芝罘区肺科医院和河南省南阳市卧龙区结核病防治中心为研究现场,连续纳入2012年4月至10月门诊就诊的所有肺结核疑似患者944例,同时纳入110名健康志愿者作为对照.对所有纳入患者及健康志愿者进行痰涂片、培养、结核菌素试验(PPD)和胸部X线检查,签署知情同意书后留取血清进行TB-SA抗体检测.痰涂片采用萋-尼(Ziehl-Neelsen)染色法,培养采用接种酸性罗氏固体培养基培养.现场数据由双人录入,在国家结核病参比实验室统一整理分析.结果 755例确诊的活动性结核病患者,TB-SA抗体检测法阳性率为74.8％(565/755,95％CI=71.7％～77.9％),远高于涂片阳性率25.6％(193/755)(x2=366.59,P＜0.0001)和培养阳性率39.6％(299/755)(x2=190.12,P＜0.0001).在培养阳性结核病患者中,TB-SA抗体检查敏感度为88.5％(255/288,95％CI=84.8％～92.2％).在菌阴活动性结核病患者中,TB-SA抗体检查敏感度为68.0％(310/456,95％CI=63.7％～72.3％).TB-SA抗体检测法在活动性结核病患者中的阳性预测值为92.3％(565/612,95％CI=90.2％～94.4％),在健康人群中检测特异度为97.3％(95％CI=94.3％～100.3％).结论 TB-SA抗体检测法在结核病患者中阳性检出率显著高于涂片和培养,适用于结核病,特别是菌阴结核病的诊断；TB-SA抗体检测法诊断结核病的特异度高,可用于人群健康体检.
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结核分枝杆菌重组蛋白Rv0222的表达及血清学鉴定
目的 构建Mtb重组蛋白Rv0222的重组质粒,评价其用于结核病血清学诊断的价值.方法 通过PCR从Mtb染色体基因组中扩增出Rv0222基因片段,插入pMD18-T载体后,再亚克隆入表达载体pET30a中,诱导表达重组菌,组氨酸标签(His-tag)亲和层析纯化蛋白,通过免疫印迹法分析重组蛋白的免疫反应性,通过间接ELISA方法检测142例血清样本,来自82例结核病患者(痰涂片或痰培养阳性,抗结核治疗症状减轻者),28例非结核病患者(8例肺癌、15例肺炎和5例肺气肿)和32例健康体检者,检测数据通过专业医学软件MedCalc 11.5.0分析ROC曲线下面积和佳阳性判定值.结果 成功构建重组载体,重组蛋白Rv0222经电泳后显示相对分子质量约为27 000,镍柱纯化后蛋白纯度达95％以上,通过蛋白免疫印迹法证实重组蛋白Rv0222与结核病患者血清能特异性结合.酶联免疫检测ROC曲线下面积为0.893,佳阳性判定值为0.12时,结核病患者组抗体检测敏感度为69.5％(57/82),非结核病患者和健康体检者抗体检测特异度为90.0％(54/60),结核病患者与非结核病患者及健康体检者相比,差异有统计学意义(t=25.78,P＜0.0001).结论 成功构建pET30a-Rv0222表达载体,获得高纯度的重组蛋白Rv0222,ELISA结果显示Rv0222蛋白有望成为结核病血清学诊断的有效抗原之一.
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131株耐多药结核分枝杆菌对利福布丁与利福平交叉耐药的研究
目的 观察利福布丁对MDR-TB菌株的抑菌效力及其与利福平的交叉耐药性,了解对利福布丁与利福平交叉耐药菌株rpoB基因突变特征.方法 采用间隔抽样法,从2007-2008年全国结核病耐药基线调查的401株MDR-TB菌株中抽样,传代后获得131株MDR-TB菌株.用微孔板Alamar blue法测定利福平和利福布丁对MDR-TB菌株的低抑菌浓度(MIC),采用直接测序法检测MDR-TB菌株rpoB基因突变,分析rpoB基因突变对两者交叉耐药性的影响.采用SPSS 11.0软件进行统计分析,交叉耐药率比较采用x2检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 在131株MDR-TB菌株中,利福平MIC中位数值为256μg/ml,利福布丁MIC中位数值为2 μg/ml.通过测定MIC的方法,利福平与利福布丁交叉耐药率为76.47％(91/119).在MDR-TB菌株中,发生rpoB基因突变113株(86.26％,113/131),包括531、526、516、513、511、522、533等7种单位点突变,其中以密码子531(56.50％,74/131)、526(16.03％,21/131)突变为常见.不同rpoB基因突变的MDR-TB菌株,526、531位点突变出现利福平与利福布丁交叉耐药的比例高,分别占90.48％(19/21)、78.38％(58/74),与无突变组(44.44％,8/18)比较,差异均有统计学意义(x2值分别为9.641、8.223,P值均＜0.05).结论 利福布丁与利福平存在交叉耐药性,但利福布丁有更强的抑菌能力.MDR-TB菌株不同rpoB突变类型,利福平与利福布丁交叉耐药性不同.
