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人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建
目的:克隆不同长度人脂联素基因(AD)启动子片段,构建含人AD启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定.方法:利用PCR技术从人全血基因组DNA中扩增出AD启动子片段,经纯化酶切后克隆入载体pGL-3 basic中,形成重组质粒,筛选阳性克隆进行测序,并与GenBank比对.结果:从人全血基因组DNA中PCR扩增得到1.1 kb和2.1 kb AD启动子片段,构建2种报告基因载体,将其命名为AD promoter1.1-pGL-3 basic和AD promoter2.1-pGL-3 basic,经测序证实所插入的目的片段与GenBank检索的人AD启动子序列99.6％匹配.结论:成功构建了含人AD启动子片段的报告基因载体.
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miR-29a靶基因ITGβ1-3'UTR萤光素酶报告基因质粒的构建及对心肌成纤维细胞增殖的影响
目的:利用microRNA靶位点预测网站预测了miR-29靶基因及结合位点,构建含野生型及其突变型整合素β1(integrinβ1,ITGβ1)-3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统(pMIR-ITGβ1-3'UTR),通过转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定miR-29的靶位点,以此研究miR-29对ITGβ1基因靶向调控的作用.方法:提取人全血RNA,逆转录mRNA成cDNA,以之为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ITGβ1-3'UTR片段,经酶切后连接至荧光素酶报告载体pMIR-Report 上,构建出pMIR-ITGβ1-3'UTR的荧光素酶报告基因载体及突变载体并进行鉴定.将pMIR-Report Luciferase载体,所构建的pMIR-ITGβ1-3'UTR及突变载体分别同miR-29 mimics共转染至大鼠心肌成纤维细胞,采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGβ1的作用机制.结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒序列正确,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致;成功构建pMIR-ITGβ1-3'UTR双荧光素酶报告基因,双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGβ1-3'UTR相应的碱基位点,并显著下调荧光素酶的表达.结论:该荧光素酶报告基因载体构建成功,转染miR-29 mimics后能显著下调萤火虫荧光素酶的表达.
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脂联素调控序列荧光素酶报告基因荧光素酶活性的分析
目的:通过将1 100 bp长度的人脂联素(adiponectin,AD)启动子上游的调控基因(包括启动子,-1066 To+4 bp)插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,构建成含启动子调控序列的荧光素酶报告基因(pGL3-Basic-ADI1100),用于脂联素在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达调控研究.方法:利用PCR技术扩增1 100 bp长度AD启动子片段,与PUC19T载体连接,将PUC19T-ADI1100质粒,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒转染大肠肝菌(DH5a)后扩增,提取并纯化PUC19T-ADI1100和pGL3-Basic；分别以KpnI,XhoI酶切pGL3-Basic；电泳并回收ADI1100片段和pGL3-Basic酶切大片段,在T4 DNA连接酶的作用下,将ADI1100片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,并转染CHO细胞,检测荧光素酶报告基因活性.结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒含有脂联素启动子上游调控序列；瞬时转染实验显示AD启动子在CHO细胞中的转录表达随时间的变化而升高,转染后48 h的双报告基因活性是pGL3-Basic的30倍.结论:该荧光素酶报告基因构建成功,为后续筛选有抑制肥胖作用的中药提供基础.
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KIR3DL1基因启动子亚克隆及表达调控载体的构建
为研究KIR3DL1基因的表达调控机制,亚克隆KIR3DL1基因的核心启动子序列,并构建KIR3DL1基因启动子-荧光素酶报告载体,采用PCR法从含有KIR3DL1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增KIR3DL1基因核心启动子序列,产物纯化回收后与pGEM-T easy载体连接,测序鉴定正确的重组子经限制性内切酶BglⅡ和NcoⅠ双酶切后,插入同样经BglⅡ和NcoⅠ双酶切的用于基因表达调控研究的pGL3-Basic报告载体,终获得了长度为254bp的KIR3DL1基因启动子克隆,构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体.通过酶切及基因测序的方法证实所构建的重组子是正确的,说明KIR3DL1基因启动子表达调控载体的构建是成功的.
