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4种甲型H1N1流感病毒试剂盒检测效果对比分析
目的 对比分析4种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒的实际检测效果,为试剂盒的开发和改良提供参考.方法 采用Real-time RT-PCR法检测甲型H1N1流感病毒,利用SPASS 13.0软件进行数据分析.结果 不同检测试剂盒其检出阳性率不同,其中试剂盒A和试剂盒C的检出阳性率均为100％,试剂盒B为95％,而试剂盒D检出阳性率仅为80％.以单个指标为研究对象,经方差分析及SNK检验,显示4种检测试剂盒对每个指标的检测效果都存在显著差异,其扩增效率有明显不同.结论 试剂盒A、B和C均可检测甲型H1N1流感病毒而试剂盒C灵敏性稍高更适宜用于初筛,试剂盒D技术上需要进一步改进.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 试剂盒 检测效果 逆转录聚合酶链反应 -
应用逆转录聚合酶链反应分离戊型肝炎病毒基因
应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从新疆东部一起戊型肝炎(HE)流行期间3例HE病人的4份粪便标本中分离到了含665个核苷酸硷基对的戊型肝炎病毒(HEV)基因片段.核酸序列分析结果与缅甸HEV株(ET1.1)相比,核苷酸序列同源性为91.5%,氨基酸序列同源性为98.0%.
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S100A9在大肠腺瘤和大肠癌中的表达及与临床病理相关性分析
目的 探讨Sl00A9蛋白在大肠腺瘤和大肠癌组织中的表达及其临床病理意义.方法 采用免疫组化和实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测31例大肠腺瘤组织,53例大肠癌组织及癌旁大肠组织中Sl00A9蛋白的表达情况.结果 在癌旁大肠组织中S100A9蛋白不表达;在大肠腺瘤组织中S100A9蛋白的表达率为25.8%(8/31);在大肠癌组织中Sl00A9蛋白的表达率为71.7%(38/53);与癌旁大肠组织、大肠腺瘤组织比较差异有统计学意义(P<0.05).S100A9蛋白在大肠癌中的表达与组织分化程度有关(P<0.05),与其它临床病理因素无关(P>0.05).结论 S100A9蛋白可能在大肠癌发生、发展中发挥作用,可能为新的生物标志物.
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利用血清中HCV抗体与HCV-RNA检测筛查丙型肝炎患者
目的 比较逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV-RNA和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)对在丙型肝炎诊断中的对比分析的结果是否存在差异.方法 随机选择200份血清标本(其中强制戒毒人员血清标本150件、VCT门诊10件、美沙酮门诊20件、妇教所20件),分别开展HCV-RNA和抗-HCV检测.结果 200份标本中抗-HCV和HCV-RNA检测结果均阳性者61例,占30.5％ (61/200);抗-HCV阴性、HCV-RNA阳性29.例,占14.5％ (29/200);抗-HCV阳性、HCV-RNA阴性19例,占9.5％(19/200);两者均阴性的91例,占45.5％(91/200).2种方法总符合率为76％,两者检测结果经统计学分析差异无统计学意义(P＞0.05),不同人群两种检测结果一致性比较差异有统计学意义(P＜0.05),VCT门诊两种检测结果一致性显著高于其他人群.结论 抗-HCV抗体检测和荧光定量RT-PCR检测HCV-RNA,在实际工作中两者同时检测,可提高检出率.
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脆性组氨酸三联体基因与宫颈癌发病的关联研究
目的:探讨脆性组氨酸三联体(FHIT)基因与宫颈癌发病的关系.方法:采用巢式逆转录聚合酶链反应(nested RT-PCR)及DNA 直接测序法对15例正常宫颈组织、30例宫颈癌组织及配对癌旁正常组织、宫颈癌Hela细胞系进行FHIT基因异常转录分析,并选择1例正常转录本及2例异常转录本进行DNA 序列分析.结果除7例宫颈癌组织及1例癌旁正常组织外,其余标本均扩增出FHIT基因野生型转录本.Hela细胞系同时存在野生型及异常转录本.FHIT 基因的异常转录率在宫颈癌组织为47% (14/30),高于癌旁正常组织20%(6/30)及正常宫颈组织13%(2/15),差异均有显著性(P<0.05).FHIT基因的异常转录与癌组织的生物学特性无关.DNA 测序证明异常转录本为FHIT基因多个外显子的缺失及DNA 序列的插入.结论FHIT基因的异常转录是宫颈癌组织及Hela细胞系中的常见事件,可能与宫颈癌的发生有关.
