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人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建
目的:克隆不同长度人脂联素基因(AD)启动子片段,构建含人AD启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定.方法:利用PCR技术从人全血基因组DNA中扩增出AD启动子片段,经纯化酶切后克隆入载体pGL-3 basic中,形成重组质粒,筛选阳性克隆进行测序,并与GenBank比对.结果:从人全血基因组DNA中PCR扩增得到1.1 kb和2.1 kb AD启动子片段,构建2种报告基因载体,将其命名为AD promoter1.1-pGL-3 basic和AD promoter2.1-pGL-3 basic,经测序证实所插入的目的片段与GenBank检索的人AD启动子序列99.6％匹配.结论:成功构建了含人AD启动子片段的报告基因载体.
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人β-NGF基因在大肠杆菌中的表达
目的为β-NGF的基因制药选择一种新方法.方法直接从人血细胞基因组DNA中PCR扩增出β-NGF基因片段,将构建的重组体pBV220-β-NGF转化大肠杆菌DH5α,并将筛选的阳性克隆通过42℃诱导表达.结果经限制酶酶切电泳和DNA测序证实,确为β-NGF全长序列(约380 bp);全菌经SDS-PAGE电泳显示表达了β-NGF蛋白.结论成功克隆了β-NGF基因全长序列并在大肠杆菌中获稳定表达.
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人神经生长因子基因在大肠杆菌中的表达
目的为进一步研究神经生长因子( β-NGF) 及其基因的结构及功能奠定基础.方法自行设计合成一对特异引物,直接从人血细胞基因组DNA中 PCR扩增出NGF基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,pGEM-T-NGF克隆片段再定向插入原核表达载体pGEX-5T,构建的重组体p5TNF转化大肠杆菌JM109并经IPTG诱导表达.结果经限制性酶谱和DNA测序确证,pGEM-T-NGF克隆片段为β-NGF全长编码序列 (380bp);SDS-PAGE、分光光度计扫描和Western印迹显示,p5TNF转化菌有40.5×103 u 特异区带,融合蛋白表达量为503.2mg/L, 占菌体可溶性蛋白总量(7.4g/L)6.8%,该产物具NGF抗原活性.结论本研究成功克隆β-NGF基因全长编码序列并在大肠杆菌中获稳定表达,同时证实国人β-NGF基因编码无特殊性.
