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猪Cathelicidin PMAP37基因表达载体的构建
目的构建猪Cathelicidin PMAP37基因表达载体.方法 RT-PCR方法扩增带有双酶切位点的PMAP37基因,将该基因定向插入带有相同酶切位点的融合表达质粒PinPointTMXa-3的多克隆位点构建表达载体.结果构建的表达载体经双酶切电泳分析及插入基因片断序列分析,表明PMAP37基因表达载体构建成功.结论 PMAP37基因表达载体的构建为进一步获得该基因的表达产物,研究其抗菌活性、抗菌机理打下基础.
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HEV ORF3 cDNA 序列分析及在 HepG2细胞的表达
目的：对构建的 HEV新疆株ORF3真核表达载体pcHEV3进行DNA序列分析，并转染 HepG2细胞进行表达，为进一步探索ORF3蛋白功能提供基础。方法对 HEV ORF3真核表达载体pcHEV3进行DNA测序，分析ORF3蛋白一级结构，脂质体介导法转染 HepG2细胞，用免疫荧光法鉴定ORF3蛋白的表达及细胞内定位。结果 HEV新疆株ORF3蛋白具有保守的PPLP基序，转染 HepG2细胞后经免疫荧光鉴定能在细胞内表达。结论构建出HEV ORF3蛋白真核表达重组载体，并能在HepG2细胞表达，为进一步研究HEV ORF3蛋白的功能提供了实验基础。
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小鼠HuR真核表达载体构建及对Lewis肺癌细胞增殖和侵袭的影响
目的 构建小鼠同源的人抗原R (HuR)基因真核表达载体,观察HuR过表达对Lewis肺癌(LLC)细胞增殖和侵袭的影响.方法 从LLC细胞中抽提总RNA,RT-PCR扩增HuR cDNA,基因工程方法将PCR片断克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点.重组质粒经EcoRI和SmaI双酶切鉴定和测序后,使用LipofectamineTM2000转染LLC细胞.Western blotting检测HuR在细胞中的表达.MTT和Transwell系统分别检测细胞增殖和侵袭能力.结果 经酶切、测序鉴定,小鼠HuR基因正确插入到pEGFP-N1的多克隆位点,获得pEGFP-HuR;Western blotting显示转染组与未转染组比较,HuR蛋白表达、LLC细胞增殖能力和侵袭能力均显著增强.结论 HuR过表达可提高肿瘤细胞的增殖和侵袭能力.
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DNA疫苗的作用机制及影响因素
DNA疫苗(DNA vaccine)是1990年从基因治疗(genetic thera-py)研究领域发展起来的一种全新疫苗,也称核酸疫苗(nucleicacid vaccine).DNA疫苗是把含有编码某种抗原蛋白的外源基因克隆到真核质粒表达载体上.
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人α防御素6毕赤酵母表达载体的构建
[目的]构建人α防御素6(HD-6)酵母表达载体,为研究和解析人α防御素6的功能准备了条件.[方法]采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,将产物分离纯化后经EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,并将其插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,以得到重组的酵母表达载体pPICZαA/HD-6,后进行琼脂糖电泳和酶切鉴定.[结果]从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和酶切结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内.[结论]成功地构建了人α防御素6基因的酵母表达载体pPICZαA/HD-6.
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人防御素-5基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定
[目的]构建人防御素5(HD-5)基因的毕赤酵母表达载体并加以鉴定. [方法]采用PCR技术从人cDNA文库中扩增HD-5基因片段,将HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA用EcoR I和Xba I双酶切后连接构成重组质粒,然后转化到E.coli T0p10中,筛选阳性克隆,并进行PCR、酶切和序列鉴定. [结果]重组质粒经酶切获得HD-5基因片段大小正确,经序列测定证实HD-5基因正确插入pPICZαA中. [结论]成功构建人防御素5基因的毕赤酵母表达载体.
