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糖多孢红霉菌λC3-SRR突变体的构建及其产物鉴定
目的:构建糖多孢红霉菌KR6酶域基因失活突变体,探讨SRR氨基酸相应9核苷酸去除突变体与合成酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的关系.方法:以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增出缺少SRR氨基酸相应9核苷酸的KR6酶域DNA片段,并克隆到载体pWHM3上,构建了同源重组质粒pWHM3-SRR.将pWHM3-SRR质粒转化糖多孢红霉菌λC3菌株,筛选出质粒整合到染色体上红霉素合成基因位点的整合体λC3-A、B和C.λC3-A在无硫链丝菌肽(Thio)的R3M斜面上生长两代后,制备的原生质体涂R3M平皿,挑选出不能在含Thio的R3M斜面上生长、发酵液也无抑制枯草芽孢杆菌活性的突变菌株λC3-SRR.结果:部分基因组DNA序列分析表明,糖多孢红霉菌λC3-SRR染色体上SRR氨基酸相应9核苷酸已经敲除,Zabspec Fab质谱分析证实λC3-SRR菌株合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B.结论:糖多孢红霉菌KR6酶域SRR氨基酸相应9核苷酸敲除的λC3-SRR突变菌株可以合成3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,SRR为KR6酶域上NADPH 2′-磷酸结合位点.
关键词： 糖多孢红霉菌 聚酮合成酶 同源重组 酮内酯类 3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B -
红色糖多孢菌A226-YA突变体构建及产物分析
目的:用红色糖多孢菌(前称糖多孢红霉菌)KR6突变体合成酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,同时,KR6突变体不合成红霉素.方法:以红色糖多孢菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增KR6酶域中Tyr2699密码子TAC突变为Ala密码子GCC的1 000 bp DNA序列,克隆到载体pWHM3上构建同源重组质粒pWHM3-YA.将pWHM3-YA转化到A226中,并整合到红霉素合成基因座,经染色体二次重组后筛选TAC突变为GCC的突变体A226-YA,再进行突变体A226-YA产物分析.结果:通过染色体同源重组,构建了红色糖多孢菌突变菌株A226-YA,Zabspec Fab质谱分析结果显示A226-YA突变体合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,而没有检测到红霉素.结论:突变Tyr2699能有效失活KR6,但3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的产量较低.
关键词： 红色糖多孢菌 聚酮合成酶 酮还原酶 3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B -
红色糖多孢菌A226-SP突变体构建及代谢产物分析
目的:构建红色糖多孢菌突变菌株,生物合成酮内酯类抗生素.方法:利用反向PCR技术,扩增红色糖多孢菌KR6酮还原酶基因突变DNA片段SP(KR6酶中Gly1141 Ala1142替换成ScrPro),克隆于pWHM3上构建染色体同源重组质粒pWHM3-SP.通过PEG介导原生质体转化,将pWHM3-SP导入红色糖多孢菌中.经染色体二次重组后,筛选出1株红色糖多孢菌KR6酶突变菌株A226-SP.结果:DNA序列分析表明,A226-SP染色体上编码KR6酶中Gly1141Ala1142序列GGTGCG突变成SerPro编码序列AGCCCT.HPLC-HRMS分析证实A226-SP菌株合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B(DOEB),同时检测到其中间产物C18H34O6,但没有发现红霉素产物.结论:Gly1141 Ala1142位于KR6酮还原酶的重要功能位点,红色糖多孢菌A226-SP突变体可以合成酮内酯类化合物.
关键词： 红色糖多孢菌 酮还原酶 同源重组 3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B
