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3种方法检测HBV YMDD变异的比较
目的比较3种方法检测HBV YMDD变异.方法选择101例慢性乙型肝炎患者为研究对象,其中61例服用拉咪夫定(100mg/d,6-24个月),40例未用拉咪夫定治疗,分别应用基因芯片、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和多基因/位点快速检测技术(UniArray技术)检测HBV YMDD变异,比较3种方法的变异检出率.同时以27例服用拉咪夫定过程中HBV DNA出现"反跳"的病例,作为临床诊断HBV YMDD变异的标准,与3种方法同步比较,计算出3种方法的灵敏度,特异度等指标.后选择5例变异阳性标本进行测序.结果基因芯片,PCR-RFLP和UniArray技术检测HBV YMDD变异的检出率分别为59.41%(60/101),26.73%(27/101),37.62%(38/101).3种方法有显著性差异(P＜0.005).经两两比较,基因芯片与PCR-RFLP 和UniArray技术均有明显差异(P＜0.005),而PCR-RFLP和UniArray技术无显著性差异(P＞0.05).3种方法检测的灵敏度、特异度分别为96.3%、70.3%;40.7%、85%;55.6%、85%.测序结果证实,5份变异标本与基因芯片结果基本一致,同时2份与UniArray结果也基本一致.并且基因芯片与UniArray技术能同时检测出混合变异味.结论3种方法比较,基因芯片检测HBV YMDD变异检出率高,具有较高的灵敏度和较好的特异度,并能同时检测出野生株和变异株的共同感染,与测序结果相符,是诊断HBV YMDD 变异较好的方法.新的UniArray技术与传统的PCR-RFLP方法相比,特异度相当,但灵敏度较好,与测序结果相符.以上结果提示,基因芯片技术和UniArray技术在检测HBV YMDD变异方面优于PCR-RFLP技术,值得临床推广应用.
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绞股蓝属植物及其混淆品乌蔹莓的PCR-RFLP鉴别研究
目的:寻找简便、可重复的分子标记方法对绞股蓝属Gynostemma植物及其混淆品乌蔹莓Cayratia japonica进行鉴别.方法:对7种常见药用绞股蓝属植物及其混淆品乌蔹莓的6个cpDNA片段进行PCR扩增,再利用Taq Ⅰ,HpaⅡ,EcoR Ⅰ,Rsa Ⅰ,Hha Ⅰ,HindⅢ等6种限制性内切酶分别对扩增片段进行消化.结果:36种DNA片段/内切酶组合中,trnK1f-tmK2r片段与RsaⅠ组合可将乌蔹莓从绞股蓝属植物中区分出来,产物清晰、结果稳定.结论:PCR-RFLP分析方法可有效区分常见绞股蓝属植物与其混淆品乌蔹莓.
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等位基因特异多重PCR快速检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究
了解北京地区异烟肼(INH)耐药结核分枝杆菌(MTB)的分子特点,评价等位基因特异多重PCR在INH耐药性快速检测中的应用价值.选取102株北京地区MTB临床分离株,首先分别采用PCR-RFLP和反向线性杂交技术(RLB)检测耐药相关基因katG和inhA突变,然后运用等位基因特异多重PCR方法同时检测katG和inhA基因突变,并与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果进行比较.采用等位基因特异多重PCR检测发现,INH耐药株中60.3%(35/58)存在katG315突变,13.8%(8/58)发生了inhA突变,两者同时突变率为6.9%(4/58),INH敏感株中没有发现katG315突变,而inhA突变率为18.2%(8/44).上述检测结果与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果完全一致,且等于两种方法结果之和,提示等位基因特异多重PCR可完全取代PCR-RFLP和RLB. 北京地区INH耐药菌株以katG315 AGC→ACC突变为主;联合检测katG315和inhA基因可提高INH耐药株的检出率.等位基因特异多重PCR操作简便,结果易于判断,可作为临床MTB菌株中INH耐药性快速检测的辅助手段.
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MS-PCR法评估家族性原发性高血压病人血管紧张素原基因M235T多态性
本文采用新型高敏感、特异的MS-PCR法对中国苏皖地区94例具高血压家族史和36例无家族史者检测血管紧张素原M235T基因型.具有高血压家族史的原发性高血压病人(FH组)、具家族史的非高血压者(FNH组)、无家族史的正常对照(N组)和无家族史的高血压病人(NFH组)血管紧张素原(Angiotensinogen, AGT) 基因TT型/ T等位基因频率分别为0.581/0.77、0.563/0.77、0.346/0.58和0.4/0.55.有家族史者T等位基因频率远高于无家族史者.小样本研究认为中国苏皖地区人群原发性高血压的发病与AGTM235T基因多态性密切相关,T等位基因具更高的发病风险.各组间年龄分析结果显示AGTM235T遗传多态性对高血压发病风险的估计不受年龄的限制.
