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β人绒毛膜促性腺激素在毕赤酵母中的表达及鉴定
目的在毕赤酵母表达系统中获得β人绒毛膜促性腺激素(hCG)高效分泌表达,并鉴定其抗原活性.方法将β hCG基因亚克隆入pPIC9K表达载体,线性化后转化GS115酵母细胞,经G418抗性筛选获多拷贝重组子并诱导表达.表达产物采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot、酶链免疫吸附试验(ELISA)鉴定. 结果经甲醇诱导,酵母细胞表达出β hCG,此蛋白在SDS-PAGE电泳上显示为一条分子量为32×103阳性条带,在Western blot试验中能被β hCG多抗识别,在竞争抑制性ELISA中能抑制β hCG单抗与hCG全分子的结合.结论β hCG在毕赤酵母中得到高效表达,并形成正确的蛋白结构.
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反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒
目的 构建基于通用真核表达载体的人神经病靶标酯酶双链RNA的稳定表达载体.方法 在正义和反义引物两端分别加上EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别位点扩增得到神经病靶标酯酶活力域序列,构建含有目标基因的倒置重复序列的双链RNA表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,酶切分析鉴定重组载体.脂质体法转染到Hela细胞中瞬时表达重组载体,酶活力测定其对细胞内神经病靶标酯酶活力的影响.结果 成功构建了NTE双链RNA稳定表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,表达该载体细胞内NTE活力明显下降至对照细胞的20%左右.结论 采用反向重复序列法将靶标基因的编码序列正反向插入到通用真核细胞表达载体中,是构建哺乳细胞基因双链RNA稳定表达载体的有效方法.
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家蚕制品的急性毒性及微核试验
我国的养蚕业已有5 000多年历史.家蚕一直被认为是对人类有益无害的重要经济昆虫.随现代科学技术的发展,通过基因操作,已将家蚕核型多角体病毒作为新型表达载体,用其宿主家蚕用为生物反应器生产重要的医药产品.验证这个表达环境对人体的安全性及对系统的推广应用具有重要的意义.为此,我们参照了国家药物评价指南,对家蚕幼虫和蛹的体液、蚕卵的急性毒性试验,致突变性进行评价,为该系统的环境和人体危险度评估,也为家蚕的综合利用提供参考依据.
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麻疯树核糖体失活蛋白curcin在大肠杆菌中高效表达条件的研究
目的:编码麻疯树毒蛋白(curcin)成熟蛋白的基因原核表达载体的构建及其高效表达条件的研究.方法:根据GenBank上麻疯树的cDNA序列设计引物,用PCR方法从麻疯树基因组中扩增得到编码麻疯树毒蛋白成熟蛋白的基因;将其导入原核表达载体pQE-30,pET-32中,并将其转入大肠杆菌获得重组菌株.在不同诱导剂、不同温度、不同诱导时间等条件下诱导其产生重组蛋白并进行检测比较.结果:用PCR方法从麻疯树基因组中扩增得到编码麻疯树毒蛋白成熟蛋白的基因,成功构建了原核表达载体pQE-R,pET-R,并获得重组菌株PRM,PRB.在不同诱导剂、不同温度、不同诱导时间等条件诱导下,PRB均无重组蛋白产生,而PRM却能以包涵体的形式表达curcin.结论:重组菌PRM在诱导6 h,28℃,IPTG 0.5 mmol·L~(-1)时表达curcin蛋白的效率高.
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利用红花瞬时表达aFGF-GFP融合基因的研究
目的:利用红花表达aFGF可以使aFGF的组织创伤修复的活性和红花的活血通经、散瘀止痛以及跌打损伤等功效累加,直接用于外伤修复.方法:利用分子生物学方法构建aFGF与GFP的融合基因载体,通过农杆菌介导法将其转化到红花中,形成抗性红花愈伤组织后,利用荧光显微镜进行检测.结果:通过PCR分别扩增了aFGF和GFP基因片段,确定出PCR反应体系和佳反应条件,合成了融合基因片段aFGF-CFP,成功构建了植物荧光表达载体pCAMB认1390::35S::aFGF-GFP,用其转化红花,获得的抗性愈伤组织在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光.结论:抗性红花愈伤组织中的GFP表达效果良好,初步判断aFCF基因在植物细胞中也已经表达.
