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人乳头瘤病毒6b型E7基因的克隆和表达
目的克隆人乳头瘤病毒6b型E7(human papillomavirus 6b E7)基因,构建原核表达载体,并进行蛋白表达和纯化.方法将HPV 6bE7基因经PCR扩增和亚克隆,与GST原核表达载体pGEX-4T-2重组,转化E.coli P2392菌表达蛋白,经Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化GST-HPV 6b E7融合蛋白.结果限制性酶切和DNA测序表明,HPV 6b E7 DNA正确克隆于pGEX-4T-2多克隆位点.经IPTG诱导表达的GST-HPV 6b E7融合蛋白主要存在于可溶性上清.经亲和层析,每升诱导菌回收8.4 mg融合蛋白,10%SDS-PAGE分析融合蛋白表观分子量约37 kDa.结论成功构建了HPV6bE7基因原核表达载体,并大量表达和纯化了GST-HPV 6bE7融合蛋白.
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mcpr1基因的真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建腭裂相关基因mcpr1与pcDNA3.1/V5-His B融合的高效真核表达载体,为研究mcpr1基因的功能奠定基础.方法:根据mcpr1基因的核苷酸序列,设计并合成引物,通过PCR方法,从包含有mcpr1基因全长的克隆载体T-easy/ mcpr1中,扩增出该基因外显子片段,将扩增产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His B中.对该重组体进行PCR和酶切鉴定,以及测序验证.结果:以重组体为模板扩增出400 bp左右的特异性基因片段,与mcpr1基因片段大小一致,酶切鉴定也显示有400 bp左右的基因片断.测序结果显示与已知基因序列一致.结论:成功构建mcpr1基因的真核表达载体,为下一步研究mcpr1基因的功能奠定了基础.
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hOP-1成熟肽基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的:构建hOP-1成熟肽基因表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,为研究OP-1的功能作用以及制备OP-1抗体奠定基础.方法:构建hOP-1/pEH4表达载体,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达OP-1,SDS-PAGE对表达产物进行检测,凝胶薄层扫描判定蛋白表达量.结果:pEH4/OP-1重组表达载体转化DH5α,经温度诱导后,SDS-PAGE 显示Mr约为14×103的新蛋白条带.薄层扫描测定,表达蛋白占菌体总蛋白量的33%.结论:构建的hOP-1/pEH4表达载体,在大肠杆菌DH5α中获得OP-1成功表达.
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人H-Ras12V突变蛋白表达载体的构建及表达
目的:构建研究H-Ras12V突变蛋白的表达载体,并在体外进行表达和榆测.方法:从细胞中分离提取RNA,通过RT-PCR扩增获得人的正常H-Ras cDNA,测序鉴定.通过PCR介导的定向突变的方法,在其第12位氨基酸处引入一个错义突变G→V,连入测序载体进行鉴定.应用DNA重组技术,将获得的H-Ras12V cDNA插人真核表达载体pEGFPc2,使用限制性酶切反应鉴定.通过脂质体将重组质粒转染入Hela细胞,使用Western Blot对其融合蛋白进行检测.结果:经过Xho I和BamH I的双酶切以及测序鉴定证实成功构建了 pEGFP-H-Ras12V融合蛋白表达载体,克隆基因与GenBank登陆结果一致并成功实现其第12位氨基酸G→v的突变.Western Blot 证实融合蛋白特异性表达,并在转染的细胞系中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:成功构建了pEGFP-H-Ras12V融合蛋白的表达载体,并在体外鉴定EGFP-HRasl2V融合蛋白的表达.
关键词： H-Ras12V克隆 表达载体 融合蛋白 -
PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响
目的:构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响. 方法:设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡. 结果:成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体. 它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率高,可达93.99%. HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P＜0.05),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率高,为66.91%. 结论:靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.
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hTERT siRNA表达载体的构建及对转染的HeLa细胞生长抑制作用
目的:通过RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨干涉后对肿瘤细胞生长的抑制作用. 方法:根据人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA编码序列,设计RNA干涉靶点,构建siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并转染HeLa细胞,通过RT-PCR法观察重组质粒转染肿瘤细胞后端粒酶mRNA、蛋白含量及细胞生长情况. 结果:构建的siRNA表达载体可以使HeLa细胞端粒酶逆转录酶mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度减慢. 结论:成功构建了针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中端粒酶的表达,并引起细胞生长抑制.
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人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定
目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0+6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0+2.5+3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.