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人轮状病毒结构蛋白VP7基因毕赤酵母表达质粒的构建
[目的]构建人轮状病毒结构蛋白VP7基因重组酵母表达质粒VP7-pPICZαA. [方法]从VP7-pET32a质粒中PCR扩增轮状病毒VP7基因,EcoR I、Xba,I双酶切VP7基因产物和酵母表达载体pPICZαA,T4 DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,转化到大肠杆菌Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和测序鉴定. [结果]阳性克隆菌经酶切和PCR和测序鉴定,结果与预期相符,目的基因正确插入pPICZαA中. [结论]成功构建轮状病毒结构蛋白VP7基因重组酵母表达质粒VP7-pPICZαA,为轮状病毒结构蛋白VP7基因的酵母表达奠定了重要的实验基础.
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HCV NS3解旋酶基因原核表达载体pGEX-4T-1的构建
[目的]构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3解旋酶基因原核表达载体,为进一步研究和解析NS3的解旋酶基因对病毒复制的机制准备条件.[方法]将含有NS3基因的pMD-24/HCV NS3质粒转化感受态菌DH-5α并扩增;提取pMD-24/HCV NS3质粒;从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出NS3解旋酶基因;并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与表达载体pGEX-4T-1重组,以得到重组的原核表达载体pGEX-4T-1/NS3解旋酶.[结果]从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出的NS3解旋酶基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列:电泳结果证明已将此片段克隆到pGEX-4T-1内.[结论]成功地构建了HCV NS3解旋酶基因的原核表达载体DGEX-4T-1/NS3解旋酶.
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抗腮腺炎病毒抗体轻链基因的克隆及重组表达载体的构建
目的:构建抗腮腺炎病毒抗体轻链基因重组表达载体.方法:从腮腺炎患者和腮腺炎抗体IgG阳性正常人群的淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA.用相应的引物进行PCR,扩增出轻链κ和λ基因,经Sac I和Xba I双酶切后,分别和噬粒载体pCornb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-blue菌株,将轻链基因克隆入载体pComb3.结果:从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约110μg,经逆转录、PCR,分别扩增出约700bp大小的κ和λ基因.PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接,在2.5kv,200Ω,25μF的条件下电转化,转化率为:4.14×107,随机挑取10个菌落进行PCR鉴定,共有6个克隆扩增出κ基因,1个克隆扩增出λ基因,轻链重组率为70%.结论:获得的抗体轻链基因重组表达载体是高效、实用的,为下一步构建抗体Fab段基因重组载体打下了良好的基础.
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乳球菌基因表达载体系统的研究
当今以肠道微生态制剂为代表的益生菌制品,主要选用以下三类细菌:若干兼性厌氧球菌:如肠球菌属(Enterococ-cus)中的粪肠球菌为屎肠球菌(E. faecium,旧称"乳链球菌")等;乳球菌属(Lactococcus)中的乳酸乳菌乳亚种(L.lactis subsp lactis,旧称"乳链球菌")和乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp cremoris,旧称"酷链球菌")等;以及链球菌属(Streptococcus)中的唾液链球菌嗜热亚种(S.salivariussubsp themophilus,旧称"嗜热链球菌")和中间链球菌(S.salivarius subsp themophilus,旧称"酷链球菌"等;以及链球菌属(Streptococcus)中的唾液链球菌嗜热亚种(S. salivarius subsp themophilus,旧称"嗜热链球菌")和中间链球菌(S.intermedius)等.
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TRAF1-DsRed真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的定位
目的 构建融合蛋白TRAF1-DsRed的真核表达载体及观察TRAF1在COS-7细胞中的表达及定位.方法采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增TRAF1cDNA,定向克隆至真核表达载体pDsRed C1,经脂质体转染COS-7细胞并以间接免疫荧光检测其在COS-7中表达.运用罗丹明123染色和激光共聚焦技术观察TRAF-1在COS-7细胞中的定位.结果转染重组子pTRAF1-DsRed的COS-7细胞可见红色荧光蛋白的表达,TRAF1在COS-7细胞中定位于线粒体.结论 成功构建pTRAF1-DsRed融合基因并进行真核表达,确定TRAF-1在COS-7细胞中的定位,为进一步研究有关TRAF1的信号传导通路奠定了基础.