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乙型脑炎减毒活疫苗株全长感染性克隆的构建及表达外源基因的初步研究
通过构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的全长cDNA克隆,来初步探讨将其作为表达载体的可行性,为下一步利用乙型脑炎病毒作为载体构建嵌合病毒打下基础.利用长片段RT-PCR的方法分两段扩增出乙型脑炎病毒cDNA,通过片段两端的酶切位点,将cDNA依次连接到pACYC184载体.进一步利用分子克隆的手段,在乙型脑炎病毒基因组cDNA的3 '非编码区插入增强型绿色荧光蛋白(Ehanced green fluorescent portein,EGFP)基因作为报告基因,通过体外转录和转染,拯救乙型脑炎病毒和表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎嵌合病毒.采用RT-PCR、蚀斑实验和荧光显微镜观察等方法对恢复病毒进行鉴定.对恢复病毒进行连续6次细胞传代,从病毒生长特性和结构基因稳定性的角度对恢复病毒传代稳定性进行研究.结果表明成功地扩增并构建得到乙型脑炎病毒的全长cDNA,在此基础上进一步构建得到了乙型脑炎嵌合病毒rJEV-EGFP全长cDNA,经过体外转录和转染获得了活的rJEV病毒及嵌合病毒rJEV-EGFP,并采用了多种方法对其进行了鉴定,拯救出的恢复病毒在已传代的代次内稳定性良好,嵌合病毒rJEV-EGFP可稳定地表达绿色荧光蛋白.本研究应用反向遗传学技术构建并在BHK-21细胞中成功地拯救出了rJEV和rJEV-EGFP活病毒,同时也表明乙型脑炎病毒SA14-14-2株可以作为载体来表达外源基因.
关键词： 乙型脑炎病毒 反向遗传学 全长cDNA感染性克隆 表达载体 增强型绿色荧光蛋白 -
家蚕核型多角体病毒的基因组结构及其表达模式
Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV)是家蚕(Bombyx mori)的重要病原,属于杆状病毒.20世纪80年代后期发展了基于杆状病毒作为载体的昆虫杆状病毒表达系统技术.由于家蚕可以规模化饲养,利用重组的BmNPV以家蚕作为"生物工厂"生产重组蛋白因具有低成本、适合产业化的优点而受到高度重视.BmNPV的分子生物学研究以及作为表达载体的应用在过去十几年间得到了较快发展,本文主要就近年来关于BmNPV的基因组结构及其基因表达模式的研究作一概述.
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番茄丛矮病毒p19蛋白抑制转录后基因沉默作用机制
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是真核生物体内由双链RNA(double-stranded RNA)介导的同源RNA降解现象.在细胞内,长的dsRNA被Dicer酶切割成21～26核苷酸(nucleotide,nt)的小干扰RNA(small interfering RNA或short interfering RNA,siRNA);siRNA与多种蛋白结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),同时解链;有活性的RISC可在siRNA的指引下与互补的转录物结合,并导致RNA的降解,这种转录后水平基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)也称RNA沉默(RNA silencing)[1,2].人为地向细胞内导入dsRNA、siRNA,或者是它们的表达载体都可以诱发RNAi,有效地中止同源基因表达.这就为建立基因与表型之间的关系提供了可靠的手段.目前,RNAi技术正因其简捷高效性而广泛应用于功能基因组研究、疾病治疗研究,以及植物抗病毒研究等.
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EGFP-线粒体蛋白导入载体的构建及功能验证
目的 构建能够将外源蛋白导入真核细胞线粒体的真核表达载体,并且通过增强型绿色荧光蛋白的表达进行示踪.方法 利用多重PCR扩增法将线粒体导肽序列与EGFP序列融合在一起,并插入真核表达载体pcDNA3.1,构建成真核表达载体pcDNA5.1-EGFP.将P53基因分别插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1构建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53载体.经酶切和测序验证后在脂质体介导下分别将上述载体转染293T细胞,一方面在荧光显微镜下比较绿色荧光蛋白与细胞色素C在细胞内的分布情况,另一方面通过免疫荧光法比较P53蛋白在细胞内的定位.结果 绿色荧光的表达分布与细胞色素C具有一致性,且转染pcDNA5.1-P53载体的细胞内P53蛋白集中在胞质线粒体中,而转染pcDNA3.1-P53载体的细胞内P53蛋白主要分布在细胞核内.结论 成功构建能够将外源蛋白导入线粒体的真核表达载体.