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人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达
目的:克隆人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因并构建其重组腺病毒,观察其在兔BMSc中的表达. 方法:用RT-PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序;将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAdTrack-CMV-BMP-7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定,PacI酶切线性化后转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,将AdBMP-7体外感染兔BMSc后,以RT-PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP-7基因的表达. 结果:用RT-PCR方法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因;酶切鉴定表明BMP-7基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功;经293细胞包装3 d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP),氯化铯梯度离心法终获得约3×109 efu/L滴度的重组病毒;体外感染兔BMSc后RT-PCR方法及荧光显微镜证实BMP-7基因可在兔BMSc中表达. 结论:成功克隆人BMP-7基因并构建其重组腺病毒,证实了其在BMSc的表达,为骨再生的局部基因治疗打下基础.
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人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达
目的: 构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白. 方法: 采用反转录-聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2 cDNA中,分别扩增出Heparanase编码基因,用限制性内切酶BamHI消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定与测序证实后,连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体. 以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白. 结果: 构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实, 与GenBank登录结果完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pcDNA3.1及pRSET;SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功. 结论: 成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体,成功正确表达了6His/Heparanase融合蛋白.
关键词： 表达载体 Heparanase基因 融合蛋白 -
p53重组腺病毒载体的构建
目的构建p53重组腺病毒载体以研究p53过度表达与腺病毒感染对细胞生长的影响.方法将p53 cDNA克隆到转移载体pAdCMV/p53重组质粒, 用该重组质粒及pJM17质粒共转染293细胞获得重组腺病毒,PCR法筛选含p53 cDNA的重组病毒.结果在挑选的5个空斑中,有4个含p53 cDNA阳性重组腺病毒.p53重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效的复制.结论成功构建了p53重组腺病毒, 为进一步研究p53重组腺病毒的功能提供了条件.
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肝癌细胞内逆转录病毒介导β-葡萄糖醛酸苷酶基因的表达
目的建立高表达β-葡萄糖醛酸苷酶(β-Glu)的肝癌细胞株.方法采用脂质体介导法,将重组逆转录病毒表达载体pDOR-βG转染肝癌细胞,G418筛选出阳性克隆,用免疫组化法、酶组织化学法、原位杂交法及酶活性测定等方法观察β-Glu表达情况.结果共获得4株转染阳性克隆,其中F1,H4为β-Glu高表达克隆.免疫组化法发现转染细胞β-Glu免疫阳性物质主要分布于胞质及胞核内,酶组织化学法观察转染细胞酶活性产物主要集中于胞质中,且转染细胞较非转染细胞呈色深.原位杂交法观察阳性杂交信号于胞质及胞核,甚至核仁中, 且在转染细胞中杂交信号增强.结论通过转入人β-Glu基因可以建立β -Glu肝癌高表达模型 .该模型的建立,既可用于观察β-Glu前体药物的基因治疗效果,也能观察β-Glu基因表达对肝癌细胞表型和侵袭能力的影响.
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pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达
目的: 构建pEGFP-HPV16E6/E7表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时表达. 方法: 基因重组技术,基因转染技术. 结果: 酶切鉴定证实HPV16E6/E7片段已克隆到pEGFP-N3的EcoR I和BamH I位点之间,在转染角朊细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达. 结论: pEGFP-HPV16E6/E7表达载体便于观察, 转染细胞中HPV16E6/E7-GFP融合蛋白的表达情况及蛋白定位,适用于对HPV16E6/E7分子生物学特性及致瘤机理的研究.
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人BMP II型受体胞外区cDNA细菌表面呈现载体的构建
0 引言骨形成蛋白(BMP)受体有I型和II型两种,属于TGF-β受体超家族成员,都具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性. 人BMP II型受体cDNA全长3871 bp,编码1039个氨基酸的蛋白,包括125个氨基酸的胞外区[1]. TGF-β超家族信号转导的一般模式为:配体先与II型受体结合再与I型受体形成复合物,通过受体激酶激活下游信号传导分子[2]. 我们用PCR方法扩增出hBMPR-II胞外区cDNA,测序正确后,成功将其定向克隆入细菌表面呈现载体pLβ2,为其表达及研究BMP结合活性等打下基础.