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α1-抗糜蛋白酶信号肽基因与阿尔茨海默病相关性初步探讨
目的探讨阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)患者中的α1-抗糜蛋白酶基因多态性及其与AD的相关性.方法利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对48例AD患者及89例对照者的α1-抗糜蛋白酶信号肽基因进行分型,进而进行AD与α1-抗糜蛋白酶信号肽基因多态性的相关分析.结果①AD病人α1-抗糜蛋白酶基因中,基因型A/T占27.1%,明显低于对照组的51.7%(p<0.01,RR=0.355),T/T占60.4%,明显高于对照组的37.1%(p<0.01,RR=2.576),A/A占12.5%,与对照组11.2%无明显差异(p>0.05,RR=1.086).②AD病人中α1-抗糜蛋白酶信号肽基因等位基因A的频率为26.0%、相对危险率(RR)为0.594,T的频率为74.0%、RR为1.683与对照组的A为37.1%、T为62.9%差异无显著性意义(p>0.05).结论 AD病人中α1-抗糜蛋白酶信号肽基因基因型T/T(AACT*T/T)频率明显高于正常人,与AD存在正相关;而AACT*A/T频率则明显低于正常人,与AD存在负相关.
关键词： Alzheimer病 α1-抗糜蛋白酶基因 多态性 PCR-RFLP -
云南兰坪地区带绦虫rDNA-ITS PCR-RFLP分析
目的 对云南兰坪地区带绦虫种类进行鉴定.方法 分别选取云南兰坪地区带绦虫(LP株)、猪带绦虫(ZD株)、牛带绦虫(ND株)和都匀亚洲带绦虫(DY株)成虫孕节3片(ZD株、ND株、DY株均为标准对照),抽提基因组DNA,PCR扩增rDNA-ITS片段,用限制性内切酶DdeⅠ对扩增片段作酶切分析.结果 LP株rDNA-ITS片段PCR扩增产物经DdeⅠ酶切后的图谱与DY株一致,与ND株和ZD株均不同.结论 云南兰坪地区带绦虫(LP株)与DY株相似,同属于亚洲带绦虫.PCR-RFLP适用于带绦虫病的流行病学调查和临床诊断.
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应用COXⅠ基因PCR-RFLP对我国旋毛虫地理株的鉴定
目的 对我国旋毛虫不同地理株进行分子鉴定. 方法 根据旋毛虫线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome c-oxidase subunitⅠ,COXⅠ)基因序列合成1对引物,以旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)、乡土旋毛虫(T.nativa,T2)、布氏旋毛虫(T.britovi,T3)、伪旋毛虫(T.pseudospiralis,T4)、纳氏旋毛虫(T.nelsoni,T7)的国际参考株作为对照,应用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术对我国7个猪源旋毛虫地理株(河南、湖北、云南、西安、哈尔滨、同江及天津株)进行分子鉴定. 结果 T1、T2、T3、T4、T7和我国7个猪源旋毛虫地理株的COXⅠ基因均扩增出419 bp的片段,PCR扩增产物Tru1Ⅰ(MseⅠ)酶切后经RFLP分析,T2、T3、T4、T7和天津株均具有独特的酶切带型:T2为22、70和327 bp,T3为92和327 bp,T4为419 bp,T7为62、64、70和223 bp,天津株为92、126和201 bp;其他6个地理株的酶切带型和T1一致,为22、70、126和201 bp. 结论 我国7个旋毛虫地理株的COX Ⅰ基因片段(92、70和22 bp )存在种内多态性;河南、湖北、云南、西安、哈尔滨及同江株可归为一类,天津株可归为另一类.
