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糖多孢红霉菌λC3-SRR突变体的构建及其产物鉴定
目的:构建糖多孢红霉菌KR6酶域基因失活突变体,探讨SRR氨基酸相应9核苷酸去除突变体与合成酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的关系.方法:以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增出缺少SRR氨基酸相应9核苷酸的KR6酶域DNA片段,并克隆到载体pWHM3上,构建了同源重组质粒pWHM3-SRR.将pWHM3-SRR质粒转化糖多孢红霉菌λC3菌株,筛选出质粒整合到染色体上红霉素合成基因位点的整合体λC3-A、B和C.λC3-A在无硫链丝菌肽(Thio)的R3M斜面上生长两代后,制备的原生质体涂R3M平皿,挑选出不能在含Thio的R3M斜面上生长、发酵液也无抑制枯草芽孢杆菌活性的突变菌株λC3-SRR.结果:部分基因组DNA序列分析表明,糖多孢红霉菌λC3-SRR染色体上SRR氨基酸相应9核苷酸已经敲除,Zabspec Fab质谱分析证实λC3-SRR菌株合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B.结论:糖多孢红霉菌KR6酶域SRR氨基酸相应9核苷酸敲除的λC3-SRR突变菌株可以合成3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,SRR为KR6酶域上NADPH 2′-磷酸结合位点.
关键词： 糖多孢红霉菌 聚酮合成酶 同源重组 酮内酯类 3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B -
糖多孢红霉菌表达载体pZMW的构建
目的:构建能够在糖多孢红霉菌中稳定存在的表达性载体.方法:用PCR方法从糖多孢红霉菌染色体上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体的启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了染色体整合型糖多孢红霉菌表达载体pZMW.结果:pZMW表达载体能够整合到链霉菌和糖多孢红霉菌染色体上,并能够在链霉菌和糖多孢红霉菌体内表达硫链丝菌素抗性基因tsr.结论:pZMW表达载体能够在糖多孢红霉菌中表达外源基因.
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糖多孢红霉菌引入异源启动子表达透明颤菌血红蛋白
目的 为了在糖多孢红霉菌(Sac. erythraea)中表达透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb),将变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)启动子基因整合于糖多孢红霉菌染色体中.方法 以变铅青链霉菌基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆变铅青链霉菌启动子基因,利用基因重组技术构建含有异源启动子与vgb的重组糖多孢红霉菌表达质粒,经电穿孔法与糖多孢红霉菌染色体整合,红霉素效价测定采用管碟法.结果 克隆了含有异源启动子与vgb的重组糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV),相对分子量6.033kb,筛选了重组糖多孢红霉菌株,原始菌株与重组菌株的终红霉素效价分别为3.98、5.15g·L-1.重组菌株提高红霉素体积产率约29%.结论 vgb在重组糖多孢红霉菌株引入异源启动子的情况下获得了表达,有望解决传统发酵过程中由于氧传递而导致的产率低下和成本高的问题.
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糖多孢红霉菌红霉素高产菌种的诱变选育
目的 诱变和筛选糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)红霉素的高产菌种.方法 以糖多孢红霉菌L1为出发菌株,紫外线作为诱变剂,诱变和筛选生产所用菌种.结果 获得了高产变株L2-26,其发酵水平较出发菌株提高了19.8%.结论 此方法可有效地获得高产变株,发酵水平明显提高.
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糖多孢红霉菌红霉素高产菌种的诱变选育
目的 诱变和筛选糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)红霉素的高产菌种.方法 以糖多孢红霉菌L1为出发菌株,紫外线作为诱变剂,诱变和筛选生产所用菌种.结果 获得了高产变株L2-26,其发酵水平较出发菌株提高了19.8%.结论 此方法可有效地获得高产变株,发酵水平明显提高.
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红霉素基因工程研究途径和相关技术
红霉素基因工程研究的快速发展依赖于相关的分子生物学技术,本文概括介绍了红霉素基因工程研究中常用的五种途径和相关技术:染色体重组、链霉菌表达系统、大肠埃希氏菌表达系统、糖多孢红霉菌突变体表达系统和无细胞体系,并对各种途径进行了评述.
关键词： 红霉素 糖多孢红霉菌 染色体重组 链霉菌表达系统 大肠埃希氏菌表达系统 -
金属离子对红霉素合成及组分转化的影响及机理分析
目的 研究Co2+、Zn2+和Na2MoO4 3种金属离子对糖多孢红霉菌发酵生产红霉素及组分转化的影响,并对其影响机理进行相关分析.方法 通过摇瓶实验确定金属离子优配比,并在15L发酵罐上放大;通过菌体在合成培养基中的摇瓶发酵研究红霉素合成途径中羟基化基因eryK、甲基化基因eryG的表达量与红霉素合成及组分转化的关系.结果 3种金属离子的添加使红霉素发酵单位由对照罐8433U/mL提高到11858U/mL,有效组分ErA由对照83.6％提高到89％;ery和eryG两种基因的表达量显著提高,且eryK/eryG比值与有效组分ErA含量具有较好的相关性.结论 3种金属离子能通过调节菌种相关基因的表达,对红霉素的合成及组分转化产生促进作用.
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以糖类利用能力变化选育红霉素高产菌株
目的 根据代谢网络理论,利用可能对红霉素产生菌Saccharopolyspora erythraea的代谢物流产生影响的糖类建立理性化的筛选模型.方法 建立葡萄糖、果糖、乳糖等抑制性筛选模型和麦芽糖、木糖等利用性筛选模型.将诱变处理后的菌株通过这些模型,找出利用率发生改变的菌株.结果 结果显示葡萄糖、麦芽糖模型的筛选效果较好,用此方法筛选出的菌株Er071610-1比原始出发菌株增产53.7%.结论 以糖类利用能力变化选育红霉素高产菌株是一条可行的筛选方法.
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产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G-突变体的构建
糖多孢红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3"-O-甲基转移酶(EryG),失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成,积累其中间产物红霉素C.以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版,用重叠PCR方法扩增出eryG基因两侧约1600bp DNA片段(△G),其中去除了EryG上S-腺苷甲硫氨酸结合区域对应的290bp DNA片段.将该片段克隆于质粒pWHM3,构建了同源重组质粒pWHMAG.PEG介导原生质体转化法将pWHM△G转入糖多孢红霉菌A226中,通过染色体同源重组突变染色体上eryG基因,利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多孢红霉菌A226G-突变体,此突变体主要积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A.通过eryG基因的功能补偿,糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+可以恢复红霉素A的合成能力.
关键词： 糖多孢红霉菌 红霉素 3"-O-甲基转移酶 同源重组 功能补偿 -
一种新的链霉菌表达载体启动子
eryA基因直接控制着红霉素母环6-脱氧-红霉内酯B的合成,在红霉素生物合成过程中具有重要作用.本文克隆了eryA基因的启动子PeryA,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,构建了大肠埃希菌-糖多孢红霉菌穿梭型质粒.PEG介导原生质体转化法将穿梭型质粒分别转入糖多孢红霉菌A226与变铅青链霉菌JT46,荧光显微镜检测发现,此启动子在两菌株中都具有功能.随后,以变铅青链霉菌JT46为宿主,对PeryA启动子区域进行了深入研究,结果发现该启动子的-35区并不是必需的,仅有-10区、长度为41bp的该启动子在链霉菌中仍具有功能.定点突变证明-10区对于该启动子是必不可少的.因此,41bp的该启动子片段可作为链霉菌的有效启动子,这是迄今为止所发现的短的启动子之一,可用于构建新的链霉菌表达载体.