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5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性分析
目的 评价14、16、38 kD、mtb81和ESAT-6等5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性.方法 利用14、16、38 kD、mtb81和ESAT-6等5种重组蛋白建立ELISA方法,检测120份结核病人、30份非结核呼吸道感染病人和30份健康人血清中相应抗体.结果 ELISA显示5种结核杆菌特异性蛋白质的特异性均高于95%;敏感性和准确性则不尽相同,其中38 kD的检测敏感性高,为80.8%;14、16 kD、mtb81和ESAT-6的检测敏感性分别为52.5%、68.3%、35.8%和44.2%.结论 5种结核杆菌特异性蛋白质均具有不同程度的抗原性.进一步提高抗原或抗体的检测灵敏度将有利于结核病的诊断.
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基因芯片检测耐利福平结核分枝杆菌准确性的Meta分析
目的 对基因芯片方法在检测耐利福平结核分枝杆菌的准确性进行系统评价,为基因芯片技术应用于临床检测耐药结核分枝杆菌的必要性提供证据.方法 计算机检索The Cochrane Library(2014年第1期)、PubMed、EMbase、Wanfang Data、CNKI数据库,检索时限均为建库至2014年2月.由2位研究者根据纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料,采用评价诊断准确性质量研究(quality assessment of diagnostic accuracy studies, QUADAS)条目评价纳入研究论文的方法学质量,检出相关文献223篇,按照标准纳入22篇文献.采用Meta-DiSc1.4软件对其敏感度(SEN)、特异度(SPE)、阳性似然比(十LR)、阴性似然比(-LR)、诊断比值比(DOR)进行异质性检验和合并分析,绘制汇总受试者工作特征(SROC)曲线,计算曲线下面积(AUC).结果 共纳入22篇文献(包括一篇多中心研究文献),25个研究,包括4879株经传统药敏试验鉴定结核分枝杆菌菌株,其中耐RFP菌株(1314株)、敏感菌株(3565株).基因芯片技术检测Mtb对RFP耐药的SEN合并为0.89[95 ％CI (0.87～0.91)]、SPE合并为0.98[95％ CI(0.97～0.98)]、+LR为30.89[95％CI (22.15～43.06)]、-LR为0.10[95％ CI (0.07～0.15)]、DOR合并为354.06[95％CI (212.09～591.07)]、AUC为0.9833.结论 基因芯片方法具有较好的诊断价值;以传统药敏法为金标准,基因芯片方法特异度、敏感度,诊断OR值均较高,说明其在Mtb对RFP耐药检出率较高,可作为临床结核分枝杆菌耐药检测的辅助手段.
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重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性
目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗(BCG)CFP32,分析其抗原性.方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因.经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、鉴定,Western blot和间接E1.ISA分析重组蛋白的抗原性.结果 构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32.CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310g/L.纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%.结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32.
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结核分枝杆菌早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)对人THP-1单核细胞IL-12产生的影响
目的 研究结核分枝杆菌早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)对人THP-1单核细胞IL-12产生的影响及其作用的细胞信号传导机制.方法 应用亲和层析方法纯化大肠埃希菌表达重组的结核分枝杆菌ESAT-6抗原,采用ELISA法检测不同浓度ESAT-6刺激人THP-1单核细胞IL-12产生的影响,以及对LPS刺激的反应,应用各种细胞信号传导通路抑制剂来探讨ESAT-6诱导单核细胞IL-12产生相关可能的信号通路.结果 结核分枝杆菌ESAT-6分泌抗原在2.5～10 g/ml浓度范围能依赖性地刺激人THP-1单核细胞产生IL-12(p70及其亚单位p40).细胞信号传导通路JNK-MAPK的选择性抑制剂SP600125能促进ESAT-6刺激单核细胞IL-12p40产生,而信号通路PKR抑制剂2-AP有显著性抑制其作用.结论 ESAT-6抗原诱导人THP-1单核细胞IL-12产生,JNKMAPK及PKR信号通路可能参与了此过程的调控.