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shRNA表达载体的改建及鉴定
目的 通过改建pSilencer3.1-H1载体快速有效筛选重组shRNA表达载体,并可使线性化载体环化,长期保存.方法 制备含有单一限制性内切酶Not Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段,与BamH Ⅰ和HindⅢ酶切线性化的shRNA表达载体pSilencer3.1-H1连接,构建载体pSilencer3.1-Ha/Not Ⅰ,再用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pSilencer3.1-H1/Not Ⅰ,将含靶向目的 基因JAK2 siRNA表达框的DNA模板与其连接,构建pSilencer3.1-H1/JAK2的shRNA表达载体,提取质粒DNA,用Not Ⅰ进行单酶切,快速选择阳性克隆,选取不能被Not Ⅰ切开的质粒进行测序鉴定.随后将pSilencer3.1-H1/JAK2转染胃癌细胞系,用Western blot检测JAK2蛋白的表达.结果 通过测序证实pSilencer3.1-H1/Not Ⅰ和含JAK2 siRNA表达框的表达载体成功构建,将其转染胃癌细胞系AGS后,抑制了JAK2蛋白的表达.结论 通过对 pSilencer3.1-H1表达载体的改建可以快速有效地筛选shRNA表达载体.
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二型谷氨酸羧肽酶稳定表达细胞株的建立
为了深入研究二型谷氨酸羧肽酶(glutamate carboxypeptidase Ⅱ,GCP Ⅱ)功能和了解其在兴奋性氨基酸代谢过程中作用,拟构建GCP Ⅱ的表达载体,建立稳定表达细胞株; 采用聚合酶链反应,酶切连接,和蓝白筛选的方法,构建表达载体;磷酸钙共沉淀的方法转染HEK293细胞,G418筛选阳性细胞克隆;逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色的方法鉴定阳性细胞株.采用PCR方法扩增出GCP Ⅱ;构建含有GCP Ⅱ基因的表达载体--pcDNA3.1-NA;建立了细胞株 HEK 293-NA.成功构建了GCP Ⅱ的表达载体,建立了稳定表达细胞株,为深入研究该酶的功能和兴奋性氨基酸毒性作用奠定了基础.
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RHD基因不同转录子表达载体的构建
RHD基因存在多种不同的另路剪接的转录子,本研究分别构建正常mRNA及DEL9和DEL89转录子的表达载体.从Rh(D)阳性新生儿脐血网织红细胞中提取总RNA,分别采用一步法和两步法RT-PCR获取完整目的转录子片段,然后分别克隆至pCR4 TOPO测序载体并测序验证和筛选.用正常RHD cDNA筛选质粒为模板,PCR扩增全长目的基因,然后亚克隆至pcDNA3.1/VS-His TOPO表达载体；DEL9和DEL89转录子直接克隆至表达载体,通过测序验证目的基因序列及插入方向.结果表明,序列分析证实了不同目的基因片段序列和方向正确,表明3种不同RHD转录子的表达载体构建成功.结论:RHD不同转录子表达载体已成功构建,为进一步研究Rh(D)抗原膜表达机理奠定了基础.
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痘苗病毒增强子样序列的筛选及应用研究
目的 从痘苗病毒基因组中筛选原核增强子样序列,构建携带原核增强子样序列的表达载体,探讨其对干扰素基因表达的影响.方法 采用氯霉素乙酰转移酶基因(cat)作为报告基因,从痘苗病毒基因组中筛选具有原核增强子样活性的序列,构建携带增强子样序列VV1的表达载体,表达干扰素基因和检测干扰素活性.结果 从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选出18个在大肠埃希菌中具有增强活性的序列,从中筛选到两个原核增强子样序列VV1和VV16,VV1正反向分别可使lacZ基因活性提高10.9倍和3.8倍,VV16正反向分别可使lacZ基因活性提高9.0倍和4.1倍;证实它们的增强活性体现在转录水平;用痘苗病毒增强子样序列VV1构建的表达载体,其表达的IFN-α2b型干扰素比原表达载体活性高2.6倍.结论 从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选到2个原核增强子样序列-携带有痘苗病毒增强子样序列的表达载体可提高干扰素基因的表达水平.
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内源性TNF-α对HBV转染细胞HLAⅠ表达的诱导作用
HLAⅠ分子组成性表达于各种有核细胞表面,细胞因子可通过旁分泌或自分泌效应诱导其表达增强.Zhou等[1]实验表明HBV能增强HepG2细胞的HLAⅠ表面表达,排除细胞内IFN-β的产生和介导作用.为进一步研究其它内源性细胞因子的介导作用,我们构建HBV基因组野生株(WT)及核壳蛋白变异株L97稳定表达载体,探讨TNF-α对HBV转染细胞HLAⅠ表达的调节作用.