关键词： 子宫颈肿瘤 基因脆性组氨酸三联体 逆转录聚合酶链反应 转录 遗传 -
不同破壁方法提取结核分枝杆菌总RNA的比较
目的 建立简便有效的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)总RNA提取方法.方法 采用5种方法,分别为160、240和400 W超声波联合Trizol法(简称“160W超声法”、“240W超声法”和“400 W超声法”)、玻璃珠(简称“玻珠”)联合Trizol法(简称“玻珠法”)和Trizol法(简称“不加玻珠法”),对结核分枝杆菌标准株H37Rv进行破壁,提取总RNA.通过荧光定量逆转录PCR评价不同破壁方法对Mtb总RNA提取效果的影响,以灭菌超纯水代替模板为阴性对照.每种方法分别提取3份样本进行检测.后结果为3份标本的平均值.结果 玻珠法检测组Ct值为20.67,△Rn值为0.644;400W超声法检测组Ct值为22.09,△Rn值为0.571;240W超声法检测组Ct值为21.86,△Rn值为0.503;160W超声法检测组Ct值为25.21,△Rn值为0.411;不加玻珠法检测组Ct值为28.40,△Rn值为0.299;阴性对照Ct值为40.00,△Rn值为0.000.结论 直观地从试验结果来看,玻珠法对结核分枝杆菌破壁效果好于超声法.
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逆转录聚合酶链反应检测疟原虫混合感染的研究
[目的]建立在同一反应体系中能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟的一步逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,并用于国境口岸归国劳务人员的疟疾检测.[方法]以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计恶性疟原虫和间日疟原虫的上游通用引物和各自的下游特异性引物,在同一反应体系中同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段,对疟疾患者的PCR产物进行序列测定和分析.[结果]用建立的RT-PCR检测方法对广东口岸回国劳务人员中发现的2名疟疾患者的不同采样时间的全血进行检测,2006年10月和2007年1月采集的样本被分别扩增出预期大小为360bp和450bp特异扩增带,推测2名患者为恶性疟原虫和同日疟原虫的混合感染,其在入境时处于恶性疟的发作期和间日疟的潜伏期,均属于典型的集体输入性疟疾案例.[结论]RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对国境口岸疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值.
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补充验证试验在抗-HCV检测中的应用
[目的] 探讨补充验证试验在一般人群抗-HCV检测中的应用.[方法] 应用重组免疫印迹实验(RIBA)对血清抗-HIV酶联检测结果阳性者进行抗-HCV确认,并应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV RNA.[结果] 2002～2003年福州市部分人群血清抗-HCV酶联检测的阳性率为0.59%,低于贵州出入境人群和部分地区无偿献血员的抗-HCV检出率,而与长沙和南京地区无偿献血员的检出率相近.抗-HCV酶联检测阳性者经RIBA确认,仅1例阳性,6例为阴性,另有5例结果为不确定.5例不确定者的血清经RT-PCR检测HCV RNA,结果均为阴性.[结论] RIBA和RT-PCF作为抗-HCV酶联检测的补充试验有助于抗-HCV检测结果的确认和解释,可在抗-HCV中推广应用.
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EV71和Cox A16型肠道病毒RT-PCR检测方法的研究
目的 建立咽拭子标本中EV71和Cox A16型肠道病毒逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法.方法 根据GENBANK数据库中EV71和Cox A16型肠道病毒的基因序列,利用CLUSTAL软件进行序列比对分析,选择基因组的保守序列,并借助引物设计生物信息学软件,设计筛选出一套针对EV71和Cox A16型肠道病毒的RT-PCR扩增的引物.从特异性、低检测限、重复性等方面进行评估,建立了EV71和Cox A16型肠道病毒RT-PCR检测方法.结果 RT-PCR方法对EV71和COXA16病毒的低检测量分别为63 TCID50/ml和32 TCID50/ml.其他病原微生物及人类基因组在该系统无反应信号,显示方法特异性良好.结论 RT-PCR对手足口病病原体检测准确性高、特异性强,具有快速、经济等特点,适合手足口病的早期诊断.
