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乙型肝炎病毒转基因小鼠研究现状
由于HBV感染具有明显的种属特异性,只感染人及黑猩猩等灵长类动物,使乙型肝炎的研究一直缺乏理想的动物模型.转基因小鼠出生前就能在内源性HBV启动子的控制下,主要在肝脏内持续转基因表达,在肝细胞内没有HBsAg积累,也没有肝细胞病变,HBsAg以亚病毒颗粒的形式以9 000ng/ml的浓度分泌入血[1].这些小鼠对高水平的循环抗原耐受,不产生抗HBs,可被用作HBV慢性携带状态模型.本文对HBV转基因小鼠转基因表达、免疫耐受及打破免疫耐受的机理等作一简要综述.
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乙型病毒性肝炎与宿主遗传因素
乙型病毒性肝炎的发病与人类宿主遗传因素密切相关,本文就乙型病毒性肝炎与人类基因组关系进行综述,包括免疫反应相关的人类白细胞抗原(HLA)、维生素D受体(VDR)基因、甘露糖结合蛋白(MBP),此外肿瘤坏死因子-α(TNF-α)启动子基因的多态性,16q24.3基因不平衡等也与乙型病毒性肝炎相关.宿主遗传因素在乙型病毒性肝炎中起重要作用,涉及机体对病毒免疫应答的全过程.
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类固醇合成急性调节蛋白基因表达的调控元件
类固醇合成急性调节蛋白(StAR)在胆固醇转化为类固醇激素的过程中起重要作用.StAR基因在转录水平受到多种转录因子的调控,它们相互作用,共同影响着StAR的表达及类固醇激素的合成.
关键词： 类固醇合成急性调节蛋白 启动子 调控元件 -
精子顶体相关基因SPACA7的转录活性研究
目的 研究精子顶体相关基因SPACA7转录起始位点上游-2000bp至下游+84bp范围内启动子活性.方法 利用启动子截短实验获得人类SPACA7基因转录起始位点上游-2000bp与下游+84bp序列的系列不同长度的启动子共16个,以人肾上皮细胞293T基因组DNA为模板,进行PCR反应,将不同长度的启动子重组至荧光素酶表达载体pGL3 basic中并转染细胞,转染24h后收集细胞加入裂解液,收集细胞裂解液,利用多功能酶标仪测定荧光素酶活性.结果 我们研究了SPACA7启动子-2000bp至+84bp序列,构建了16个不同长度的promoter::Luciferase,荧光素酶活性检测结果发现各个启动子都具有一定的活性,其中-1500bp至+84bp序列启动子活性高.结论 初步证明精子顶体相关基因SPACA7启动子在-1500bp至+84bp区域具有较强转录活性.
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ERCC6基因启动子区-6530C→G单核苷酸多态性的功能性分析
目的切除修复交叉互补6(ERCC6)基因(也称CSB基因)通过转录偶联修复(TCR)通路参与核苷酸切除修复(NER).为探讨该基因转录调控的分子机制及其与肿瘤遗传因子的关系,本研究进行ERCC6基因启动子区(ERCC6P)特定位点单核苷酸多态性(SNP)的功能性分析.
关键词： 切除修复交叉互补6基因 单核苷酸多态性 启动子 功能分析 -
中国广东地区肺结核HLA-DRB1*040101-44易感基因启动子序列研究
目的 分析中国广东地区肺结核患者HLA-DR易感基因启动子序列,以期了解HLA与广东地区人群肺结核发病的关联机制,探寻肺结核的发病机理.方法 利用核苷酸数据库检索HLA DRB1*040101-44易感基因启动子序列,依据启动子区保守序列,设计特异引物对启动子区序列进行PCR扩增,回收特异的PCR产物条带测序,对比结核病组和正常对照组、上述2组分别与网络核苷酸数据库公布的HLA-DR易感基因启动子序列.结果 PCR扩增产物测序发现结核病组和对照组DRB1*040101-44启动子区序列一致,但对照组启动子序列与数据库检索序列相比有Y元件盒的变异:-166位的T被A替代,-150位的C被G替代,-137位的T被G替代,-121位的C被G替代,-98位的T被C替代,-73位的A被G替代;在-93到-88位的TATA框、-130到-125位的CAAT框以及-189到-179位的X元件盒中没有碱基变异. 结论 HLA-DRB1 启动子区存在变异,其核酸变异发生在Y元件盒中,但此变异与中国广东地区人群肺结核发病无关联.