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高迁移率族蛋白基因第4内含子区功能以及1176G/C多态性对其功能的影响
目的 探讨高迁移率族蛋白(HMGB1)基因第4内含子区(1144 bp~1296 bp)153 bp长度片段可能的功能以及1176 G-C突变对其功能的影响.方法 构建HMGB1基因(1144 bp~1296 bp)第4内含子区1176GG/1176CC的153 bp目的片段与荧光素酶报告基因载体重组质粒,应用脂质体介导的转染技术,将重组质粒与pRL-TK内参照质粒共同转染Hepa G2细胞,瞬时表达,利用双荧光素酶测试系统检测荧光素酶表达活性.结果 在HepG2细胞中,pGL3-Basic-C和pGL3-Basic-G重组质粒与pGL3-Basic荧光素酶活性无明显差异;pGL3-Promoter-G和pGL3-Promoter-C重组质粒与pGL3-Promoter荧光素酶活性相比P<0.01;pGL3-Promoter-G和pGL3-Promoter-C重组质粒荧光素酶活性相比P<0.01.结论 HMGB1基因内含子区(1144~1296 bp)153 bp片段具有增强子功能以及单核苷酸1176 G-C的改变可使增强子功能大大提高.
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SIRT1启动子表达调控载体的构建和活性分析及AML1-ETO对其转录活性的影响
目的:本研究旨在分析AML1-ETO阳性白血病中SIRT1基因的表达及调控机理,寻找SIRT1核心启动子区域.方法:利用实时定量PCR方法在AML1-ETO阳性白血病细胞株和白血病临床样本中研究SIRT1基因的表达情况;构建SIRT1基因启动子-荧光素酶报告载体,分析其在293T细胞中的活性.采用PCR方法从含有SIRT1基因转录起始位点5'区的基因片段中扩增SIRT1基因核心启动子序列,插入经Xho Ⅰ和HindⅢ双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic,采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.采用双荧光素酶报告基因检测方法,研究AML1-ETO对SIRT1启动子转录活性的调节作用.结果:AML1-ETO的表达与SIRT1的表达呈正相关;成功构建了6种SIRT1基因序列的荧光素酶报告重组子,并通过了酶切以及基因测序方法的鉴定;荧光素酶报告重组子在293T细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照,明确了SIRT1基因核心启动子位置;研究结果证明融合蛋白AML1-ETO可以正向调控SIRT1启动子活性,SIRT1对AML1-ETO阳性白血病发生发展的影响.研究表明:SIRT1可能是AML1-ETO的靶基因之一.结论:成功构建了SIRT1基因启动子-荧光素酶报告载体,找到了SIRT1基因核心启动子区,且核心启动子在293T细胞中有较高的活性.AML1-ETO通过促进SIRT1启动子的活性对其进行转录调控.
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kir3dl1启动子表达调控载体的构建及其在K562细胞中的活性
为了分析kir3dl1基因核心启动子区域的功能并明确其表达调控机制,构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体,分析其在K562细胞中的活性.采用PCR方法从含有kir3dl1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增kir3dl1基因核心启动子序列,插入经BglII和NcoI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic;采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染K562细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性;采用MTT法检测脂质体-DNA复合物对细胞存活率的影响.结果表明:成功构建了含有254 bp的kir3dl1基因核心启动子序列的荧光素酶报告重组子3DLl-luc254并通过酶切及基因测序方法的鉴定;荧光素酶报告重组子在K562细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照,且荧光素酶活性、相对活性持续3天无明显衰减,转染了3DLl-luc254报告质粒的K562细胞存活率在76%-92%之间.结论:成功构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体,本研究采用的转染系统能够有效地在K562细胞中进行基因转染,kir3dl1基因核心启动子在K562细胞中具有较高活性.
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应用Red重组工程技术在大肠杆菌外膜展示表达外源蛋白
目的 将外源蛋白或抗原稳定表达展示于大肠杆菌的外膜上.方法 应用大肠杆菌DY330介导的重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术,将长度为1653 bp的荧光素酶报告基因(luc)敲入DY330染色体与外膜蛋白基因lpp、ompA融合.结果 报告基因定量分析结果址明:外源荧光素酶(luciferase,Luc)能够与外膜蛋白融合表达于细菌外膜,Lpp-OmpA-Luc融合蛋白表达于细菌外膜的效率高.结论 外源蛋白能够稳定表达于细菌外膜,不会影响细菌的生长繁殖.
