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靶向FHL1的microRNA初步筛选研究
目的 构建含有FHL1基因3'-UTR区的荧光素酶报告基因载体,用以检测与其相互作用的microRNA(miRNA).方法 PCR扩增出FHL1基因3'-UTR区片段,插入到经过改造的荧光素酶报告基因载体pcDNA 3.0中；利用Target Scan5.1软件预测可能与FHL1基因3'UTR区相互作用的miRNA,将miRNA与荧光素酶报告重组子共转染至293T细胞中,检测其荧光活性；构建针对荧光活性结果变化明显的miRNA的种子区缺失突变体,检测荧光活性.结果 测序结果表明,含有FHL1基因3'-UTR区的荧光素酶报告基因载体构建正确；荧光素酶活性实验表明,与对照组相比,miR-200c、miR-146a、miR-146b-5p可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低40％左右,并构建上述miRNA缺失突变体,miR-200c使荧光素酶活性回复.结论 成功构建了FHL1基因3'UTR区的荧光素酶报告基因载体,而miR-200c、miR-146a、miR-146b-5p可以抑制其荧光素酶活性,其中miR-200c可能直接作用于FHL1基因3'-UTR区.
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P19 细胞向心肌细胞分化过程中FHL1基因的表达变化
目的:观察FHL1(Four and a half LIM domains protein 1)基因在P19细胞向心肌细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨FHL1基因与心肌细胞分化之间的关系.方法:P19细胞经1%二甲基亚砜(DMSO)诱导悬浮培养4天形成细胞聚集体,将聚集体用生长培养基黏附培养至14天,观察细胞跳动情况,用肌钙蛋白I(cTnI)抗体行Western Blot以鉴定心肌细胞分化,并采用RT-PCR、Western Blot技术在细胞分化成熟的不同时段检测P19细胞中 FHL1 基因mRNA和蛋白的表达水平.结果:DMSO 诱导4天后,用生长培养基黏附培养至第8天,P19细胞出现自发性节律跳动的细胞团片,Western Blot检测cTnI蛋白呈阳性.FHL1基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,Western Blot检测结果与RT-PCR检测结果基本一致.FHL1基因在分化第0～8天表达显著增高,各时间点之间差异显著(P<0.05);第8～14天表达趋于稳定,各时间点之间差异无显著性(P>0.05).结论:FHL1基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中表达逐渐上调,可能参与心肌细胞的分化和发育.
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综合康复治疗幼儿还原体肌病病例报告
目的:探讨还原体肌病(RBM)的病例特点与康复治疗方法.方法:收集RBM患儿1例,分析其临床表现、实验室检查、影像学表现、肌肉病理及基因检测结果.对患儿采取综合康复治疗,治疗前后对患儿作康复评定,评估其转移能力、肌力、肌张力、关节活动度、GMFM评分等.结果:基因检测示FHL1基因c.C369G杂合突变,病例特点均符合RBM表现.经综合康复治疗后,患儿肌力、GMFM-88、Berg评分均较治疗前有所提高.结论:综合康复训练可维持RBM患儿肢体肌力及平衡能力,促进运动功能和转移能力恢复,延缓疾病进展.
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慢病毒介导的shRNA敲低FHL1的表达促进HeLa和HepG2细胞生长
目的 通过构建靶向四个半LIM结构域蛋白1(FiHL1)基因的慢病毒介导的短发夹RNA (shRNA),观察FHL1表达降低对HeLa细胞和HepG2细胞生长的影响.方法 构建FHL1基因的shRNA干扰病毒载体,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测转染pLenti-H1 FHL1 shRNA对FHL1表达的抑制效果.慢病毒感染官颈癌HeLa细胞和HepG2肝癌细胞,经2～3周嘌呤霉素筛选后得到FHL1稳定低表达的细胞,利用生长曲线实验和克隆形成实验检测FHL1基因表达降低后对细胞生长的影响,利用软琼脂实验检测对肿瘤细胞非锚定依赖性生长的影响.结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,构建的shRNA病毒载体能够明显抑制FHL1的表达;生长曲线实验和克隆形成实验显示,慢病毒介导的FHL1 shRNA能够明显促进肿瘤细胞的生长;软琼脂实验结果表明,FHL1低表达能够促进肿瘤细胞的非锚定依赖性生长.结论 构建的pLenti-H1 FHL1 shRNA慢病毒载体可有效地抑制FHL1表达,明显促进HeLa细胞和HepG2细胞的增殖.