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肿瘤中微卫星不稳定的发生机制及研究意义
微卫星(microsatellite,MS)是由1～6个核苷酸组成单元串联重复排列而成的DNA序列,故又称短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)、简单重复顺序(simple sequences repeats,SSRs).MS广泛分布于原核和真核生物基因组中,在人类基因组DNA序列中,平均约隔6kb便含有一个MS,约占人基因组的10%,多位于基因之间的间隔区域及内含子、启动子中,也有一些基因的外显子中含有MS.由于MS呈高度多态且按孟德尔共显性方式稳定遗传,自发性突变率很低(10-5～10-4),序列一般较短,易于扩增,所以在连锁分析、人类进化研究、个体识别、亲子鉴定、基因定位作图等方面得到了广泛的应用.
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蒙古族与回族人群甘露糖结合凝集素基因启动子单体型分析
目的 分析内蒙古自治区蒙古族人群和宁夏回族自治区回族人群甘露糖结合凝集素(MBL)基因启动子区和5'端非翻译区的单核苷酸多态性(SNP)及其单体基因型.方法 MBL 基因 SNP 分析采用序列分析法;遗传学分析采用SHEsis软件.结果 79例蒙古族人群中启动子-550位点H/H、H/L和L/L型分别占38.0%、45.6%和16.5%,等位基因变异频率为0.392;-221位点Y/Y和X/Y型分别占81.0%和19.0%,等位基因突变频率为0.095.69例回族人群中启动子-550位点H/H、H/L和L/L型分别占36.2%、44.9%和18.8%,等位基因变异频率为0.413;-221位点Y/Y和X/Y型分别占75.4%和24.6%,等位基因突变频率为0.123.启动子单体型有HYP、LYP和LXP 3种,在蒙古族人群中的频率分别为0.608、0.297和0.095;回族人群中的频率分别为0.587、0.290和0.123.所有样本5'端非翻译区+4位点均无突变即均为P型.蒙古族和回族-550位点和-221位点的变异频率差异无统计学意义(X2-550=0.131,P=0.718;X2-221=0.610,P=0.435).结论 (1)本研究中蒙古族和回族人群启动子单体型仅HYP、LYP和LXP 3种.(2)启动子区-550位点的变异频率较高,-221位点变异频率较低,+4位点无SNP发现.两组人群上述位点的变异频率差异无统计学意义.
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嗜酸细胞激活趋化因子启动子单核苷酸多态性与其mRNA表达及哮喘的关系
背景和目的:嗜酸细胞激活趋化因子(eotaxin,EOT)1在嗜酸细胞相关炎症中起重要作用.本研究探讨了健康人群与哮喘患者中EOT单核苷酸多态性(SNP)与血浆EOT1水平,外周血嗜酸细胞数,PC20值(使第一秒用力呼气量下降20%所需的乙酰甲胆碱的浓度)的关联,以及SNP对EOT1产生过程的影响.方法:测定了22名健康人和21名哮喘患者EOT单核苷酸多态性、血浆EOT1水平、外周血嗜酸细胞数和PC20值.结果:在哮喘患者中,EOT-576C>T 和 EOT-384A>G多态性及单体型(ht1和ht4)与血浆EOT1水平显著相关(P<0.001～0.040).血浆EOT1对数值与血浆总IgE对数值在健康人和哮喘患者中相关(P =0.012 和P =0.004),与PC20对数值在哮喘患者中相关(P=0.014).DNA-蛋白复合物仅形成于EOT-384A>G,而在其他启动子SNP不形成.其相互作用在低频等位基因型中强于常见等位基因型,并受TNF-α下调.以TNF-α刺激哮喘患者外周血单个核细胞,具有纯合低频等位基因型者表达EOT1 mRNA水平较携带常见等位基因型者为低.结论:EOT-384A>G SNP通过形成抑制因子结合位点参与EOT表达调节,通过EOT-384A>G 可能预测哮喘发病.
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增强子
增强子(enhancer)是使基因转录速率显著提高的一类顺式作用元件.各种增强子相互间在结构上同源性较少,但具有一些短的和简并的共有序列.增强子具有以下特性:(1)增强子能(通过启动子)提高同一条DNA链上靶基因转录的速率;(2)增强子对同源或异源基因同样有效;(3)增强子的位置可在基因5′上游、基因内或其3′下游序列中;(4)增强子在DNA双链中没有5′与3′固定的方向性;(5)增强子可远离转录起始点,通常在1～4 kb(个别情况下可远离转录起始位点达30 kb)起作用;(6)增强子一般具有组织或细胞特异性;(7)增强子的活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关.