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克里米亚-刚果出血热病毒特征核酸序列克隆载体的构建
[目的]构建含有克里米亚-刚果出血热病毒特征序列的克隆载体.[方法]设计RT-PCR引物及反应体系,从克里米亚-刚果出血热病毒RNA中扩增获得目的序列,进行分离纯化和回收,将纯化的扩增片段与pMD18-T载体进行连接,进行酶切鉴定与测序鉴定.[结果]确定检测克里米亚-刚果出血热病毒一步法RT-PCR的反应条件及体系,引物终浓度为400nmol/L,反应条件为:50℃ 30 min,94℃4 min,94℃ 30s,57℃ 30 s,72℃30 s,35cycles.成功将CCHF的特征序列片段克隆,pMD18-T载体经DNA测序鉴定正确.[结论]构建的pMD18-CCHF质粒,可用于克里米亚-刚果出血热病毒RT-PCR实验的阳性对照.
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丙型肝炎病毒抗体检测试剂的比对研究
[目的]通过对丙型肝炎病毒抗体检测试剂的比对检测,探讨诊断试剂盒的性能效果.[方法]采用6种第三代丙型肝炎病毒抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂检测抗-HCV,并应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV-RNA作为验证试验.[结果]对2005-2007年518份血清(包括抗-HCV检测阳性血清)进行检测,A试剂阳性检出率高为5.79%,C、D试剂检出阳性率低为3.47%.与12份PCR检测阳性结果为吻合的试剂为A、F试剂,都是11份阳性(符合率为91.7%).[结论]A和F试剂是检测抗-HCV较理想的试剂.
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利用逆转录聚合酶链反应在瑞士进口的矿泉水和瓶装矿泉水中发现类诺沃克病毒(HIV)
Beuret C,Kohler D,Luthi T等人于2000年11月在《J Food Prot》杂志上发表文章，介绍了在瑞士进口矿泉水中发现类诺沃克病毒(NLV)的情况。NLV病毒是萼状病毒(小杯状体)属。由NLVs引起的大多数非细菌性肠炎是通过痰及浮尘传播的。在美国由已知的食源性病原体引起的疾病中估计有67%是由NLVs引起的，许多疾病的爆发与摄入首次污染与再次污染的食品有关。还没有由污染的矿泉水引起疾病的流行的报道。对进口瑞士或在瑞士装瓶的29个不同品牌的63个矿泉水样本进行了NLV序列检测。通过逆转录聚合酶链反应检出21个矿泉水样中存在NLV。在污染的试样中有2种NLV基因组(genogroups,gg)—基因组Ⅰ和Ⅱ。发现NLV序列与瓶子的特征或化学性质(矿化\,pH)或碳酸无关。12种NLV阳性试样的核苷酸序列抽样分析排序显示出几个点突变。所有gg Ⅰ型NLV菌株与一般的Desert Shield有70%～87%病毒(U04469)类似，gg Ⅱ型NLV菌株与Camberwell病毒(U46500)有89%～93%的相似点。文章还讨论了矿泉水中出现NLV病毒的几个可能原因。(刘瑕供稿 郑云雁校)
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太原市SARS亚临床感染现象及其公共卫生学意义
文献报道无症状严重急性呼吸综合征(SARS)密切接触者呼吸道分泌物和粪便逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测结果表明,316名受试者中,32例为SARS冠状病毒(CoV)阳性,阳性率为10.13%[1].太原市SARS血清流行病学调查324例无症状SARS密切接触者中,SARS-CoV抗体阳性率为4.63%[2].以上研究均表明,存在SARS亚临床感染现象.为此我们探讨SARS亚临床感染现象及其公共卫生学意义.