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重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对不同分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应研究
目的 研究重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对临床常见致病分枝杆菌及常见环境分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应.方法 以鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌脓肿亚种、偶发分枝杆菌、草分枝杆菌、微黄分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌与卡介菌等16株菌株的活菌菌液分别经腹股沟皮下攻击豚鼠,每组5只,3～4周后,分别皮内注射TB-PPD、PPD-B和重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白各0.1ml,于注射后24、48 h观察局部硬结的纵径与横径,根据48h的反应结果进行判定.结果 PPD-B对16种分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5；TB-PPD对结核、牛、非洲分枝杆菌和卡介菌等活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5；重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对结核、牛和非洲分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5；而对鸟、胞内、蟾蜍、堪萨斯、海、瘰疠、戈登、苏加、龟脓、偶发、草、微黄和卡介菌等分枝杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试反应均呈阴性,阳性比例均为0/5.结论 重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白能提高结核分枝杆菌感染诊断的特异度并能区别结核分枝杆菌是否存活、卡介菌致敏导致的皮试超敏反应.
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结核亚单位疫苗AEC/BC-C02诱导小鼠长期的抗原特异性细胞应答
目的 动态评价结核亚单位候选疫苗AEC/BC-C02在小鼠中的细胞免疫应答水平.方法 6～8周龄SPF级BALB/c雌鼠48只,按数字表法随机分成两组,一组免疫AEC/BC-C02,另一组免疫PBS.末次免疫后第1、2、4、8周分别取两组小鼠(6只/组)分离脾淋巴细胞,ELISPOT检测分泌抗原特异性IFN-γ的T细胞频率；在第2、4、8周ELISA检测抗原特异性IFN-γ的分泌量；在第4、8周,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测脾淋巴细胞增殖.结果 (1)末次免疫后第1、2、4、8周,对疫苗组小鼠脾淋巴细胞,Ag85B特异性的IFN-γ斑点形成细胞(spot forming cells,SFC)分别为168.8±103.5、205.2±51.0、206.8±65.3和160.0±67.9,与PBS对照组的8.9±6.0、16.1±18.8、9.3±4.9和7.7±6.6比较,差异均有统计学意义(成组t检验,t值分别为3.779、8.525、7.424、5.473;P值均＜0.01)；EC特异性的IFN-γ SFC分别为45.1±18.6、75.6±39.3、86.2±50.4和54.3±26.3,与PBS对照组的4.5±3.5、11.7±10.5、3.8±5.8和5.2±4.3比较,差异均有统计学意义(成组t检验,t值分别为5.258、3.850、3.977、4.521；P值均＜0.01).(2)末次免疫后第2、4、8周,对疫苗组小鼠脾淋巴细胞,Ag85B多肽刺激的IFN-γ分泌量分别是(1.27±0.13) ng/ml,(1.76±0.55) ng/ml和(1.44±0.44) ng/ml;EC多肽刺激的IFN-γ分泌量分别是(0.81±0.33) ng/ml,(0.81±0.69) ng/ml和(0.54±0.29) ng/ml,两者间差异有统计学意义(配对t检验,分别为:t=3.008,P＜0.05;t=2.631,P＜0.05;t=10.02,P＜0.01).(3)末次免疫后第4、8周,Ag85B多肽对疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数(SI)分别为1.756±0.339和1.936±0.287,均分别高于PBS组的1.287±0.0581和1.382±0.114,差异有统计学意义(成组t检验,分别为:t=3.030,P＜0.05;t=4.387,P＜0.01)；EC多肽对疫苗组SI分别为1.599±0.154和1.581±0.156,均分别高于PBS组的1.380±0.126和1.314±0.170,差异有统计学意义(成组f检验,t值分别为2.540、2.844;P值均＜0.05).结论 新型结核亚单位疫苗AEC/BC-C02免疫小鼠可诱导长期稳定存在的抗原特异性记忆T细胞,为后期抗Mtb保护力研究提供药理学基础.