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云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的SAG2基因位点分析
目的 初步了解云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型特征. 方法 使用基因提取试剂盒提取龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因,运用巢式PCR技术分别对弓形虫SAG2基因(241 bp、221 bp)进行扩增,扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳,紫外投射仪下观察结果.用DNA胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并进行酶切,酶切产物置于37℃恒温培养箱孵育16h,孵育后的酶切产物用2.5％琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像观察结果并与弓形虫基因Ⅰ型标准株进行对比鉴定. 结果 112份HIV阳性者全血37份扩增出弓形虫SAG2基因(241 bp、221 bp).从37份弓形虫SAG2基因(241 bp、221 bp)扩增阳性的全血标本中选择条带较亮的6份进行酶切,并与弓形虫基因Ⅰ型标准株比对,初步确定2号标本为基因Ⅲ型,其他标本为基因Ⅰ型.从酶切的6份标本中选择2份进行测序,其中1份为酶切Ⅲ型(测序的2号标本).经过基因序列对比分析,各弓形虫株之间SAG2基因的碱基对差异较小.其中基因Ⅰ型36份,Ⅲ型1份. 结论 初步确定云南省龙陵县HIV阳性者感染弓形虫的基因型以Ⅰ型为主,Ⅲ型少见,未见Ⅱ型及其他基因型.
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PCR技术应用于寄生虫分类鉴定的研究进展
PCR技术对寄生虫病原体的检测和鉴定提供了一种强有力的工具.PCR分子分类方法 具有操作简便、特异性高和信息量丰富等优点,弥补了形态学分类上的不足.本文介绍了PCR-RFLP、RAPD和PCR-SSCP等技术的基本原理及用于寄生虫分类鉴定的研究进展.
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PCR-RFLP方法快速鉴别水痘-带状疱疹病毒野病毒与疫苗株
目的 PCR-RFLP的方法快速鉴别2010-2015在江西省采集的水痘-带状疱疹标本中的野病毒与疫苗株.方法 选取2010-2015年在江西省南昌市采集的的水痘-带状疱疹感染临床诊断病例的疱疹液和咽拭子标本共112份,分别使用特定引物对水痘-带状疱疹病毒(VZV) ORF62区、ORF38区和ORF54区进行扩增,对阳性扩增产物分别使用限制性内切酶Sma Ⅰ、Pst Ⅰ及Bgl Ⅰ进行酶切,对酶切产物进行片段长度多态性分析.结果 112份标本中,39份标本的病毒核酸经特定区域的PCR扩增后,对产物进行酶切结果为Sma Ⅰ-、Pst Ⅰ+及Bgl Ⅰ+,而疫苗株酶切的结果为Sma Ⅰ+、PstⅠ-及Bgl Ⅰ+.结论 PCR-RFLP方法可以快速鉴定VZV的野毒株与疫苗株,江西省2010-2015年采集的水痘-带状疱疹标本中的VZV均为野病毒.
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汉、蒙古族人MBL基因ExonⅠ54位密码子点突变频率及其血浆含量相关性研究
目的调查健康汉、蒙古族人甘露(聚)糖结合凝集素(MBL)基因54位密码子点突变的情况,测定健康汉、蒙古族人血浆MBL含量,并对健康汉、蒙古族人MBL基因54位密码子点突变频率与其血浆MBL含量进行相关性分析. 方法 PCR扩增,测定序列并建立MBL基因点突变检测方法,即PCR-RFLP方法(BanⅠ酶切);用ELISA法测血浆MBL含量. 结果 (1) 建立了MBL PCR方法,该方法特异性高,重复性好,低检出量为160pg DNA.(2) MBL的限制性内切酶BanⅠ酶切结果:通过酶切电泳分析结果显示,所扩增标本出现下列3种情况:①MBL 54位密码子野生型纯合子为2条带,对应的相对分子质量为232bp和93bp;②54位密码子突变体纯合子只显示1条约325bp带;③54位密码子野生型突变体杂合子显示325bp、232bp和93bp 3条带.(3) 通过简单数基因计算MBL基因54位密码子点突变的频率,健康汉、蒙古族人基因突变频率分别为0.2321和0.1757.(4) 血浆MBL含量的测定:56例健康汉族人血浆MBL含量的平均值为1998.750μg/L,标准差为1505.152;37例健康蒙古族人血浆MBL含量的平均值为2525.676μg/L,标准差为1955.188.(5) 健康汉族人血浆MBL含量与其编码基因ExonⅠ 54位密码子的点突变频率,经等级资料的相关分析,χ2=48.107,P＜0.001;r＝-0.62;二者呈负相关.健康蒙古族人血浆MBL含量与其编码基因ExonⅠ 54位密码子的点突变频率经等级资料的相关分析,χ2=32.86,P＜0.001;r＝-0.641;二者呈负相关. 结论 (1) 建立的MBL PCR-RFLP测定点突变的方法特异性高、重复性好、灵敏度较高;(2) 健康汉族人、蒙古族人的基因突变频率,汉族人比蒙古族人基因突变频率偏高,差别无统计学意义;(3) 健康汉族人、蒙古族人血浆MBL水平,汉族人含量的平均值比蒙古族人偏低,但均值比较差别无统计学意义;(4) 健康汉、蒙古族人MBL基因ExonⅠ 54位密码子的点突变频率与其血浆MBL含量均呈负相关.