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逆转录聚合酶链反应在轮状病毒肠炎诊断中的应用研究
1.材料与方法:150份粪便标本于1999年11月至2000年2月取自本院住院的急性腹泻患儿.150例患儿年龄为40天龄～2岁;病程1～14天.收集每例腹泻患儿的新鲜粪便标本2份,1份立即进行乳胶凝集试验,1份置于-20℃冰箱待行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测.RT-PCR参照Taniguchi等[1]的方法抽提RNA并做HRV RT-PCR反应,引物由上海生工合成.
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用分子生物学方法确诊一例登革1型病毒感染病例
2004年8月广州军区总医院收治1例登革热(DF)疑似病例,我们用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行了确诊与分析.
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纳米SiO2暴露对人支气管上皮细胞microRNA表达水平的影响
目的：探讨纳米SiO2短期及长期暴露对人支气管上皮细胞（16HBE）microRNA （miRNA）表达水平的影响。方法分别以5、10、15、20、25、30、40μg/ml纳米SiO2溶液处理16HBE细胞24 h，采用CCK-8法检测细胞活性，并计算细胞增殖活性抑制率及半抑制浓度（IC50）。以10μg/ml纳米SiO2溶液处理16HBE细胞至第10代（P10）和30代（P30），作为长期染毒组，并设立对照组（P0）；以1/4 IC50、1/2 IC50、IC50浓度的纳米SiO2溶液和IC50浓度的微米SiO2溶液处理16HBE细胞24 h，作为短期染毒组，并设立无血清培养液组为对照组。用安捷伦miRNA微阵列芯片筛选P0、P10、P30组细胞差异表达的miRNA，并用逆转录荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法验证短期及长期染毒组与对照组miRNA的表达差异。结果纳米SiO2溶液染剂量为5、10、15、20、25、30、40μg/ml的16HBE细胞增殖活性抑制率分别为：（-3.33±3.80）%、（20.40±11.73）%、（39.08±5.53）%、（55.10±5.78）%、（66.42±9.60）%、（71.67±7.34）%、(81.43±5.37)%（F=129.11，P<0.001）；IC50（95%CI）为18.35（15.82~20.72）μg/ml。长期染毒组中，P10、P30及P0细胞的miRNA-494-3p表达水平分别为0.45±0.08、0.28±0.07和1.00（F=60.77，P<0.001）；miRNA-19a-3p表达水平分别为2.27±0.45、1.06±0.19和1.00（F=30.05，P<0.001）；miRNA-148b-3p的表达水平分别为1.78±0.29、0.88±0.19和1.00（F=30.23，P<0.001）。短期染毒组中，5、10、20μg/ml纳米SiO2溶液及20μg/ml微米SiO2溶液染毒组的miRNA-494-3p表达水平分别为0.99±0.04、1.38±0.19、2.13±0.14、0.81±0.25（F=57.03，P<0.001）；miRNA-19a-3p的表达水平分别为0.91±0.03、1.12±0.03、0.53±0.01、0.86±0.01（F=408.78，P<0.001）；miRNA-148b-3p的表达水平分别为0.95±0.02、1.22±0.00、0.54±0.02、1.15±0.04（F=264.14，P<0.001）。结论纳米SiO2短期及长期染毒可诱导16HBE细胞miRNA表达水平的变化,其中，长期和短期染毒对miRNA-494-3p的表达水平影响不同。
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溴氰菊酯对大鼠脑组织脑源性神经生长因子表达的诱导
目的研究溴氰菊酯(DM)对中枢神经系统损害的机制.方法用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、流式细胞分析及免疫组化技术检测溴氰菊酯对大鼠大脑皮层和海马脑源性神经生长因子(BDNF)表达的影响.结果大鼠经DM一次大剂量(DM1)和多次小剂量(DM2)处理后,大鼠大脑皮层和海马的BDNF mRNA及蛋白水平均有明显升高.RT-PCR结果表明,DM1和DM2组大鼠皮层和海马BDNF mRNA的水平分别较对照组高出48%、56%、59%、和54%;斑点杂交结果亦显示,DM1和DM2组大脑皮层和海马的BDNF mRNA分别是对照组的186%、161%、148%和158%,与RT-PCR结果基本一致;流式细胞分析结果表明,DM1组和DM2组大鼠皮层和海马BDNF蛋白表达量分别较对照组高53%、8%和45%、46%;免疫组化结果表明,DM1和DM2组大鼠皮层的蛋白水平分别是对照组的129%和147%,与流式细胞分析一致;而海马主要是DM1组的CA1、DG区和DM2组CA3、DG区明显高于对照组.结论 DM在体内明显诱导大鼠大脑皮层和海马BDNF的表达,可能在其神经损伤修复中有重要意义.