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RNA干扰体外抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究
目的 针对乙型肝炎病毒(HBV)prec/c区构建shRNA表达载体,观察shRNA表达载体对HBV抗原表达的抑制作用,为运用RNA干扰(RNAi)技术治疗乙型肝炎奠定基础.方法 运用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切,测序鉴定确认后,与1.5倍HBV真核表达质粒pHBV1.5共转染Hela细胞,并于转染后72 h,用微粒子酶免疫实验(MEIA)分别检测细胞上清液和细胞裂解液中HBsAg和HBeAg表达水平;用半定量PCR检测prec/c mRNA的转录情况;分析shRNA表达载体对HBe/HBs抗原表达的抑制情况.结果 成功构建了针对HBV prec/c区的shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6及无关shRNA表达载体psiC;筛选到对HBeAg有明显的抑制作用的psiHBV4载体,同时其对HBsAg的表达有促进作用;psiHBV5和psiHBV6对HBeAg的抑制作用相对较弱,其对HBsAg的表达也有不同程度的促进作用;无关干扰对照psiC对HBV两种抗原的表达均无显著抑制作用.结论 成功构建带U6启动子的shRNA表达载体并初步筛选到可显著抑制HBeAg表达的psiHBV4;本研究设计的3个靶向序列中,只有一个序列有大约70%的抑制率,而另外两个序列的抑制率相对较小,说明RNA干扰作用有较强的序列依赖性;无关干扰序列psiC几乎无干扰作用,说明siRNA产生的干扰作用具有高度的特异性.以上结果为应用RNAi治疗乙型肝炎奠定了一定的基础.
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肝癌靶向性超抗原表达载体的构建与鉴定
目的设计并构建受AFP基因顺式作用元件调控,并经减毒处理的肝癌特异性超抗原表达载体.方法用新设计的引物作PCR扩增截短的AFP基因启动子和增强子、linker-CD80tm和SEA(D227A).将上述片断与逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点连接,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原表达载体[pLXSN SEA(D227A)-Linker-CD80tm],并用软件对其开放读框进行分析.结果成功克隆了截短的AFP基因启动子、增强子、linker-CD80tm和SEA(D227A).将上述序列连接到逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点,酶切鉴定和DNA序列分析无误.结论 AFP基因转录启动元件修饰的SEA表达载体,在基因转录水平定量、定向、特异性调控强有力的细胞和体液免疫活化剂(SEA),为下一步将其作为基因疫苗治疗肝癌奠定了基础.
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RARE介导的视黄酸可调控的IFN-α表达载体的构建与鉴定
目的构建一个含视黄酸反应元件(RARE)的IFN-α表达载体,使其在真核细胞内的表达受视黄酸(RA)的诱导.方法运用DNA重组技术构建含有4个RARE重复序列的IFN-α真核表达载体(pRARE4-IFN-α),经酶切、PCR鉴定和测序确认后,用脂质体转染法使其转染HL-60细胞(人早幼粒白血病细胞系)、Bcap-37和MCF-7细胞(人乳腺癌细胞系),RA处理后,RT-PCR分析IFN-α mRNA水平,ELISA检测培养细胞上清中IFN-α含量.结果 pRARE4-IFN-α转染的HL-60、Bcap-37和MCF-7细胞,IFN-α分泌量为1 6～24 ng/(mL@106)细胞,而经RA处理24 h,IFN-α表达水平可增加8～13倍,但经RA处理24 h的细胞,换无RA的新鲜培养基继续培养24 h后,IFN-α表达水平又下降到25～34 ng/(mL@106)细胞.结论带有RARE的IFN-α表达载体转染细胞后,外源性IFN-α基因的表达受RA的诱导.