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幽门螺杆菌耐甲硝唑基因分型与序列分析
目的探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)rdxA基因型及其与甲硝唑耐药性的关系及耐药的分子机制.方法对54例包括胃炎、消化性溃疡、胃癌患者的Hp分离株进行甲硝唑敏感实验,得到敏感株和耐药株;提取Hp基因组DNA,PCR扩增rdxA基因,并进行限制性片段长度多态性(RFLP)分型;统计学分析基因型和耐药性关系;对1株敏感株和2株耐药株rdxA基因测序分析突变情况. 结果 rdxA基因可分为两型:Ⅰ型和Ⅱ型.Ⅰ型中的敏感株和耐药株所占比例为56%和44%,Ⅱ型中的敏感株占16%,耐药株占84%.经统计学分析, rdxA基因Ⅱ型与耐药性有相关性.rdxA基因测序分析显示耐药株存在编码区碱基置换及插入造成的移码突变;非编码区亦存在单个碱基缺失及置换突变. 结论 rdxA基因Ⅱ型与Hp的甲硝唑耐药性密切相关,耐甲硝唑株主要表现为Ⅱ型.rdxA基因突变是耐甲硝唑的主要原因.
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EBV相关胃癌ras基因突变及法尼基转移酶β-亚单位基因的表达
目的:探讨EBV相关胃癌(EBVaGC)、EBV阴性胃癌(EBVnGC)及相应癌旁组织中ras基因突变和法尼基转移酶(FTase)的表达意义.方法:应用PCR-RFLP技术检测EBVaGCs13例、EBVnGCs45例以及相应癌旁组织58例中H-ras 12和K-ras 12,13密码子点突变情况;RT-PCR技术检测FTase β亚单位mRNA的表达水平.结果:共检测到H-ras 12位点突变2例,突变率为3.45%(2/58),均发生在EBVnGCs,未发现K-ras 12和13密码子点突变.58例癌组织中FTase β亚单位mRNA表达水平为0.93±0.39,癌旁组织中FTase β亚单位mRNA表达水平为0.78±0.26,两者有显著性差异(t=2.44,P=0.02).EBVaGCs组织中FTase β亚单位mRNA表达水平为0.80±0.1 9,EBVnGCs组织中FTase β亚单位mRNA表达水平为0.96±0.43,两者无显著性差异(t=1.93,P=0.06);EBVaGCs和癌旁组织中FTase β亚单位mRNA表达水平无显著性差异(t=0.54,P=0.60);EBVnGCs和癌旁组织中FTase β亚单位mRNA表达水平有显著性差异(t=2.39,P=0.02);2例BHRF1阳性和11例BHRF1阴性EBVaGCs组织中FTase β亚单位mRNA表达水平无显著性差异(t=0.26,P=0.80);6例BARF1阳性和7例BARF1阴性EBVaGCs组织中FTase β亚单位mRNA表达水平亦无显著性差异(t=1.59,P=0.14).结论:胃癌组织ras基因突变率较低,胃癌组织中FTase β亚单位mRNA明显高于癌旁组织.EBVaGC组织中ras基因突变、FTase β亚单位表达与EBV感染无明显相关性.
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新疆地区维汉民族CD14启动子-159位点基因多态性与冠心病的相关性研究
白细胞分化抗原14(CD14)是近年备受关注的一种多功能炎性细胞因子,在动脉粥样硬化过程中起着重要作用.本研究采用PCR-RFLP核苷酸分型技术,研究CD14启动子-159位点多态性与冠心病的关系.
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PTEN基因ⅣS4多态性与乳腺癌易感相关性分析
目的:初步探索PTEN基因ⅣS4位点多态性与群乳腺癌易感性之间的相关性.方法:采用基于人群的病例-对照研究,以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行基因分型,检测210例乳腺癌患者和210例健康女性的PTEN基因ⅣS4位点多态性.用非条件Logistic回归方法计算比值比OR值及95％CI.结果:与PTEN基因ⅣS4-/-基因型相比,ⅣS4+/+基因型显著降低乳腺癌的发病风险(校正的OR=0.610,95％Cl:0.380～0.980,P=0.041).结论:PTEN基因ⅣS4位点ⅣS4+/+基因型是乳腺癌发病的保护性因素.