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CYP3A4和CYP2B6药物诱导剂体外筛选体系的建立
目的 构建CYP酶药物诱导剂的体外筛选技术平台.方法 利用双荧光素酶报告基因系统,将包含hPXR蛋白识别和结合调控元件的CYP3A4和2B6启动子序列插入报告基因上游,将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞,用含有利福平或DMSO培养基培养48 h后裂解进行双荧光素酶活性检测.结果 经利福平处理的细胞裂解物荧光素酶比活性值与阴性对照组和溶剂组差异显著.结论 本研究构建的CYP3A4和2B6体外筛选平台,可以有效地用于体外诱导剂的筛选.
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TMEM33 mRNA 3′-UTR报告基因载体的构建及功能验证
目的：：根据microRNA-146a(miR-146a)预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒并进行功能验证,为研究吸入性损伤中 miR-146a通过靶向跨膜蛋白33(TMEM33)对 Toll 样受体/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信号通路的调控作用提供前期的工作基础。方法：通过生物学软件预测 TMEM33 mRNA 3′端非翻译区(TMEM33 mRNA 3′-UTR)可能是miR-146a的作用靶点,将设计合成的TMEM33及其突变序列TMEM33-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒,采用脂质体法将这两种重组荧光素酶报告质粒 pMIR-TMEM33和 pMIR-TMEM33-mu分别与miR146a mimics共转染 HEK-293T细胞,以 pMIR-TMEM33+miR-control 转染 HEK-293细胞作对照,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果：TargetScan 和 miRanda 软件预测显示,miR-146a 与TMEM33 mRNA 3′-UTR存在互补结合位点,构建的荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测系统显示,miR-146a对TMEM33 mRNA 3′-UTR 具有靶向作用,pMIR-TMEM33+miR146a mimics组较 pMIR-TMEM33+miR-control 组荧光素酶活性降低62%左右,差异具有统计学意义(P<0.01)；而 miR-146a对TMEM33-mu 3′-UTR无靶向作用,pMIR-TMEM33-mu+miR-146a 组与 pMIR-TMEM33+miR-control组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：成功构建 TMEM33mRNA 3′-UTR 荧光素酶报告载体,证实 miR-146a对TMEM33 mRNA 3′-UTR具有靶向调控作用,为从基因水平深入揭示吸入性肺损伤发病机制提供实验室数据和方法。
关键词： TMEM33 荧光素酶报告基因 微小 RNA-146a 肺损伤 吸入性 -
E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白启动子的构建及活性测定
目的：构建含有E-钙黏蛋白（cadherin）基因和N-钙黏蛋白基因启动子的荧光素酶报告基因载体，并检测E-钙黏蛋白启动子和N-钙黏蛋白启动子的活性。方法利用PCR技术从乳腺癌细胞ZR75-1基因组中扩增出E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白启动子片段，插入到荧光素酶报告基因载体pGL4-basic中，确定所扩增的DNA序列后，将其转染至乳腺癌细胞ZR75-1和肝癌细胞HepG2中，检测启动子的活性。结果测序结果表明，扩增的E-钙黏蛋白启动子序列正确；荧光素酶活性实验表明，E-钙黏蛋白启动子和N-钙黏蛋白启动子在乳腺癌细胞ZR75-1和肝癌细胞HepG2中表达都具有活性。结论成功构建了E-钙黏蛋白启动子和N-钙黏蛋白启动子报告基因表达载体，为进一步筛选调节E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白表达的转录因子提供了重要基础。
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靶向FHL1的microRNA初步筛选研究
目的 构建含有FHL1基因3'-UTR区的荧光素酶报告基因载体,用以检测与其相互作用的microRNA(miRNA).方法 PCR扩增出FHL1基因3'-UTR区片段,插入到经过改造的荧光素酶报告基因载体pcDNA 3.0中；利用Target Scan5.1软件预测可能与FHL1基因3'UTR区相互作用的miRNA,将miRNA与荧光素酶报告重组子共转染至293T细胞中,检测其荧光活性；构建针对荧光活性结果变化明显的miRNA的种子区缺失突变体,检测荧光活性.结果 测序结果表明,含有FHL1基因3'-UTR区的荧光素酶报告基因载体构建正确；荧光素酶活性实验表明,与对照组相比,miR-200c、miR-146a、miR-146b-5p可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低40％左右,并构建上述miRNA缺失突变体,miR-200c使荧光素酶活性回复.结论 成功构建了FHL1基因3'UTR区的荧光素酶报告基因载体,而miR-200c、miR-146a、miR-146b-5p可以抑制其荧光素酶活性,其中miR-200c可能直接作用于FHL1基因3'-UTR区.