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人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建
目的:克隆不同长度人脂联素基因(AD)启动子片段,构建含人AD启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定.方法:利用PCR技术从人全血基因组DNA中扩增出AD启动子片段,经纯化酶切后克隆入载体pGL-3 basic中,形成重组质粒,筛选阳性克隆进行测序,并与GenBank比对.结果:从人全血基因组DNA中PCR扩增得到1.1 kb和2.1 kb AD启动子片段,构建2种报告基因载体,将其命名为AD promoter1.1-pGL-3 basic和AD promoter2.1-pGL-3 basic,经测序证实所插入的目的片段与GenBank检索的人AD启动子序列99.6％匹配.结论:成功构建了含人AD启动子片段的报告基因载体.
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肥大细胞源性外来体参与构建针刺穴位效应启动小网络的探讨
外来体是由细胞分泌的囊泡小体,是囊泡运输的常见形式,参与细胞间信息交流.国内外现有研究和本课题组前期工作表明,针刺效应的产生与穴位局部神经、肥大细胞及相关信号分子等因素相关.外来体参与神经细胞信息传递、肥大细胞功能活动、信号分子释放等生理功能.基于外来体与神经、肥大细胞、信号分子的密切关系,我们认为针刺引起穴位局部肥大细胞释放的外来体是针刺穴位初始效应的关键因素之一,在神经-肥大细胞-信号分子的网络联系中具有信使作用.
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脂联素调控序列荧光素酶报告基因荧光素酶活性的分析
目的:通过将1 100 bp长度的人脂联素(adiponectin,AD)启动子上游的调控基因(包括启动子,-1066 To+4 bp)插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,构建成含启动子调控序列的荧光素酶报告基因(pGL3-Basic-ADI1100),用于脂联素在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达调控研究.方法:利用PCR技术扩增1 100 bp长度AD启动子片段,与PUC19T载体连接,将PUC19T-ADI1100质粒,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒转染大肠肝菌(DH5a)后扩增,提取并纯化PUC19T-ADI1100和pGL3-Basic；分别以KpnI,XhoI酶切pGL3-Basic；电泳并回收ADI1100片段和pGL3-Basic酶切大片段,在T4 DNA连接酶的作用下,将ADI1100片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,并转染CHO细胞,检测荧光素酶报告基因活性.结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒含有脂联素启动子上游调控序列；瞬时转染实验显示AD启动子在CHO细胞中的转录表达随时间的变化而升高,转染后48 h的双报告基因活性是pGL3-Basic的30倍.结论:该荧光素酶报告基因构建成功,为后续筛选有抑制肥胖作用的中药提供基础.
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丹参SmCPS1基因启动子区甲基化特征分析及其与SmCPS1组织差异性表达的关系
目的:分析不同组织中丹参(Salvia miltiorrhiza)柯巴基焦磷酸合酶1基因(SmCPS1)启动子区甲基化分布特征及其与SmCPS1组织差异性表达的关系.方法:采用重亚硫酸盐转化法检测不同组织中SmCPS1启动子区-1 021 bp (转录起始位点+1)内的甲基化率;实时荧光定量聚合酶链式反应Real-time PCR检测不同组织中SmCPS1表达量.结果:SmCPS1启动子区甲基化主要集中在转录起始位点上游-750 ～ -500 bp, -450 bp以内的启动子区几乎无甲基化.300个甲基化检测位点中,组织差异性甲基化位点共72个,占总检测甲基化位点数的发生甲基化的转录因子结合区域共18个,其中有10个区域的甲基化存在组织差异.与SmCPS1表达量显著相关(P＜0.01)者21个,其中7个负相关者集中在-632 ～ -450 bp,14个正相关者分布在-632 bp之外及-450 bp以内的启动子区.结论:SmCPS1启动子区甲基化差异可能是影响其组织差异性表达的原因.
关键词： 丹参 柯巴基焦磷酸合酶1基因 甲基化 启动子 -
川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导的人α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响
目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的调控作用和川芎嗪干预的影响环节.方法将2.5 kb长度的人α1(Ⅰ)胶原基因启动子片段与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)"报告基因"组成的重组体pC0LH 2.5,采用脂质体法转染至培养的大鼠心肌成纤维细胞,分别加入AngⅡ和川芎嗪,ELISA法测定CAT活性.结果 AngⅡ可明显促进pCOLH 2.5片段的启动活性,川芎嗪能抑制AngⅡ的促pC0LH 2.5启动活性(P＜0.05).结论川芎嗪能在转录水平上阻断AngⅡ诱导的人α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性增加,从而抑制Ⅰ型胶原的合成,阻滞和延缓心肌纤维化的发生发展.