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胃癌组织中Caveolin-1基因突变的检测及意义
目的 探讨胃癌组织中Caveolin-1基因异常的可能原因及该候选抑癌基因Caveolin-1在胃癌发生发展过程中的作用.方法 通过PCR-RFLP技术分析和PCR扩增产物进行基因测序,检测胃癌中Caveolin-1基因的突变情况.结果 PCR扩增产物经纯化回收后测序结果 证明了132位密码cct突变为cat,即由脯氨酸(Pro)的密码子突变为亮氨酸(Leu)的密码子.结论 DNA测序结果 显示,第132位脯氨酸密码子突变为亮氨酸密码子,这种突变可能是导致胃癌组织中Caveolin-1基因表达降低的可能原因.
关键词： 胃肿瘤 Caveolin-1 PCR-RFLP 基因测序 -
Ⅲ型胶原蛋白COL3A1基因多态性与颅内动脉瘤的关系
颅内动脉瘤是严重威胁人类生命健康的一种疾病,目前对该病的发病机制尚不完全清楚,不少学者认为颅内动脉瘤是一种由多种环境因素和多个基因共同作用的多因素疾病[1].COL3A1基因位于2q31,编码Ⅲ型胶原蛋白,其基因突变可引起Ⅲ型胶原蛋白缺失导致IV型埃 - 当综合征.但伴有遗传性结缔组织病的颅内动脉瘤只占颅内动脉瘤患者的5%[2].国外关于COL3A1基因与散发颅内动脉瘤发病关系的报道是有争议的.本研究应用聚合酶链式反应 - 限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,分析和探讨COL3A1基因单核苷酸多态性与颅内动脉瘤的关系.
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PCR技术在检测sp3基因表达和ApoE基因型中的应用
目的应用多聚酶链式反应(PCR)技术检测多发性硬化(MS)和老年性痴呆(AD)的相关基因sp3和ApoE. 方法分离MS患者外周血单个核细胞(PBMC),提取RNA,反转录合成cDNA第1链,PCR扩增sp3基因片段,应用反转录-PCR(RT-PCR)技术在RNA水平上检测sp3基因在MS患者PBMC的表达情况;取AD患者外周血,用低渗溶血法提取白细胞,酚/氯仿法提取DNA,应用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测ApoEε基因的多态性. 结果 MS组sp3阴性表达率(45%)明显高于对照组(P<0.01).AD患者的ApoE ε2、ε3、ε4基因频率依次为0.067、 0.700、 0.233,AD患者的ApoE ε4基因频率明显高于正常人. 结论汉族人MS患者存在sp3基因表达缺陷;ApoE ε4与AD密切相关;PCR相关技术可作为基因研究的有力工具.
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大规模发掘及分型SNP技术平台的建立
目的:建立发掘未知单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和已知SNPs分型的技术平台.方法:运用PCR产物双向大规模测序的方法发掘未知SNPs;运用基于聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction endonuclease digestion, PCR-RFLP)、TaqMan技术对已知SNPs进行分型.结果:建立了基于PCR产物双向大规模测序发掘未知SNP的技术平台,并以此在27个个体的69个乙型肝炎候选易感基因区域检测到592个SNPs,核苷酸变异度为(4.51 ± 1.24)×10-4;建成基于PCR-RFLP和TaqMan的SNP分型技术平台,这两种方法与直接测序法比较,PCR-RFLP的检出率达到100%,错误率几乎为0,并且操作简单,成本低廉;TaqMan分型技术的检出率也可达到100%,与测序结果的一致性达到100%,并且过程简单、易于操作,结果直观,易于判断,也能快速得到结果.结论:基于PCR产物双向大规模测序发掘未知SNPs的技术平台成熟可靠,适于准确、大规模地发掘未知SNPs;PCR-RFLP技术和TaqMan分型技术均适用于今后大规模正常人群和疾病人群的SNPs分型,为进行关联分析以确定疾病相关的SNPs奠定了坚实的技术基础.
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药用植物束花石斛、流苏石斛及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究
目的建立简易的采用rDNA ITS区作为分子标记对中药石斛的基源植物进行分子鉴定的技术.方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法获得ITS片段的限制性图谱.束花石斛及其形态相似种的PCR扩增产物用Cla I和Apa LI酶切,流苏石斛及其形态相似种的PCR扩增产物用Sph I酶切.结果根据预测的PCR-RFLP图谱,可以鉴别药用植物束花石斛、流苏石斛及它们的形态相似种.用这种方法鉴定了市场上收集的25件商品束花石斛、流苏石斛新鲜药材的原植物.结论 rDNA ITS的PCR-RFLP可用于鉴定石斛药材的原植物,具有简便、费用低的优点.