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鼠疫耶尔森菌YopJ基因突变体构建、表达及其在RLR信号通路中生物活性的鉴定
目的 构建和表达鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)效应蛋白YopJ C172A、F177L、K206E突变真核表达载体,并检测其在RIG Ⅰ样受体(RLR)信号通路中的生物活性.方法 通过PCR和测序检测pCMV-Myc-YopJ的准确性,将重组PCR技术获得的3种突变体的突变片段定向克隆到pCMV-Myc载体中,在HEK293细胞中瞬时表达,并利用荧光素酶报告基因技术检测YopJ及其3种突变体对环二鸟苷酸(c-di-GMP)激活干扰素-β(IFN-β)转录活性的影响.结果 成功构建3种突变的真核表达质粒,在c-di-GMP刺激情况下,YopJ F177L、YopJ K206E与YopJ相比,对IFN-β转录活性的抑制作用没有显著差异,而YopJ C172A与YopJ有极显著差异,对IFN-β的抑制作用明显降低.结论 YopJ 172位是其抑制RLR信号通路的酶活性位点,与文献报道一致,而177位或206位则没有这种作用,这为进一步探究YopJ参与Y.pestis致病性的作用靶点和机制打下了良好基础.
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线粒体抗病毒信号蛋白MAVS真核表达质粒的构建及表达
目的:构建线粒体抗病毒信号蛋白(mitoehondrial antiviral signaling protein,MAVS)真核表达质粒.方法:从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得MAVS的全长cDNA双链片段.经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆进行测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-MAVS.借助脂质体转染peDNA3/flag-MAVS质粒到HEK293T细胞中,用Westem印迹检测目的蛋白的表达.同时用β干扰素的荧光素酶报告基因(IFN-β-luc)检测MAVS蛋白活性.结果:Western印迹实验证明pcDNA3/flag-MAVS可以在HEK293T细胞中表达MAVS,并且能使IFN-β报告基因活性明显增强.结论:构建了重组质粒peDNA3/flag-MAVS,在细胞中表达MAVS后具有刺激IFN-β转录的生物活性.
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VEGF启动子活性的测定
目的 构建含有VEGF基因的不同片段启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测VEGF启动子不同片段的活性.方法 用PCR扩增出VEGF启动子的不同片段,插入到荧光素酶报告基因载体pGL4-basic中,确定所扩增的DNA序列后,将其转染至293T细胞中,检测其不同片段的活性.结果 测序结果表明,扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确；荧光素酶活性实验表明,VEGF启动子+72～-128 bp至+72～-528 bp片段具有较高的活性.结论 构建了VEGF启动子5’端缺失不同片段突变体报告基因表达载体,为VEGF转录因子的筛选及功能研究提供了重要基础.
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激活NF-κB信号通路的土壤微生物代谢产物提取物的筛选
目的 筛选能够明显影响核离子(NF)-κB信号通路的土壤微生物代谢产物.方法 微生物接种液体培养基中,于180 r/min、30℃摇床培养,3d后,加入终浓度70％的乙醇裂解过夜.裂解物离心,取上清,旋转蒸发浓缩并冷冻干燥,获得微生物代谢产物提取物,采用双荧光素酶报告基因分析方法进行筛选,将pNF-κB-luc、pRL-TK质粒共转染HEK293细胞,转染后6h加入微生物代谢产物或TNF-α(阳性对照),继续培养24h后,检测荧光素酶活性.结果 在第一轮筛选中,发现30种代谢物能够激活NF-κB信号通路；28种代谢物能够抑制NF-κB信号通路.在第二轮筛选中,有13种代谢物能够明显激活NF-κB信号通路,没有明显抑制NF-κB信号通路的代谢物.在第三轮筛选和后验证中,发现6种代谢物均能激活NF-κB (信)号通路.结论 从525种土壤微生物代谢物中筛选得到6种具有明显激活NF-κB信号通路作用的微生物代谢产物提取物.