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mrp反义mRNA真核表达载体pcDNA-Amrp的构建
0 引言肿瘤多药耐药(MDR)是目前临床化疗的主要障碍和失败的根本原因,是亟待解决的问题之一[1]. MDR相关蛋白(MRP)是1992年Cole等[2]在耐阿霉素的小细胞肺癌细胞系H69AR中发现的一种新的肿瘤耐药相关分子,经研究证实,这种蛋白参与体内多种肿瘤耐药的发生,在某些肿瘤组织如胃癌,食管癌和乳腺癌等中呈强阳性表达. 为进一步探讨mrp在人类肿瘤MDR中发生的意义及反义mrp逆转耐药的可能性,我们构建了反义mrp真核表达载体,以了解用其转染耐药细胞后降低细胞MRP的表达对MDR功能的影响.
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GFP共表达检测重组型Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用
[贾林涛,于翠娟,许彦鸣,赵晶,高下,张淼丽,王成济,杨安钢. 细胞与分子免疫学杂志,2001;17(3):218-221]目的探讨由野生型人caspase-3大小亚基颠倒构建的重组型caspase-3的促细胞凋亡活性. 方法用RT-PCR法获得人caspase-3基因. 通过重组PCR进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列. 将上述基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染人HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构. 结果成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因. 构建了重组型caspase-3基因的表达载体. 转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡. 电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征. 结论重组型caspase-3可促进HeLa细胞的调亡.(井晓梅)
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重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达
目的:构建重组人血管抑素(hANG)的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法:利用RT-PCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段,将其克隆到pCR-Blunt II-TOPO载体和pcDNA3.1(+)表达载体,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1-hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC-7721对其表达状况进行检测. 结果:所获得的hANG片段(1.1 kb)序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1-hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1-hANG的人肝癌细胞SMMC-7721表达了血管抑素. 另外,从生长曲线结果来看,转染pcDNA3.1-hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC-7721和未转染的SSMC-7721细胞的生长速度无明显差别. 结论:成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC-7721肝癌细胞,为开展下一步的实验奠定了基础.
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牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因表达载体的构建
目的构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体.方法利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd,插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定.将目的基因片断插入原核表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b/rgpAcd,通过限制性酶切鉴定.结果PCR产物电泳结果显示,在大约1.5kb处有一特异的条带,与预期的大小一致,核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性,未发生任何突变;构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致,表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功.结论成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础.
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MicroRNA-338-3p真核表达载体的构建及其对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响
目的 构建microR-338-3p(miR-338-3p)过表达载体并探究其对人胃癌SGC-7901细胞系体外增殖的影响.方法 以pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体为基础,经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切和纯化后与人工合成miR-338-3p的寡聚核苷酸进行连接,转化至E.Coli Top10后,经过DNA测序、BLAST检测及验证;将构建成功的载体瞬时转染入SGC-7901细胞系中,应用Real-time PCR检测miR-338-3p的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖的改变.结果 测序验证成功构建了miR-338-3p的真核表达载体;瞬时转染SGC-7901细胞后miR-338-3p表达水平有显著增加,能够抑制SGC-7901细胞的体外增殖.结论 成功构建了miR-338-3p的真核表达载体,获得了瞬时表达miR-338-3p的人胃癌SGC-7901细胞系,初步证实miR-338-3p过表达可抑制肿瘤细胞的增殖.
关键词： miR-338-3p 胃癌 表达载体 细胞增殖 -
大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定
目的 建立大鼠肝脏干细胞的Pdx-1基因表达系.方法 逆行穿刺SD大鼠乳鼠肝脏门静脉,经胶原酶Ⅳ消化并分离肝脏干细胞;免疫组织化学鉴定大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达;构建pEGFP-Pdx-1表达载体并酶切鉴定,用脂质体2000介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后,荧光显微镜观察GFP表达,免疫组织化学鉴定Pdx-1的表达.结果 肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性;pEGFP-Pdx-1表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和Pdx-1蛋白.结论 成功建立了大鼠肝脏干细胞Pdx-1表达系.
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针对livin的siRNA表达载体的构建
目的 设计能够有效抑制livin基因表达的小干扰RNA,构建针对livin基因的siRNA重组表达载体.方法 通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的一组寡核苷酸片段,克隆到 pSilencerTM3.1-H1 hygro载体,并经BamH Ⅰ /EcoR Ⅰ双酶切及测序鉴定证实,livin的siRNA序列成功地克隆到表达载体中.结果 经BamH Ⅰ /EcoR Ⅰ双酶切及测序鉴定证实,人livin的siRNA序列成功地克隆到表达载体pSilencerTM3.1-H1 hygro中,构建了表达载体,测序分析证实插入序列正确.结论 成功构建了livin表达载体,为后续研究奠定基础.