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猫过敏原Fel d1基因的克隆、表达及特性鉴定
猫过敏原是引起过敏性疾病(如哮喘、过敏性鼻炎)的常见吸入性过敏原之一,Fel d1是猫的主要过敏原之一.为此,我们对Fel d1Ⅰ链和Ⅱ链进行克隆,构建Fel d1Ⅱ链+Ⅰ链pET表达载体,表达重组蛋白并分析其免疫学特性.
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乙肝病毒核心启动子部分缺失对其活性及X蛋白转式激活作用的影响
目的研究乙型肝炎病毒(HBV)20/21bp缺失(nt1 748/1 747～nt 1 767)的核心启动子(CP)的活性及CP部分缺失对X蛋白转式激活作用的影响. 方法将HBV CP nt 1 601～1 860区段克隆到氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因表达载体(pCAT3-Basic)上,构建重组pCAT3质粒(20d-pCAT3、21d-pCAT3、wt-pCAT3)转染HepG2细胞以检测CP活性.将wt-pCAT3与野毒株型或CP 20/21bp部分缺失的含1.2拷贝HBV全基因重组质粒(P3.8Ⅰ、20d-P3.8Ⅰ、21d-P3.8Ⅰ)共转染HepG2细胞以检测X蛋白的转式激活作用.ELISA方法检测CAT表达量. 结果 PCR扩增和双酶切初步筛选的克隆株,经测序终鉴定重组质粒克隆成功.重组pCAT3质粒转染HepG2细胞表明,CP缺失的重组表达载体(20d-pCAT3、21d-pCAT3)较野毒株型CP的重组表达载体(wt-pCAT3)产生的CAT量明显下降,均仅为后者的14.2%;共转染试验表明,wt-pCAT3 可被P3.8Ⅰ产生的完整X蛋白转式激活,而分别不能或仅能较弱地被共转染的20d-P3.8Ⅰ、21d-P3.8Ⅰ产生的截短的X蛋白所改变. 结论 HBV 20/21bp缺失的CP活性较野毒株型CP活性显著下降;CP20/21bp缺失株的X蛋白难以发挥转式激活作用.
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HCV IRES介导荧光素酶小鼠体内表达模型的建立
HCV内部核糖体起始位点 (internal ribosomal entry site, IRES)含有40S核糖体的有效结合部位和与内部翻译起始因子eIF-3的结合部位,以内部起始方式调控介导HCV蛋白的翻译启动,在翻译调控中具有重要作用[1],是反义寡核苷酸、核酶和siRNA等药物治疗的重要靶位.王小红等[2]曾构建了CMV启动子启动转录的HCV IRES调控荧光素酶表达载体pHCV-neo4,建立了转基因细胞模型.获得了在细胞水平上对HCV有明显抑制作用的反义寡核苷酸.而在动物水平上的评价却无合适的模型.我们进一步采用水动力转染法将pHCV-neo4表达载体转染到小鼠体内,在小鼠肝脏检测到荧光素酶的高水平表达,可作为体内瞬时评价以HCV IRES为靶位的抗HCV药物活性的小鼠模型.
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基因免疫中 HBV preS对HCV E2蛋白免疫原性的调控
在丙型肝炎病毒的自然感染过程中,机体无足够的中和抗体来清除循环中的HCV,但只有高滴度的抗包膜蛋白抗体才能完全保护猩猩免受HCV的感染[1].在preS-S疫苗中,preS能显著增加S抗体的产生,使单独接种S抗原无反应的小鼠产生显著的抗HBs反应[2].为研究HBV preS能否增加HCV E2蛋白的免疫原性,我们构建了preS与E2融合蛋白的表达载体,通过基因免疫方法,研究了融合蛋白中preS蛋白对HCV E2蛋白的免疫调节作用.
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乙型肝炎表面抗原颗粒在毕赤酵母中的表达
毕赤酵母表达系统是一个高效异源蛋白表达工具,表达载体直接整合到酵母基因组上,可以产生遗传稳定的重组子,有类似于哺乳动物翻译后加工修饰的功能,可在成本低廉的无机盐培养基中进行高密度培养生产重组蛋白[1,2].为提高重组菌株表达的稳定性,本研究选用毕赤酵母表达系统,成功地表达了22 nm HBsAg颗粒,为在毕赤酵母中开发生产乙肝疫苗提供了资料.
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反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用
目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用.方法构建pVAXI-as-DcR3反义表达载体,转染肝癌细胞,Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低,流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化.结果 Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达,同时转染了pVAXI-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多.结论 DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多.