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基于COL1A1启动子的抗肝纤维化药物高通量筛选模型的建立及应用
为了有效筛选潜在的抗肝纤维化药物,本实验室建立了基于COL1A1启动子的高通量筛选细胞模型.该细胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COLlA1启动子及荧光素酶报告基因的表达,而该激活作用可以被候选化合物抑制.作者首先构建COL1A1启动子和荧光素酶报告载体pGL4.17的重组质粒.采用双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子的活性进行检测,发现重组质粒比对照组荧光素酶活性高15.98倍.该质粒转染到人肝星状细胞株LX2中,用无限稀释法得到单克隆细胞株,并利用活体成像仪筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL.经TGF-β1诱导后检测该单克隆细胞株LX2-COL对候选化合物(S1～S7)的反应性,其中S7对启动子活性抑制作用强.Real-time RT-PCR和Western blotting验证了经该细胞模型筛选得到的化合物S7能够抑制Ⅰ型胶原mRNA和蛋白水平的表达.结果表明,该细胞模型的建立能够实现对潜在的抗肝纤维化化合物的高通量筛选.
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pGL3-EPO-α-MHC启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及缺氧调控功能考察
目的 考察EPO-α-MHC启动子在缺氧条件下的调控表达作用.方法 构建pGL3-EPO-α-MHC启动子编码荧光素酶报告基因的质粒,以含pGL3-EPO-α-MHC和pGL3-CMV启动子的质粒分别转染缺氧和常氧的心肌细胞(H9C2),检测荧光素酶的表达.结果 pGL3-CMV启动子质粒在缺氧条件下的报告基因表达与常氧条件相比显著下降(P < 0.05),而pGL3-EPO-α-MHC启动子在缺氧条件下能够显著上调报告基因的表达4.3倍(P < 0.01).结论 EPO-α-MHC启动子具有缺氧调控功能.
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载脂蛋白M基因启动子的克隆及荧光素酶报告基因载体的构建
目的为深入研究载脂蛋白M（ApoM）基因的表达调控机制，对ApoM基因启动子序列进行克隆，并构建不同长度启动子荧光素酶报告基因载体。方法在NCBI人类基因组数据库中截取并下载ApoM基因转录起始位点5’侧翼区约2 kb的基因组序列设计PCR扩增引物，从健康外周血中扩增获得该片段，以此序列为基础进行亚克隆，分别获得6条5’端不等、3’端平齐的片段，后插入pGL3-Basic表达载体。结果获得了6条长度差别约为200bpApoM启动子片段，并构建了不同长度的pGL3-ApoM真核表达载体。结论上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究ApoM基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。
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PAI-1启动子序列与荧光素酶报告基因扩增及载体连接问题分析
目的：探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）启动子荧光素酶表达质粒构建中扩增、转化、酶切及连接的问题。方法利用PCR技术扩增1100 bp长度PAI-1启动子片段，与PUC-19T载体连接，将PUC19T-PAI-11100质粒，及荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒转染大肠肝菌（DH5a）后扩增，提取并纯化；以BglⅡ，MluⅠ酶切，电泳并回收PAI-11100片段和pGL3-Basic酶切大片段，将PAI-11100片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中，构建含PAI-11100片段荧光素酶质粒。结果扩增PAI-11100 bp片段成功，目的片段与载体PUC19T，pGL3-Basic载体连接条件较苛刻，需要增加连接时间及效率的摸索。结论控制扩增时DNA浓度，胶回收，感受态质量，LB平板质量，内切酶，连接时间及质量比等问题都可增加连接成功概率。