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70例手足口病病原检测和临床分析
目的 分析研究70例手足口病患者的临床一般情况及其致病原.方法 采集70例手足口病患者(其中5岁以下儿童患者60例)的咽拭子标本,提取病毒RNA.用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)一步法检测肠道病毒(EV)的5'-UTR区基因、肠道病毒71型(EV71)的Vp3～Vp1区基因、柯萨奇病毒A16(Cox-A16)的Vp3～Vp1区基因.结果 在70例手足口病患者中,咽拭子标本肠道病毒核酸阳性率为42.8%(30/70).在30例肠道病毒核酸阳性病原中,EV71占66.7%(20/30).5岁以下儿童有EV71肠道病毒、或Cox-A16病毒、或非EV71及非Cox-A16的其他肠道病毒感染病例.而5岁以上的儿童和成人患者则只有EV71肠道病毒感染病例.39例4 d内采集的咽拭子标本病原核酸阳性检测率平均为66.7%(26/39),31例5 d以后采集的标本病原核酸阳性检测率是12.9%(4/31),差异有统计学意义(x~2=20.4,P<0.01).结论 手足口病以0～5岁婴幼儿患病为主,但成人也可发病.用RT-PCR检测病原核酸阳性的手足口病患者以EV71为主,且以发病后4 d内阳性检测率高.
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用逆转录聚合酶链反应方法检测SARS冠状病毒
目的应用双位点逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和改良巢式实时RT-PCR方法检测临床标本中SARS冠状病毒(SARS-CoV)核酸,以提高检测的可靠性和灵敏度.方法对2003年杭州市3例严重急性呼吸综合征(SARS)临床确诊患者、4例疑似和27名医学观察者的咽拭子标本用巢式实时RT-PCR检测SARS-CoV核酸,对阳性扩增产物进行核酸序列测定,同时对3例患者的标本应用半巢式RT-PCR检测另一位点SARS-CoV核酸片段,并应用常规实时RT-PCR技术及改良实时RT-PCR技术进行检测.结果 3例患者的巢式RT-PCR检测结果2例阳性,4例疑似和27名医学观察者均为阴性;阳性扩增产物的核酸序列与SARS-CoV基因组相应部分序列完全一致.3例患者标本的另一位点的半巢式RT-PCR及实时RT-PCR结果均相同.在检测低拷贝数标本时,常规实时RT-PCR技术在约35个循环后出现弱阳性信号,但改良的巢式实时RT-PCR技术可使强阳性信号在10个扩增循环后出现.结论双位点RT-PCR方法是提高检测准确性的有效方法,改良巢式实时RT-PCR技术较常规实时RT-PCR技术具有更高的灵敏度.
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革螨及恙螨体内肾综合征出血热病毒定位的研究
目的确定肾综合征出血热病毒(HFRSV)在螨体内的定位.方法用原位RT-PCR技术检测HFRSV在螨体内的分布.结果 HFRSV多见于革螨及恙螨的卵巢卵细胞、中肠及中肠支囊上皮细胞的细胞核周围,呈弥散分布,前体组织细胞少见,其他组织细胞未见.革螨子4代、子3代和恙螨若虫阳性颗粒多于革螨子2代、子1代和恙螨幼虫.结论从分子生物学水平进一步证明革螨及恙螨可作为肾综合征出血热的传播媒介.