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一种高效表达和快速纯化重组人IL-10的原核载体系统
目的探讨一种在大肠杆菌中高效表达和简单纯化重组人白细胞介素10(IL-10)的方法.方法构建重组人IL-10表达载体pBAD/Thio-TOPOR-ILl0,它编码1个Mr34 700融合蛋白即硫氧还蛋白-IL10.含表达质粒pBAD/Thio-TOPOR-ILl0的工程菌经阿拉伯糖诱导、37℃培养,上述融合蛋白得到表达,表达产物经固化Ni2+树脂亲和层析纯化,用肠激酶从融合蛋白中切下靶蛋白IL-10.结果硫氧还蛋白-ILl0融合蛋白在大肠杆菌中的表达效率达50%,并且可从细菌粗提物中一步纯化融合蛋白.结论它为大批量用细菌表达真核蛋白及纯化提供了一种快速简便而又切实可行的方法.
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整合子及其研究进展
1989年Strokes和Hall首次提出整合子的概念.整合子被认为是一种天然的克隆和表达载体[1].整合子根据其含有的整合酶不同而进行分型,整合酶超家族包含了许多整合酶,它们都是用酪氨酸残基作为链交换反应的亲核攻击,有一些相似和保守的区域作为催化中心.
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重组体p5 TBF在大肠杆菌中表达产物的活性鉴定
目的:为了进一步深入了解BDNF的生物作用,开展基因工程以及应用基础的研究,需要大量的BDNF.因此构建原核表达重组体就显得非常重要.方法:从本室已构建的pGEMBF克隆中获取人BDNF全长编码片段与原核表达载体pGEX-5T连接,构成p5TBF重组体后,经转化大肠杆菌和IPTG诱导.结果:该重组体经蛋白质含量测定,免疫狭缝杂交和ELISA 测定,表明该菌体裂解液具有人BDNF抗原活性.结论:p5TBF重组体在大肠杆菌中表达成功.
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利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达
目的:构建含目的基因葛佬素(Gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(Rapid Translation System)对其进行表达.方法:采用PCR方法扩增gloverin cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物.将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500,使其蛋白能在大肠杆菌(E. coli)裂解产物中进行表达.
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抗菌蛋白葛栳纱在乳酸乳球菌中的表达研究
目的:观察人工设计的葛栳素的cDNA在乳酸乳球菌中的表达及其表达产物的抗菌作用.方法:采用统计学方法,统计同种族蛋白质Attacin A cDNA序列各种遗传密码子的出现频率 ,并以此为基础根据已知的葛栳素蛋白质序列设计其cDNA序列.采用PCR重叠延伸法合成葛栳素的cDNA序列,在测序完全正确后将葛栳素基因插入适合乳酸乳球菌MG1363表达的表达载体pNZ8048中,采用电穿孔法转化MG1363,转化的MG1363在电转化后涂布于恢复培养基SGM17 MC(含氯霉素)后放入厌氧培养箱中培养72小时后,挑单个菌落于SGM17培养液(无抗生素), 厌氧振荡培养72小时后收集细胞上清并进行杀菌活性的检测.结论:转化的MG1363细胞上清对大肠杆菌J5具有杀菌活性.结论:人工设计葛栳素的cDNA序列在乳酸乳球菌中得到表达,其表达产物具有抗菌作用.
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人抗菌肽FALL-39突变体FALL-39-Lys24'32的构建及其抗菌作用研究
目的:用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体pGEX-1βT-FALL-39-lys24'32,并比较研究FALL-39及其突变肽的功能.方法:采用一步法和两步法PCR定点突变技术,用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和第32位的天门冬氨酸,构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体;该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切和高效液相后获得高度纯化的FALL-39以及突变肽;用低有效浓度(MEC)、低抑菌浓度(MIC)、低杀菌浓度(MBC)指标比较纯化产物抗菌作用.结果:PCR定点突变得到突变体质粒pGEX-1βT-FALL-39-lys24'32;重组原核表达质粒pGEX-1βT-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达,经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39,和FALL-39-Lys24'32(约4Kd).突变蛋白对大肠杆菌ATCC 25922、耐氨苄青霉素菌ML-35p和绿脓杆菌的抗菌活性明显增强.结论:用PCR定点突变技术成功得到FALL-39基因突变体,大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白;突变蛋白的抗菌活性明显增强,提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性.