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黄花蒿ADS启动子的分离及表达特性分析
目的:从黄花蒿中分离鉴定青蒿素生物合成途径关键酶一紫穗槐二烯合酶编码基因(ADS)的启动子序列并研究其表达特性,藉此探索提高该基因表达量并进一步促进青蒿素合成的途径.方法:采用PCR法从黄花蒿DNA中分离ADS 5'端非翻译区(5'UTR)序列,构建与GUS报告基因融合的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草.GUS组织化学染色法和分光光度法分别定性和定量检测ADS 5'UTR序列调控GUS基因在正常条件和胁迫条件下的表达.结果:从黄花蒿中分离出2448 bp的ADS 5'UTR序列,获得与GUS基因融合表达的转基因烟草并检测到GUS活性.GUS活性定量检测结果显示,在4℃和紫外辐射条件下,转化烟草GUS活性分别提高1.6,2.2倍.结论:从黄花蒿分离出的ADS 5' UTR序列具有启动子功能并且可能具有环境诱导表达特性.
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丹参蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表达分析
蔗糖非酵解型蛋白激酶家族2 (SnRK2)在逆境植物信号转导途径中起着重要作用.该研究根据丹参转录组数据从丹参cDNA中克隆得到一个SnRK2家族基因,命名为SmSnRK2.4,属于I类SnRK2.SmSnRK2.4基因包含8个内含子,9个外显子,其开放阅读框1 068 bp,编码355个氨基酸,推测其蛋白相对分子质量为40.63 kDa,将其构建到原核表达载体pMAL-c2X上,原核诱导表达出与预测蛋白大小一致的目的蛋白.依据丹参基因组序列,PlantCARE分析SmSnRK2.4起始密码子ATG上游3 000 bp的启动子系列,结果显示该序列包含I-box,GA-motif,HSE,LTR,TC-rich repeats等逆境胁迫响应元件,以及GARE-motif,P-box,ABRE,CGTCA-motif等激素响应元件.实时荧光定量PCR分析表明SmSnRK2.4在丹参根中的含量较高,在茎中和叶中含量相当,ABA和PEG胁迫响应分析表明,SmSnRK2.4对PEG渗透胁迫响应显著,对ABA胁迫响应微弱.该研究为进一步探讨SmSnRK2.4基因在丹参干旱胁迫下次生代谢产物积累机制中的作用奠定了基础.
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中医药调节核因子-κB活化的研究进展
核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是一种具有多向转录调节作用的蛋白质.目前发现,与炎症和免疫反应关系密切的许多细胞因子、黏附分子基因的启动子部位含κB位点.活化的NF-κB能与DNA特定的κB位点结合,启动和调节众多参与炎症反应、免疫反应有关基因的转录,调控肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8等细胞因子和细胞间黏附分子-1(VCAM-1)等黏附分子的表达,在机体的炎症、免疫反应等方面发挥重要作用.近年来,国内外对NF-κB的研究逐渐深入,包括中医药调节NF-κB活化的研究.现作一综述如下.
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抗纤复方对人α1(Ⅰ)前胶原基因启动子活性的影响
目的:探讨抗纤复方(AFC)对人α1(Ⅰ)前胶原基因启动子活性的作用及其机制.方法:以含人α1(Ⅰ)前胶原基因上流2.3kb,0.8kb,476bp,173bp启动子片段为研究靶序列,以氯霉素乙酰基转移酶(CAT)为报告基因,构建基因重组质粒,转染成纤维细胞(NIH3T3),建立稳定的α1(Ⅰ)前胶原启动子转染细胞体系,用抗纤复方和(或)转移生长因子(TGFβ1)处理NIH3T3细胞,测定CAT活性.结果:(1)抗纤复方能够抑制α1(Ⅰ)前胶原启动子报导基因质粒phCAT-Cα1(Ⅰ)2.3,phCAT-Cα1(Ⅰ)0.8,phCAT-Cα1(Ⅰ)0.4的活性,不能抑制α1(Ⅰ)前胶原启动子报导基因质粒phCAT-Cα1(Ⅰ)0.1的活性;(2)TGFβ1能促进phCAT-Cα1(Ⅰ)2.3的活性,抗纤复方能拮抗TGFβ1这一促进作用.结论:抗纤复方能够作用于胶原α1(Ⅰ)基因调控片段,抑制胶原合成.
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GRP78的表达与癌症治疗和预后的关系
GRP78作为一种分子伴侣在蛋白质的折叠和转运过程及内质网应激反应中发挥重要作用.它在多种肿瘤组织中呈高表达,反义抑制其表达水平或将GRP78启动子连接自杀基因可用于肿瘤行为和治疗反应的生物标记.抑制GRP78表达可能代表根除残留肿瘤的新方法.而且,对于GRP78在癌细胞表面而不是正常组织的近期研究表明,针对GRP78的定向治疗是可行的.
